鵝星狀病毒病原學(xué)研究進(jìn)展*

張紅，田秋豐，陳志峰，王志強(qiáng)，黃宇翔，鄒躍，馬志剛，霍明東，董佳強(qiáng)，苗艷，李鑫，楊昊天，呂明哲，楊坤，魏念冬，尹珺伊，王巖，王歡，劉秋瑾

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

1 病毒分類

星狀病毒（Astroviruses，AstV）為單股正鏈RNA 病毒，無囊膜結(jié)構(gòu)，屬于星狀病毒科成員[1]，由于AstV 感染宿主廣泛又有高度的遺傳多樣性，所以AstV 的分類很難有一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。2004 年，根據(jù)感染宿主不同，國際病毒分類委員會(huì)ICTV（http://www.iah-virus.org/astroviridae/）將AstV 分為禽星狀病毒屬（AAstVs）及哺乳動(dòng)物星狀病毒屬（MAstVs）。目前禽星狀病毒屬有AAstV-1、AAstV-2 和AstV-3 三 個(gè) 成 員，其 中AAstV-1 包括火雞星狀病毒1 型（TAstV-1），AAstV-2 包括禽肝炎病毒1 型（ANV-1）和禽肝炎病毒2 型（ANV-2），AAstV-3包括火雞星狀病毒2型（TAstV-2）和鴨源星狀病毒（DAstV）[2]。隨著病原的不斷進(jìn)化及病原診斷技術(shù)的不斷加強(qiáng)，越來越多的AstV相繼被發(fā)現(xiàn)，目前已在雞、火雞、鴨、鵝等禽類中檢測出星狀病毒，而且病毒宿主范圍有擴(kuò)大的趨勢。2010 年，ICTV 根據(jù)星狀病毒ORF2 的氨基酸序列及該蛋白遺傳進(jìn)化距離作為劃分依據(jù)，將鵝星狀病毒（GoAstV）歸屬于AAstV-3[3]。目前，我國現(xiàn)流行的GoAstV 分為兩個(gè)基因型組群，研究人員將其分為GoAstV-1 和GoAstV-2，其中GoAstV-1 是以AHDY 株和FLX 株等毒株為代表，GoAstV-2 是以HLJ01 株和AHAU5 株等毒株為代表。也有研究報(bào)道存在兩種基因型混合感染，給我國養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2 形態(tài)及理化特性

1975 年首次于腹瀉患兒的糞便樣品中發(fā)現(xiàn)，電鏡觀察病毒粒子大小約為27～30 nm，長度6.8 ～7.9 kb，呈對稱的二十面體結(jié)構(gòu)，因病毒粒子表面有5～6 個(gè)角呈現(xiàn)星狀結(jié)構(gòu)而被命名為星狀病毒。鵝星狀病毒在電鏡下觀察，其病毒粒子大小約為28 nm，呈球狀[4]。由于星狀病毒無囊膜結(jié)構(gòu)，在外界環(huán)境中適應(yīng)能力強(qiáng)且非常穩(wěn)定，在4 ℃及室溫環(huán)境中可以存活幾個(gè)月，50 ℃可抵抗1 h，6 ℃可抵抗5 min。若想保存該病毒活性可以置于-20 ℃環(huán)境中，若想長期保存可存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱中；但當(dāng)pH 值小于3 時(shí)才出現(xiàn)不穩(wěn)定。該病毒能抵抗包括酚類、多數(shù)醇類和季銨鹽在內(nèi)的大部分消毒液的滅活。研究表明，使用含有過硫酸鹽的消毒劑、90%甲醇、0.3%甲醛和3M 尿素處理星狀病毒，均能使病毒失活[5]。

3 病毒基因組及編碼的主要蛋白

鵝星狀病毒基因組全長為7.1～7.3 kb，病毒基因組由5'端非編碼區(qū)、3'端非編碼區(qū)、3 個(gè)開放閱讀框和1 個(gè)多聚腺苷酸尾巴組成[6]。3 個(gè)開放閱讀框分別是ORF1a、ORF1b 和ORF2。其中ORF1a、ORF1b 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1a 和nsp1ab，隨后被蛋白酶水解為RNA 聚合酶、病毒基因組連接蛋白、絲氨酸蛋白酶以及幾個(gè)功能未知的非結(jié)構(gòu)蛋白[7]。ORF2 則編碼病毒衣殼蛋白（Cap 蛋白），在基因組中該開放閱讀框具有較高的多樣性。病毒的核酸被衣殼蛋白包裹，衣殼蛋白與宿主相互作用，介導(dǎo)病毒入侵細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。

4 致病機(jī)理

有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生痛風(fēng)的雛鵝血清中肌酐和尿酸的水平顯著高于未發(fā)病雛鵝。尿酸升高的原因，一方面是尿酸的生成增多，另一方面是尿酸排泄障礙。尿酸會(huì)隨著血液循環(huán)到達(dá)全身各組織臟器，當(dāng)濃度達(dá)到過飽和后就會(huì)形成尿酸鹽沉積在臟器及關(guān)節(jié)等處，導(dǎo)致痛風(fēng)[8]。因此，血液循環(huán)越旺盛的部位，尿酸鹽沉積引起的病變越明顯，例如心臟和肝臟等。

禽類體內(nèi)沒有合成尿素的一系列酶，所以禽類不能將體內(nèi)消化吸收的蛋白質(zhì)代謝成尿素，只有通過嘌呤核苷酸合成分解的方式最后形成尿酸排出體外。在肝臟中的嘌呤是由一些酶催化反應(yīng)形成尿酸，其中參與嘌呤代謝形成尿酸的兩個(gè)關(guān)鍵酶分別是黃嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）和腺苷脫氨酶（Adenosine deaminase，ADA）。有研究報(bào)道，給2 日齡雛鵝接種鵝星狀病毒，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組雛鵝血清中尿酸水平、肝臟中黃嘌呤氧化酶和腺嘌呤核苷脫氨酶的表達(dá)量及活性均顯著高于對照組[9]。所以當(dāng)雛鵝感染星狀病毒后，體內(nèi)嘌呤分解相關(guān)酶的表達(dá)量及活性增高，促使尿酸生成增多，這是導(dǎo)致雛鵝高尿酸血癥及痛風(fēng)的重要原因。

感染鵝星狀病毒的雛鵝，除了尿酸生成增多外，尿酸的排泄也出現(xiàn)障礙。排泄尿酸的主要器官是腎臟，其中發(fā)揮主要作用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有Na-K-ATP 泵和耐藥相關(guān)蛋白4 等。有研究報(bào)道，雛鵝感染鵝星狀病毒后耐藥相關(guān)蛋白4 的表達(dá)量顯著降低，Na-K-ATP 泵的活性也會(huì)降低，這就使腎臟排泄尿酸的能力減弱[9]。更重要的一點(diǎn)是，雛鵝感染鵝星狀病毒的主要靶器官為腎臟，該病毒侵入機(jī)體后對腎臟造成嚴(yán)重的病理損傷，并且當(dāng)腎臟中有大量尿酸鹽沉積時(shí)，這些結(jié)晶與巨噬細(xì)胞作用會(huì)激活機(jī)體內(nèi)一系列的炎性因子，從而誘發(fā)腎臟嚴(yán)重的炎性損傷。這些均導(dǎo)致腎臟對尿酸的排泄能力下降。

5 檢測方法

5.1 病毒分離鑒定

病毒分離鑒定為最傳統(tǒng)的檢測方法，雖檢測時(shí)間較長及成本較高，但對于很多傳染病的檢測卻是金標(biāo)準(zhǔn)。采集具有典型癥狀的發(fā)病雛鵝脾臟、肝臟和腎臟等組織，將組織放入研缽中一邊加入緩沖液一邊進(jìn)行研磨，收集研磨后的液體反復(fù)凍融，離心收集上清液用以接種鵝胚進(jìn)行傳代培養(yǎng)，除鵝胚外也可用相應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。已有很多研究團(tuán)隊(duì)通過傳代培養(yǎng)分離出鵝星狀病毒，并通過動(dòng)物致病性試驗(yàn)，若癥狀與發(fā)病雛鵝相同[10-11]，即確診為鵝星狀病毒感染。

5.2 電鏡觀察

電鏡觀察是檢測病毒最直接的方法之一，分離純化后的病毒用電鏡觀察，觀察到形態(tài)為星形且大小在28～30 nm 的病毒粒子即可確診，但也有研究發(fā)現(xiàn)，病鵝肝臟內(nèi)的病毒粒子為30 nm，但并未見星狀形態(tài)[12]。所以該方法對病原檢測的特異性還有所欠缺，可作為其它方法的輔助檢測技術(shù)。

5.3 分子生物學(xué)檢測方法

分子生物學(xué)檢測方法可對病原進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測。楊穎等[13]根據(jù)鵝星狀病毒變異株的ORF1a 基因和新型鵝星狀病毒的ORF2 基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了可同時(shí)檢測2 種鵝星狀病毒的RT-PCR 檢測方法，具有較好的靈敏度，最低檢測量分別為1.70×103拷貝/μL 和1.71×103拷貝/μL，與其它病毒無交叉反應(yīng)。馬水峰等[14]根據(jù)新型鵝星狀病毒的ORF2 基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了新型鵝星狀病毒熒光定量PCR 方法，檢測靈敏度為1.087×101拷貝/μL，靈敏度高，與其它病毒無交叉反應(yīng)。曾杏梅[15]根據(jù)鵝星狀病毒ORF2 基因設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，建立了鵝星狀病毒LAMP 檢測方法，反應(yīng)溫度為58 ℃，反應(yīng)時(shí)間為40 min，最低檢測濃度為1×10-14μg/μL 病毒核酸，與其它鵝源病毒無交叉反應(yīng)。

5.4 免疫學(xué)檢測方法

目前已有學(xué)者制備出鵝星狀病毒的單克隆抗體及多克隆抗體[16-17]。佟賀等[18]通過大腸桿菌表達(dá)鵝星狀病毒1 型衣殼蛋白VP70，以此包被酶標(biāo)板，建立檢測鵝星狀病毒1 型抗體的間接ELISA，此方法可特異敏感地檢測出鵝星狀病毒1型。免疫學(xué)檢測方法的建立非常重要，如ELISA方法可檢測血清中抗體，可用于鵝星狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查，也可監(jiān)測疫苗的免疫效果。

6 小結(jié)

近幾年，我國多省養(yǎng)鵝地區(qū)暴發(fā)鵝星狀病毒病，目前尚無商品化疫苗對該病進(jìn)行預(yù)防，對我國養(yǎng)鵝業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。我國現(xiàn)流行的GoAstV 分為兩個(gè)基因型組群，存在著遺傳多樣性，且隨時(shí)可能進(jìn)一步突變。關(guān)于鵝星狀病毒感染導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的致病機(jī)制并不完全清楚，病毒編碼的某些結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，對于感染宿主細(xì)胞的功能和作用尚不明確，需要進(jìn)一步的研究。