雪蓮果提取物調(diào)控Nrf2/HO-1/NLRP3通路改善大鼠急性肝損傷的作用機(jī)制研究

陳順芝 馮玲 楊琪 張紫玉 吳蒸麗 張永勤

摘 要：基于Nrf2/HO-1/NLRP3通路探究雪蓮果提取物治療四氯化碳（CCl4）致急性肝損傷（ALI）大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。選取48只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為6組，分別為對(duì)照組、模型組、雪蓮果低中高劑量組和水飛薊素陽性組。利用CCl4構(gòu)建急性肝損傷模型后處死大鼠取材，檢測大鼠血清和肝臟生化指標(biāo)，利用HE染色觀察各組肝臟組織病理學(xué)改變情況；利用ELISA檢測大鼠血清中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平；采用蛋白免疫印跡法測定大鼠肝組織中Nrf2/HO-1/NLRP3通路關(guān)鍵基因蛋白含量表達(dá)情況。結(jié)果表明：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT、MDA、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；肝臟組織中SOD和GSH的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），大鼠肝組織細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病理性損傷（P<0.05）；與模型組比較，雪蓮果提取物能夠呈劑量依賴性降低大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平（P<0.05或P<0.01），以及提高肝臟組織中SOD、CAT、GSH和降低MDA的表達(dá)水平（P<0.05），大鼠肝組織病變程度明顯改善，肝臟內(nèi)細(xì)胞壞死和腫脹程度明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤得到顯著改善。水飛薊素陽性組能夠顯著改善大鼠肝損傷（P<0.05或P<0.01）。雪蓮果提取物組與模型組比較，Nrf2、GCLC、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性升高（P<0.05或P<0.01）；NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白（NLRP3、Caspase1、GSDMD和IL-18）表達(dá)水平呈劑量依賴性降低（P<0.05或P<0.01）。雪蓮果提取物對(duì)CCl4所致的大鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，該作用可能與調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路改善氧化應(yīng)激，降低脂質(zhì)過氧化，清除大鼠體內(nèi)自由基，抑制NLRP3炎癥小體的功能，減少炎癥因子的合成與釋放以及降低炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：雪蓮果提取物；急性肝損傷；Nrf2/HO-1通路；NLRP3炎癥小體；氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào)：R287? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.010

Effects of Extract of Yacon on Nrf2/HO-1/NLRP3 Pathway on Acute Liver Injury in Rats

CHENG Shunzhia， FENG Lingb， YANG Qib， ZHANG Ziyub， WU Zhenglib， ZHANG Yongqina*

（Guizhou University of Traditional Chinese Medicine ?a. Department of Basic Medicine; b. Department of Pharmacy， Guiyang 550025， China）

Abstract： Based on Nrf2/HO-1/NLRP3 pathway， the protective effects and mechanism of yacon extract on acute liver injury （ALI） induced by carbon tetrachloride （CCl4） in rats were investigated. Forty-eight healthy male SD rats were randomly divided into 6 groups： control group， model group， low， medium and high dose group and silymarin positive group， in which ALI model was established with CCl4 and the rats were sacrificed for sampling， and the serum and liver biochemical indexes of rats were detected. HE staining was used to observe the histopathological changes of liver in each group， and ELISA was used to detect the expression levels of inflammatory cytokines IL-6， TNF-α and IL-1β in serum of rats. The relative expression of Nrf2/HO-1/NLRP3 pathway related proteins in rat liver was determined by Western blot. The results showed that compared with normal control group， the expression levels of AST， ALT， ALP， γ-GT， MDA， IL-6 and TNF-α in serum of rats in model group significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， while the expression levels of SOD， CAT， and GSH in liver tissue were significantly decreased （P<0.05）. The pathological injury of rat liver tissue cells was obvious （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the extract of yacon could decrease the expression levels of AST， ALT， ALP， γ-GT， IL-6 and TNF-α in serum in a dose-dependent manner （P<0.05 or P<0.01）， which increase the expression levels of SOD， CAT and GSH and decrease the expression levels of MDA in liver tissue （P<0.05）. The degree of liver tissue lesions in rats was significantly improved， which the degree of liver cell necrosis and swelling was significantly reduced， and the inflammatory cell infiltration was significantly improved. Silymarin positive group significantly improved rat liver injury （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the protein expression levels of Nrf2， GCLC， NQO1 and HO-1 in the extract group and positive control group dose-dependenty increased （P<0.05 or P<0.01）. The expression levels of NLRP3 inflammator-related proteins （NLRP3， Caspase1， GSDMD and IL-18） were reduced in a dose-dependent manner （P<0.05 or P<0.01）. Yacon extracts have a protective effect on acute liver injury in rats caused by CCl4， in which the effect may be related to regulating Nrf2/HO-1 pathway to improve oxidative stress， reducing lipid peroxidation， removing free radicals in mice， inhibiting inflammatory corpuscle NLRP3 function， reducing the synthesis and release of inflammatory factors and reducing inflammation.

Key words： yacon extract; acute liver injury; Nrf2/HO-1 pathway; NLRP3 inflammasome; oxidative stress

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 272-281）

急性肝損傷（acute liver iniury，ALI）主要表現(xiàn)為代謝障礙、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡以及肝臟功能的喪失等癥狀，輕度的急性肝損傷可逐漸自愈或轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿螕p傷，進(jìn)而引發(fā)肝纖維化、肝硬化或者肝癌，而重度的急性損傷可進(jìn)展成為具有極高死亡率的急性肝衰竭。對(duì)于急性肝損傷，現(xiàn)階段除肝移植之外尚無有效的治療方法［1］。因此，尋找安全藥效的食品或藥物對(duì)于早期治療或干預(yù)急性肝損傷，以及干預(yù)急性肝損傷的發(fā)生具有重要的意義。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）是經(jīng)典的誘導(dǎo)化學(xué)性急性肝損傷動(dòng)物模型的外源性化合物，常用于研究保肝藥的藥效和分子作用機(jī)制［2］。目前，能夠治療化學(xué)性誘導(dǎo)的急性肝損傷藥物遠(yuǎn)不能滿足市場需求，研發(fā)天然植物藥物或藥食同源食物來防治急性肝損傷對(duì)于保護(hù)易感人群免受化學(xué)毒物的傷害至關(guān)重要。雪蓮果（Smallanthus sonchifolius）又名亞貢，屬菊科，葵花屬植物，其形狀像紅薯，是一種菊科多年生草本植物。目前從雪蓮果中分離出的化學(xué)成分達(dá)140種，主要有綠原酸（chlorogenic acid）、黃酮（flavonoids）、倍半萜內(nèi)酯（sesquiterpene lactone）、低聚果糖（fructooligosaccharides）、脂肪酸（fatty acid）等成分，此外還有甾醇（sterol）、二萜（diterpenoids）、對(duì)羥基苯乙酮（p-hydroxyacetophenone）衍生物以及辛酮糖酸（octulosonic acid）衍生物類等物質(zhì)，可以幫助消化，增強(qiáng)胃動(dòng)力，排毒通便，養(yǎng)顏美容，此外還具有降血糖、保肝利膽、降血脂等藥理作用［3-4］。大量的研究表明，肝損傷與氧化應(yīng)激有著密切的關(guān)系，核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2 （nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）屬于堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族，控制著II期解毒抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄，如血紅素加氧酶-1 （heme oxygenase 1，HO-1）、谷氨酸半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase catalytic，GCLC）和醌氧化還原酶-1 （quinone oxidoreductase 1，NQO1）等的表達(dá)，缺乏Nrf2的動(dòng)物抗氧化防御能力低，極易受到氧化應(yīng)激引起的各種損傷［5-6］。大量研究表明，一些草藥和膳食中的多酚可以通過激活Nrf2信號(hào)通路來保護(hù)肝臟免受損傷［7-8］。因此，Nrf2被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的重要內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子。

近期研究表明，NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3 （NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）參與了炎癥性肝病的發(fā)生，NLRP3炎性小體是在肝細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物，是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)［9-10］。NLRP3炎癥小體是由NLRP3組成的多蛋白復(fù)合體，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和半胱天冬酶-1前體（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1， pro-caspase-1）組成。當(dāng)NLRP3炎性小體被激活時(shí)，激活的炎性小體促使ASC將pro-caspase-1切割成為具有活性的Caspase-1，而具有活性的Caspase-1將IL-1β（interleukin-1β）前體和IL-18（interleukin-18）前體變?yōu)橛谢钚缘腎L-1β和IL-18，并切割GSDMD（gasdermin-D），其N端在細(xì)胞膜上成孔，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂，炎癥因子大量釋放到胞外，從而引發(fā)細(xì)胞的焦亡［11］。研究表明，在CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷中，NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，說明NLRP3的激活促進(jìn)了Caspase-1和IL-1β，參與CCl4誘導(dǎo)的肝損傷［12］。因此，抑制該信號(hào)通路的傳導(dǎo)可以有效地抑制肝損傷的進(jìn)程，對(duì)肝臟疾病治療有非凡的意義。水飛薊素是從水飛薊果中提取的一種活性素，有清除活性氧、對(duì)抗脂質(zhì)過氧化、促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)和再生等功能，在臨床上常被用于治療急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化等疾?。?3］。為了進(jìn)一步明確雪蓮果對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用及其抗氧化作用機(jī)制，本研究擬采用CCl4構(gòu)建急性肝損傷動(dòng)物模型，基于Nrf2/HO-1/NLRP3信號(hào)通路探討雪蓮果對(duì)CCl4致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制，為研究雪蓮果保肝護(hù)肝的作用機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開發(fā)雪蓮果相關(guān)產(chǎn)品提供試驗(yàn)依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)SD（Sprague-Dawley）雄性大鼠48只，體重（250±20）g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SCXK（湘）2019-0013。大鼠保持在一個(gè)12 h光/12 h暗的循環(huán)中，溫度和濕度適中，允許自由獲得食物和水。動(dòng)物飼養(yǎng)和試驗(yàn)設(shè)計(jì)均遵循國家醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則，所有動(dòng)物處理均獲得貴州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 藥品與試劑

雪蓮果莖根（yacon root）購自云南省崇明市；水飛薊素（silymarin）購自西安天廣源生物科技有限公司；CCl4購自南京化學(xué)試劑有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶

（alanine，ALT）檢測試劑盒（批號(hào)：20211021）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate，AST）檢測試劑盒（批號(hào)：20211020）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）檢測試劑盒（批號(hào)：20211021）、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（gamma-glutamic acyltransferase，γ-GT）檢測試劑盒（批號(hào)：20211022）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號(hào)：20210525）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（批號(hào)：20210325）、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒（批號(hào)：20211228）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號(hào)：20211225）均購自南京建成生物工程研究所。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)：20201104）；TNF-α（tumor necrosis factor-α）、IL-6（interleukin-6）和IL-1β ELISA Kit購自上海酶聯(lián)免疫生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號(hào)：20210929）；抗體和顯色液購自上海生工生物股份有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

儀器1510全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾科技有限公司； HH-W420恒溫箱購自江蘇金壇億通電子有限公司；MR2245普通切片機(jī)購自德國萊卡；KD-BM組織包埋機(jī)購自浙江金華科迪；Nikon DS-U3成像系統(tǒng)購自日本Nikon公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雪蓮果提取物的制備

稱取若干去皮后的雪蓮果根莖，加入8～10倍蒸餾水，煎煮2次，加80%乙醇沉淀過夜，過濾、蒸餾和干燥后得到雪蓮果提取物，取該提取物加生理鹽水配成原藥為1 g/mL的藥液。

1.2.2 動(dòng)物試驗(yàn)分組

將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，分別是對(duì)照組、模型組、雪蓮果低劑量組［10 g/（kg·d–1）］、雪蓮果中劑量組［20 g/（kg·d–1）］、雪蓮果高劑量組［40 g/（kg·d–1）］和水飛薊素陽性組［200 mg/（kg·d–1）］。除正常對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水外，其余各組均灌胃相應(yīng)劑量雪蓮果提取物，水飛薊素陽性組灌胃相應(yīng)劑量的水飛薊素溶液（200 mg/kg），每日1次，連續(xù)給藥1周。末次給藥結(jié)束2 h后，除正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積橄欖油外，其余組大鼠均一次性腹腔注射50% CCl4的橄欖油溶液（10 mL/kg）建立大鼠急性肝損傷模型。

1.2.3 標(biāo)本采集

試驗(yàn)動(dòng)物在注射CCl4 24 h后左右采血，采血前隔夜禁食不禁水，秤重，予水合氯醛（10%）腹腔注射麻醉，由腹正中線切皮，進(jìn)入腹腔分離腹主動(dòng)脈，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血。將獲得的各組大鼠血液室溫靜置2 h后，4℃、3 000 r/min離心15 min，得到各組大鼠血清，收集血清，分裝后-80℃保存?zhèn)溆?。在充分暴露游離肝臟后，在肝臟右葉中部距邊緣5 mm處用剪刀取肝組織小塊，一部分用液氮速凍在-80℃保存?zhèn)溆茫硗庖徊糠止潭ㄔ?0%多聚甲醛中用于相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.3 樣品生化指標(biāo)檢測

將獲得的各組大鼠血清，按照試劑盒說明書要求嚴(yán)格檢測各組血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性。取大鼠肝臟組織0.1g左右，加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，破碎混勻制成10%肝組織勻漿液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟檢測肝臟組織中SOD和CAT的酶活性以及GSH和MDA的含量。利用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測各組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、 IL-6和IL-1β 的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，獲得各組血清中TNF-α、IL-6和IL-1β 的含量。

1.4 HE染色

各組切取相同部位肝臟組織，用生理鹽水清洗后，10%低聚甲醛固定24 h；不同濃度乙醇脫水；二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋，將包埋好的樣品置于切片機(jī)上，并設(shè)置切片厚度為5 ?m進(jìn)行切片；待切片完全展開整齊無褶皺后，用載玻片撈起放于鐵制載玻片架中。烘干后進(jìn)行脫蠟和復(fù)水：1）依次將切片放入二甲苯Ⅰ中30 min→二甲苯Ⅱ中30 min→無水乙醇Ⅰ中5 min→無水乙醇Ⅱ中5 min→75%乙醇中5 min，自來水沖洗；2）蘇木素染色10 min，鹽酸水溶液分化30 s，氨水溶液返藍(lán)，流水沖洗；3）切片依次入85%和95%乙醇中梯度脫水，入伊紅染液中染色5 min；4）切片依次放入無水乙醇Ⅰ中10 min→無水乙醇Ⅱ中10 min→二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各5 min使之透明，中性樹膠封片；在普通光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變，進(jìn)行病理學(xué)分析。

1.5 蛋白印跡法（Western blot）

分別取各組的肝臟組織約100 mg，加入1 mL蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，裂解離心吸取上清液。采用蛋白定量（bicinchoninic acid，BCA）試劑檢測方法測定總蛋白含量。取蛋白樣品加熱并混合上樣緩沖液，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法進(jìn)行電泳，聚偏氟乙烯轉(zhuǎn)膜，用5% BSA在室溫下孵育1 h，加入相應(yīng)Nrf2（#D121053）、HO-1（#D220756）、GCLC（#D222177）、GSDMD（#17535-1-AP）、Caspase-1（#D120080）、NQO1（#D120134）、NLRP3（#D120168）、IL-18（#D220073）和β-actin（#20536-1-AP）的一抗，4℃孵育過夜。洗滌后加入山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液顯影。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，得出灰度值。檢測目的蛋白表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，試驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪蓮果對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝損傷大鼠血清生物

標(biāo)志物的影響

血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的水平是評(píng)估肝損傷嚴(yán)重程度的標(biāo)志。由圖1可見，在CCl4誘導(dǎo)的模型大鼠中，模型組與正常對(duì)照組比較，血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性水平顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，雪蓮果高中劑量組血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性水平均顯著降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。陽性對(duì)照組與模型組相比，血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性水平均顯著降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

2.2 雪蓮果提取物對(duì)各組大鼠肝臟抗氧化因子

及MDA水平的影響

細(xì)胞中SOD、CAT的酶活性及GSH的含量能夠反應(yīng)細(xì)胞的抗氧化能力。試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組相比，大鼠肝臟中SOD、CAT活性及GSH、MDA含量均顯著改變且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。雪蓮果組與模型組相比，大鼠肝臟中SOD、CAT的活性均顯著升高，GSH的含量升高而MDA的含量降低，且呈劑量依賴性變化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；陽性對(duì)照組與模型組相比，大鼠肝臟中SOD、CAT的活性均顯著升高，GSH的含量升高而MDA的含量降低，且呈劑量依賴性變化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），具體結(jié)果見圖2。

2.3 各組大鼠肝損傷的組織病理學(xué)觀察

通過HE染色觀察各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠肝臟組織未見異常，組織細(xì)胞分布均勻，肝索清晰，沒有細(xì)胞壞死、脂肪變性或炎癥細(xì)胞浸潤的出現(xiàn)。如圖3所示，CCl4誘導(dǎo)的模型組大鼠肝臟與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝細(xì)胞呈緊張性脂肪變性，可見不同大小的脂肪液泡彌漫性分布，胞漿、肝細(xì)胞區(qū)可見大面積局灶性壞死并伴炎癥細(xì)胞浸潤增生。雪蓮果高劑量組和陽性對(duì)照組，與模型組比較，大鼠肝臟中的壞死性細(xì)胞明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，與模型組比較細(xì)胞完整性得到有明顯改善（P<0.05）。雪蓮果中劑量組與模型組比較，壞死性細(xì)胞明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤相對(duì)減少，細(xì)胞壞死情況得到相對(duì)改善（P<0.05）。雪蓮果低劑量組與模型組比較，壞死性細(xì)胞相對(duì)減少，炎癥細(xì)胞浸潤相對(duì)減少，但差異并不顯著（P>0.05）。

2.4 雪蓮果提取物對(duì)各組大鼠肝臟TNF-α、IL-6

及IL-1β水平的影響

血清中TNF-α、IL-6以及IL-1β均作為炎癥因子反映肝損傷程度和機(jī)體炎癥水平。如圖4所示，通過ELISA方法檢測各組大鼠血清炎癥因子水平，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，雪蓮果高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低（P<0.05），陽性對(duì)照組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低（P<0.05），雪蓮果中低劑量組與模型組比較大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β差異不顯著（P>0.05）。

2.5 雪蓮果提取物對(duì)各組大鼠肝臟組織中Nrf2

相關(guān)基因蛋白水平的影響

利用Western blot技術(shù)檢測各組大鼠肝臟中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1蛋白的表達(dá)水平。如圖5所示，與正常對(duì)照組相比，模型組Nrf2蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），而HO-1和NQO1蛋白的表達(dá)水平相對(duì)升高（P>0.05）。雪蓮果組與模型組相比，肝臟中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1蛋白的表達(dá)水平呈劑量依賴性升高（P<0.05），陽性對(duì)照組與模型組比較，Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。

2.6 雪蓮果提取物對(duì)各組大鼠肝臟組織中NLRP3相關(guān)基因蛋白水平的影響

利用Western blot技術(shù)檢測各組大鼠肝臟中NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-18蛋白的表達(dá)水平。如圖6所示，與正常對(duì)照組相比，模型組NLRP3、GSDMD、IL-18蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）。雪蓮果組與模型組相比，肝臟中NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-18蛋白的表達(dá)水平呈劑量依賴性降低（P<0.05或P<0.01），陽性對(duì)照組與模型組比較，NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-18蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)雪蓮果提取物顯著改善了CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷，能夠降低肝損傷大鼠血清中ALT、AST、ALP和γ-GT的活性，降低CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織中MDA的表達(dá)水平，提高肝臟組織中SOD、CAT和GSH的表達(dá)水平。同時(shí)，雪蓮果提取物能夠有效降低大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平，提高NRF2/HO-1信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，同時(shí)能夠抑制NLRP3炎癥小體的激活來保護(hù)CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷。肝損傷會(huì)導(dǎo)致各種肝臟疾病，尋找安全有效的藥物或藥食同源的食品對(duì)治療和預(yù)防肝損傷具有重要意義。CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是研究保肝護(hù)肝類藥物的經(jīng)典模型之一，其作用機(jī)制為CCl4進(jìn)入機(jī)體后，最先進(jìn)入肝臟進(jìn)行代謝，在肝細(xì)胞中被細(xì)胞色素P450分解，產(chǎn)生三氯甲基等氧自由基，破壞細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)［14］。氧自由基會(huì)促進(jìn)細(xì)胞膜進(jìn)行脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞肝細(xì)胞膜的完整性，進(jìn)而增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外流，致使細(xì)胞壞死腫脹［15］。肝細(xì)胞內(nèi)容物如ALT和AST持續(xù)外流進(jìn)入血液當(dāng)中，引起血清中ALT和AST活性升高。因此，血清中ALT和AST的水平也反映了肝臟受損的嚴(yán)重程度［16］。此外，脂質(zhì)過氧化會(huì)加大肝細(xì)胞的破壞導(dǎo)致ALP和γ-GT持續(xù)外流，引起血清中ALP和γ-GT水平顯著升高，而血清中ALP水平不僅是肝細(xì)胞受損的程度指標(biāo)，也是臨床上檢測肝臟疾病的主要指標(biāo)。當(dāng)肝臟受損時(shí)會(huì)造成γ-GT排泄受阻，隨膽汁反流入血引起血清中γ-GT異常升高［17］。在脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生大量的MDA，其能夠加劇細(xì)胞膜的受損，因而MDA也可作為組織氧化應(yīng)激情況和過氧化程度的重要生物指標(biāo)之一［18］。SOD和CAT均能消除或減輕細(xì)胞氧化損傷，能夠清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)過氧化水平升高時(shí)，SOD和CAT水平也會(huì)相應(yīng)上升來抵抗外界的過氧化，因此，SOD和CAT是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)［19］。還原性GSH具有較強(qiáng)的還原性，能中和細(xì)胞當(dāng)中的氧化物質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，促進(jìn)肝臟排泄和解毒，當(dāng)細(xì)胞中氧化程度過高時(shí)會(huì)一定程度上消耗GSH，導(dǎo)致其含量較低［20］。本研究利用雪蓮果處理CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型，結(jié)果顯示，雪蓮果能夠顯著降低CCl4誘導(dǎo)的大鼠血清中ALT、AST、ALP和γ-GT的水平（P<0.05），這表明雪蓮果能夠在一定程度上改善CCl4引起的肝損傷。此外，本研究發(fā)現(xiàn)雪蓮果能夠降低CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織中SOD、CAT和MDA的表達(dá)水平（P<0.05），同時(shí)升高肝臟組織中GSH的表達(dá)水平（P<0.05），這說明雪蓮具有一定的抗氧化作用，可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激作用改善CCl4引起的肝損傷。

雪蓮果中主要含有綠原酸、黃酮和低聚果糖等成分，具有抗氧化、抗炎、降血糖、抑菌、抗癌作用［21］。已有研究表明，綠原酸具有抗氧化作用，可以通過促進(jìn)Nrf2入核，增強(qiáng)肝組織中HO-1、NQO1和GCLC的表達(dá)，進(jìn)而改善肝損傷［22-23］。為了進(jìn)一步明確雪蓮果改善CCl4誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的作用機(jī)制，本試驗(yàn)檢測了各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)水平，結(jié)果顯示，雪蓮果提取物顯著減少血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平。此外，我們檢測了大鼠肝臟組織中重要抗氧化應(yīng)激的Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，雪蓮果提取物能夠顯著提高Nrf2、HO-1、NQO1和GCLC的表達(dá)水平。因此，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雪蓮果可能通過激活Nrf2基因，促進(jìn)抗氧化因子的表達(dá)，增強(qiáng)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠抗氧化能力，進(jìn)而緩解急性肝損傷。由此可見，雪蓮果改善肝損傷的作用機(jī)制可能與其含有的有效成分相關(guān)，復(fù)雜的成分為其改善肝損傷奠定了基礎(chǔ)。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC及pro-caspase-1組成的多蛋白復(fù)合物，當(dāng)NLRP3炎癥小體被激活后，前體Caspase-1被切割成具有活性的Caspase-1，Caspase-1切割前體IL-1β（pro-IL-1β），產(chǎn)生具有炎性作用的IL-1β，參與炎癥反應(yīng)［24］。研究表明，CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷肝組織中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表達(dá)上調(diào)，這表明NLRP3活化促進(jìn)Caspase-1、IL-1β參與了CCl4誘導(dǎo)的肝臟損傷，進(jìn)而抑制Caspase-1、IL-1β等表達(dá)并顯著減輕肝臟損傷［25］。研究表明，綠原酸能夠抑制NLRP3炎癥小體激活來保護(hù)急性腎損傷［26］。此外，綠原酸可以通過Nrf2/NLRP3信號(hào)減弱LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細(xì)胞的炎癥［27］。本研究結(jié)果表明，雪蓮果提取物能夠抑制NLRP3炎癥小體激活，降低NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18和IL-1β等蛋白的表達(dá)水平，從而有效改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷。

綜上所述，本研究初步確定雪蓮果提取物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其主要通過降低脂質(zhì)過氧化，清除大鼠體內(nèi)自由基，保護(hù)大鼠肝細(xì)胞的完整性，同時(shí)激活Nrf2的表達(dá)，抑制NLRP3炎癥小體激活，降低炎癥反應(yīng)，減輕大鼠肝細(xì)胞損傷來保護(hù)大鼠肝臟。本研究明確了Nrf2/HO-1/NLRP3通路在雪蓮果提取物治療CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷的作用機(jī)制，為雪蓮果的臨床應(yīng)用和市場推廣提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ FRANCESCO V， ANNA C， WILLIAM B. Acute liver failure［J］. Current Opinion in Critical Care， 2022， 28（2）： 198-207.

［2］ MITCHELLR M， HARTUT J. Animal models of drug-induced liver injury［J］. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease， 2018， 1865（5）： 1031-1039.

［3］ 李姿瑤， 丁小倩， 王艷， 等. 雪蓮果成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2022， 28（11）： 217-226.

LI Ziyao， DING Xiaoqian， WANG Yan， et al. Research progress on components and pharmacological activities of Smallanthus sonchifolius ［J］. Chinese Journal of Experimental Formulae， 2022， 28（11）： 217-226.

［4］ 那襲雪， 張文濤， 談遠(yuǎn)鋒， 等. 綠原酸及其異構(gòu)體藥理作用及不良反應(yīng)研究進(jìn)展［J］. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018， 20（3）： 140-144.

NA Xixue， ZHANG Wentao， TAN Yuanfeng， et al. Advances in pharmacological effects and adverse reactions of chlorogenic acid and its isomers ［J］. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， 2018， 20（3）： 140-144.

［5］ 梁新妹， 王云平， 李丹， 等. Keap1-Nrf2信號(hào)通路在機(jī)體氧化應(yīng)激損傷防護(hù)中的研究進(jìn)展［J］. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2022， 19（35）： 40-44.

LIANG Xinmei， WANG Yunping， LI Dan， et al. Research progress of Keap1-Nrf2 signaling pathway in oxidative stress protection ［J］. Chinese Medical Review， 2022， 19（35）： 40-44.

［6］ 蘆雅麗， 薩日娜， 魏立曉， 等. 基于Keap1/Nrf2信號(hào)通路研究紫檀芪對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用［J］. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)， 2021， 38（17）： 2079-2087.

LU Yali， SA Rina， WEI Lixiao， et al. Protective effect of pterostilbene against acetaminophen-induced acute liver injury in mice based on Keap1/Nrf2/mitochondria pathway ［J］. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy， 2021， 38（17）： 2079-2087.

［7］ 許皖， 李娜， 柳海艷， 等. 基于Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路探討葛花、枳椇子及其配伍對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)制［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2023， 29（1）： 37-44.

XU Wan， LI Na， LIU Haiyan， et al. Flos puerariae， hoveniae semen and their combinations treat oxidative stress in mice with acute alcoholic liver injury via Keap1/Nrf2/ARE signaling pathway ［J］. Chinese Journal of Experimental Formulae， 2023， 29（1）： 37-44.

［8］ 沙玉茹， 羅曉敏， 丁翼， 等. 基于Keap1/Nrf2與TLR4/NF-κB p65信號(hào)通路研究藏族藥二十五味松石丸改善對(duì)乙酰氨基酚致小鼠肝損傷的作用機(jī)制［J］. 中國中藥雜志， 2022， 47（8）： 2049-2055.

SHA Yuru， LUO Xiaomin， DING Yi， et al. Mechanism of Tibetan medicine Ershiwuwei Songshi pills against liver injury induced by acetaminophen in mice based on Keap1/Nrf2 and TLR4/Nf-κB p65 signaling pathways ［J］. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine， 2022， 47（8）： 2049-2055.

［9］ XIANGFU J， YU L， DONGDONG F， et al. Caveolin-1 ameliorates acetaminophen-aggravated inflammatory damage and lipid deposition in non-alcoholic fatty liver disease via the ROS/TXNIP/NLRP3 pathway［J］. International Immunopharmacology， 2022， 114： 109558.

［10］ YU L， ZIWEI G， JIAN L， et al. Insight into the regulation of NLRP3 inflammasome activation by mitochondria in liver injury and the protective role of natural products［J］. Pharmacotherapie， 2022， 156： 113968.

［11］ ABDULLH A M， AFROZA A，SUKRIA H， et al. Role of NLRP3 inflammasome in liver disease［J］. Journal of Digestive Diseases， 2020， 21（8）： 430-436.

［12］ YANPING D， XIAOQING D， YIFAN M-A， et al. Astragaloside IV plays a role in reducing radiation-induced liver inflammation in mice by inhibiting thioredoxin-interacting protein/nod-like receptor protein 3 signaling pathway［J］. Journal of traditional Chinese Medicine， 2023， （1）： 87-94.

［13］ 翟碩， 李娜， 陳蓓寧， 等. 水飛薊在治療慢性肝炎中的研究進(jìn)展［J］. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)， 2019， 24（5）： 573-579.

ZHAI Shuo， LI Na， CHEN Beining， et al. Research progress of silymarin in the treatment of chronic hepatitis ［J］. Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics， 2019， 24（5）： 573-579.

［14］ 郅音， 宋雅楠， 張苗， 等. 四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷藥理作用研究［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2022， 40（1）： 107-109， 275.

ZHI Yin， SONG Yanan， ZHANG Miao， et al. Pharmacological effects of carbon tetrachloride induced acute liver injury in mice ［J］. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine， 2022， 40（1）： 107-109， 275.

［15］ 段冷昕， 高楊， 胡舉， 等. 四氯化碳誘導(dǎo)小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致急性肝損傷的作用研究［J］. 中國臨床藥理學(xué)雜志， 2018， 34（12）： 1440-1443.

DUAN Lengxin， GAO Yang， HU Ju， et al. Effects of carbon tetrachloride on acute liver injury induced by endoplasmic reticulum stress in mice ［J］. Chinese Journal of Clinical Pharmacology， 2018， 34（12）： 1440-1443.

［16］ 王麗艷， 孔凡剛. 肝病患者血清中AST/ALT比值的臨床意義研究［J］. 中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志， 2020， 8（30）： 97-98.

WANG Liyan， KONG Fangang. Clinical significance of serum AST/ALT ratio in patients with liver disease ［J］. Journal of Integrated Traditional and Western Medicine Cardiovascular Diseases， 2020， 8（30）： 97-98.

［17］ 張梅英， 溫志立， 許艷華. ALP、γ-GT和CHE檢測在慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌、膽道疾病中的臨床意義［J］. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào) （醫(yī)學(xué)版）， 2012， 52（2）： 34-36.

ZHANG Meiying， WEN Zhili， XU Yanhua. Clinical significance of ALP， γ-GT and CHE detection in chronic hepatitis B， liver cirrhosis， liver cancer and biliary tract diseases［J］. Journal of Nanchang University （Medical Science Edition）， 2012， 52（2）： 34-36.

［18］ 翟曉虎， 楊海鋒， 陳慧英， 等. 丙二醛的毒性作用及檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2018， 34（1）： 144-148.

ZHAI Xiaohu， YANG Haifeng， CHEN Huiying， et al. Toxicity and detection of malondialdehyde ［J］. Acta Agriculturae Shanghai， 2018， 34（1）： 144-148.

［19］ 李青青， 熊佳慧， 溫玉清， 等. 丹參酮ⅡA對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用［J］. 中國臨床解剖學(xué)雜志， 2022， 40（6）： 671-676.

LI Qingqing， XIONG Jiahui， WEN Yuqing， et al. Protective effect of tanshinone ⅡA on acute liver injury induced by CCl4 in mice［J］. Chinese Journal of Clinical Anatomy， 2022， 40（6）： 671-676.

［20］ 張娟， 毛文靜， 白慶云. 槲皮素及其衍生物防治肝損傷作用及機(jī)制的研究進(jìn)展［J］. 中草藥， 2021， 52（23）： 7348-7357.

ZHANG Juan， MAO Wenjin， BAI Qingyun. Research progress of quercetin and its derivatives on prevention and treatment of liver injury and its mechanism ［J］. Chinese Herbal Medicine， 2021， 52（23）： 7348-7357.

［21］ 郝婷， 李洪波， 趙紅玲，等. 雪蓮果低聚果糖化學(xué)成分及其生物活性［J］. 中成藥， 2021， 43（5）： 1375-1378.

HAO Ting， LI Hongbo， ZHAO Hongling， et al. Chemical constituents and biological activities of fructooligosaccharides in Saussela chinensis［J］. Chinese Patent Medicine， 2021， 43（5）： 1375-1378.

［22］ XIN Y， XINGKANG H， LINGYUN W， et al. Chlorogenic acid， the main antioxidant in coffee， reduces radiation-induced apoptosis and DNA damage via NF-E2-related factor 2 （Nrf2） activation in hepatocellular carcinoma［J］. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2022， 2022： 4566949.

［23］ 史秀玲， 高銀輝. 綠原酸對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2011， 17（19）： 199-202.

SHI Xiuling， GAO Yinhui. Protective effect of chlorogenic acid on acute liver injury in mice ［J］. Chinese Journal of Experimental Formulae， 2011， 17（19）： 199-202.

［24］ FENG C， YINGXIA L， QIANHUI L， et al. Inhibition of hepatic NLRP3 inflammasome ameliorates non-alcoholic steatohepatitis/hepatitis B-induced hepatic injury［J］. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology， 2022， 47（1）： 102056.

［25］ FERNANDO L R， ALLEJANDRO P F， JOSE A P， et al. Emerging role of NLRP3 inflammasome and pyroptosis in liver transplantation［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（22）： 14396.

［26］ 馮秀晶， 尹柏雙， 秦宏宇， 等. 綠原酸通過Nrf2/NLRP3通路減輕LPS致大鼠急性腎損傷的作用機(jī)制［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2022（18）： 111-118， 144.

FENG Xiujing， YIN Baishang， QIN Hongyu， et al. Effects of chlorogenic acid on LPS-induced acute kidney injury in rats through Nrf2/NLRP3 pathway ［J］. Heilongjiang Animal Husbandry and Veterinary Science， 2022（18）： 111-118， 144.

［27］ SHI A， SHI H， WANG Y， et al. Activation of Nrf2 pathway and inhibition of NLRP3 inflammasome activation contribute to the protective effect of chlorogenic acid on acute liver injury［J］. Int Immunopharmacol， 2018， 54： 125-130.