外源CO對鹽脅迫下加工番茄幼苗光合熒光的影響

滕元旭，駱 霞，張雪蒙，崔輝梅

(1. 石河子大學農學院，新疆 石河子 832003; 2. 特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆 石河子 832003)

新疆是我國加工番茄的主要生產地，其產量占到全國總產量的一半以上[1]，但是新疆特殊的地理氣候條件容易造成土壤鹽漬化[2]。鹽漬化會使土壤溶液的濃度過高，導致植物吸收水分和養(yǎng)分的能力下降，活性氧物質在體內的穩(wěn)態(tài)失衡,破壞細胞膜的完整性，增加電解質的滲出率，影響植物的光合作用進而影響植物正常的生長發(fā)育[3-6]。因此，提高加工番茄的耐鹽性，對促進新疆“紅色產業(yè)”發(fā)展，增加農民收入，維持加工番茄市場穩(wěn)定及促進農業(yè)增產增效具有重要的現實意義和戰(zhàn)略意義。

一氧化碳(CO)是一種常見的雙原子穩(wěn)定氣體分子。研究表明，植物體內的CO是由血紅素加氧酶催化血紅素產生的[7-8]，而高鐵血紅素是一種天然血紅素的體外純化物，其化學性質與天然血紅素相似[9]，應用高鐵血紅素可以顯著上調HO1(血紅素加氧酶1)的轉錄和活性[10]，因此高鐵血紅素被用作外源信號分子CO的供體。CO在植物對非生物脅迫的響應中發(fā)揮積極作用[11]，高鐵血紅素通過提高HO的活性，降低銀離子的積累和增強抗氧化防御系統(tǒng)，降低了AgNPs脅迫對芥菜的傷害[12]。Chen等[13]發(fā)現，CO通過降低Zn的吸收，提高水稻對鋅的耐受性。牟雪姣等[14]發(fā)現，CO處理可以提高黃瓜種子滲透調節(jié)能力和相關同工酶的表達，增強了植株對干旱脅迫的適應性。袁星星等[15]通過對鹽脅迫下小麥的研究發(fā)現，CO預處理可以抑制脯氨酸脫氫酶活性，緩解小麥在鹽脅迫下受到的傷害。

近年來有研究表明CO已經被作為除NO外的另外一種氣體信號轉導分子，與H2S氣體分子一起參與植物體的多種生理代謝調控[8,16-17]，目前關于NO[18-19]和H2S[6]緩解鹽脅迫的機理研究已經越來越全面,而關于外源CO誘導加工番茄抗(耐)鹽性的光合生理、相關光合熒光參數及滲透性調節(jié)物質變化的研究尚缺乏深入報道。本試驗以不同品種加工番茄為材料，研究外施不同濃度CO對NaCl脅迫下加工番茄幼苗葉片光合生理及相關生理指標的影響，探討外施CO調控NaCl脅迫下加工番茄生長的生理生化機理，為利用化學誘抗劑緩解鹽脅迫提供理論依據，為提高新疆鹽堿地區(qū)加工番茄的產量提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以加工番茄品系KT-7為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄幼苗培育 于2020 年5—7月石河子大學農學院試驗站進行試驗，選取籽粒飽滿、大小均一的加工番茄種子，采用10%的高錳酸鉀消毒，并用蒸餾水沖洗3次后，放于(25±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱內催芽3 d，播種于溫室72 孔穴盤中，穴盤基質為蛭石。待葉片長到第一片真葉展平時，每天下午澆50% Hoagland營養(yǎng)液，待長到四葉一心時選取長勢一致的幼苗移栽至100% Hoagland營養(yǎng)液中緩苗3 d后進行處理。

1.2.2 脅迫處理 預試驗:篩選NaCl處理和高鐵血紅素處理濃度，對四葉一心的加工番茄幼苗分別進行處理。NaCl共設2個濃度，分別為100 mmol·L-1和150 mmol·L-1，以Na100和Na150表示；每個NaCl濃度下分別設4個高鐵血紅素梯度(0、0.010、0.025、0.050 mmol·L-1，分別以Na100、Na100H1、Na100H2、Na100H3和Na150、Na150H1、Na150H2、Na150H3表示)，以Hoagland營養(yǎng)液配置成處理液，以無NaCl和高鐵血紅素的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)作為對照(CK)。并于每日9∶00對各處理植株葉面噴施高鐵血紅素(CO供體)，每株幼苗噴施量約為10 mL，每個栽培槽種植5株作為1個重復，4次重復，隨機排列。鹽處理3 d后測定加工番茄第4片葉的凈光合速率(Pn)、丙二醛含量和相對電導率，測定重復3次。

根據預試驗的篩選結果設置以下4個處理，分別為CK,Na150,Na150H1,Na150H2(后2個處理下文分別簡寫為H1、H2)，施用處理方式同預試驗，處理3 d后測定加工番茄第4片葉的光合參數、葉綠素熒光參數，取樣測定每個處理第4片葉的各項生理指標，測定重復3次。同時測定植株的生長指標。

1.3 指標測定方法

1.3.1 形態(tài)指標測定 鹽處理3 d后用直尺測定加工番茄幼苗的株高，使用游標卡尺測定莖粗，幼苗用自來水沖洗干凈后吸干表面水分稱鮮質量，然后在烘箱中105℃殺青30 min，70℃烘干至恒重，稱干質量。按如下公式計算壯苗指數：壯苗指數=(莖粗/株高)×全株干質量×100%。

1.3.2 光合色素含量、光合參數測定 葉綠素提取采用高俊鳳[20]方法(95%乙醇提取法)。光合特性測定采用LI-6800便攜式光合測定系統(tǒng)(Li-Cor Inc.，Lincoln，NE，USA)于處理結束當天10∶00—12∶00進行測定。測定前將試驗植株提前30 min擺放在陽光下進行充分光適應，每個處理選擇3株，測定加工番茄第4片葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)。計算以下指標：表觀CO2利用效率(CUEapp)=Pn/Ci。

1.3.3 快速葉綠素熒光動力學曲線測定 參考Goussi等[21]方法，測定前將葉片暗適應30 min，然后利用植物效率儀(M-PEA，Hansatech英國)測定各處理加工番茄葉片的快速葉綠素熒光動力學曲線(OJIP曲線)。計算如下指標：

VOP，指葉綠素a熒光瞬變在兩個熒光極端相位O(F0)和P(Fm)之間雙重歸一化：

VOP=(Ft-Fo)/(Fm-Fo)

VOK，指葉綠素a熒光瞬變在步驟O和K之間雙重歸一化：

VOK=(Ft-Fo)/(FK-Fo)

VOJ，指可變熒光瞬變在步驟O和J之間雙重歸一化：

VOJ=(Ft-Fo)/(FJ-Fo)

ΔVOK=VOK(處理)-VOK(CK)

ΔVOJ=VOJ(處理) -VOJ(CK)

VOI，指可變熒光瞬變在Fo和FI階段之間雙重歸一化：

VOI(≥1)=(Ft-Fo)/(FI-Fo)

VIP，指可變熒光瞬變在步驟I和P之間雙重歸一化：

VIP=(Ft-FI)/(Fm-FI)

1.3.4 JIP-Test分析 根據Goussi等[21]的方法對OJIP曲線所得參數進行計算，所需參數如下：(1)熒光參數：Ft為某時刻的熒光，Fo(20 μs時熒光，O相)、FK(300 μs時熒光，K相)、FJ(2 ms時熒光，J相) 、FI(30 ms時熒光，I相)、Fm(最大熒光，P相);(2)CS(單位受光面積)、RC(單位PSⅡ活性反應中心)，反應中心密度：RC/CSm；(3)ABS(光能吸收量)，TRo(捕獲的光能)，ETo(用于電子傳遞的能量)，DIo(熱耗散的能量)?；趩挝幻娣e和反應中心的比活性參數：單位面積吸收光能(ABS/CSm)、捕獲(TRo/CSm)、用于電子傳遞(ETo/CSm)和熱耗散(DIo/CSm)的光能；單位反應中心吸收(ABS/RC)、捕獲(TRo/RC)、用于電子傳遞(ETo/RC)及熱耗散(DIo/RC)的能量；(4)量子產額：最大光化學效率φPo(TRo/ABS)、用于電子傳遞的量子產額φEo(ETo/ABS)、用于熱耗散的量子比率(DIo/ABS)；反應中心捕獲的激子中用來推動電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA的其他電子受體的激子占用來推動QA還原激子的比率(Ψo)；葉綠素反應中心密度RC/ABS、性能指標PIABS和表現指數PICSM。

1.3.5 滲透調節(jié)物質含量測定 采用李合生[22]的蒽酮比色法、考馬斯亮藍法和磺基水楊酸法分別測定幼苗葉片中可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量。

1.3.6 丙二醛含量和相對電導率測定 采用李合生[22]的2-硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二醛(MDA)含量；電導率儀測定相對電導率。

1.3.7 葉片相對含水率測定 每處理各取3片第四葉葉片，稱取鮮重(Fw)后置于蒸餾水中浸泡2 h，用濾紙吸干水分，稱其飽水重(Tw)，放入烘箱中105℃殺青15 min后，75℃烘干到恒重，稱取干重(Dw)。相對含水率RWC=(Fw-Dw)/(Tw-Dw)。

1.4 數據處理

所有指標測定重復3次，使用Microsoft Excel 2019進行相關數據的統(tǒng)計記錄，采用SPSS 19.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan法多重比較(P<0.05)。采用OriginPro 2021繪制柱狀圖和折線圖。

2 結果與分析

2.1 NaCl和外源CO對加工番茄處理濃度的確定

與CK相比，隨著鹽濃度的上升，加工番茄幼苗處理3 d后葉片的Pn顯著下降，相對電導率和MDA含量顯著上升(圖1)，在100 mmol·L-1的鹽濃度下隨著CO施加濃度的上升，Pn先上升后下降，相對電導率和MDA含量顯著下降；在150 mmol·L-1的鹽濃度下施加不同濃度CO均會造成Pn的顯著上升，相對電導率和MDA含量顯著下降。另外從幼苗表型觀察，100 mmol·L-1NaCl處理鹽害表現并不明顯，0.010、0.025 mmol·L-1的CO處理對其產生明顯的緩解效應。因此，本試驗選用150 mmol·L-1NaCl作為鹽脅迫的濃度，高鐵血紅素濃度選用0.010 mmol·L-1和0.025 mmol·L-1。

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著水平(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant level of difference (P<0.05).圖1 不同濃度NaCl和外源CO處理對加工番茄幼苗葉片凈光合速率、相對電導率和丙二醛含量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NaCl and CO treatments on net photosynthetic rate, relative electrical conductivity and malondialdehyde (MDA) content of processed tomato seedling leaves

2.2 外源CO對NaCl脅迫下加工番茄幼苗干物質積累量的影響

由表1可知，與CK相比，單獨鹽脅迫下加工番茄株高、莖粗、生物量和壯苗指數顯著降低，降幅分別為22.56%、18.83%、35.04%、32.12%。外施CO處理顯著提高了鹽脅迫下幼苗的株高、莖粗、生物量和壯苗指數，與Na150相比，H1的增幅分別為24.23%、14.56%、34.78%、24.67%，H2的增幅分別為15.21%、10.16%、25.38%、20.20%，均達到顯著性差異。

表1 外源CO對鹽脅迫下加工番茄幼苗形態(tài)指標的影響Table 1 Effects of CO treatments on the growth of processing tomato seedlings under NaCl stress

2.3 外源CO對NaCl脅迫下加工番茄幼苗葉片光合色素含量的影響

由表2可知，與CK相比，單獨鹽脅迫顯著降低了加工番茄幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)、類胡蘿卜素含量。外源CO處理提高了鹽脅迫下幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)、類胡蘿卜素含量，與Na150相比，H1處理分別提高了為10.58%、19.52%、12.67%、5.75%，葉綠素a/b降低了7.75%；H2處理分別提高了11.31%、19.92%、13.33%、8.51%，葉綠素a/b降低了7.33%。

表2 外源CO對鹽脅迫下加工番茄幼苗光合色素的影響Table 2 Effects of CO treatments on photosynthetic pigment of processing tomato seedlings under NaCl stress

2.4 外源CO對NaCl脅迫下加工番茄幼苗葉片光合氣體交換參數的影響

表3表明，與CK相比，單獨鹽脅迫下加工番茄Tr、Pn、Gs、CUEapp指數顯著降低，降幅分別為70.78%、72.11%、83.48%、69.73%。外施CO處理顯著提高了鹽脅迫下的Pn和CUEapp，與Na150相比，H1的增幅分別為87.24%和152.58%，H2的增幅分別為75.62%和130.49%；外施CO顯著降低了Ci，H1和H2處理分別降低了26.71%和25.28%。

表3 外源CO對鹽脅迫下加工番茄幼苗光合氣體交換參數的影響Table 3 Effects of CO treatments on photosynthetic parameters of processing tomato seedlings under NaCl stress

2.5 外源CO對NaCl脅迫下加工番茄幼苗快速葉綠素熒光的影響

由圖2可知，與未處理(CK)幼苗相比，鹽脅迫下的加工番茄幼苗葉綠素快速熒光曲線產生了一定的變化。未處理(CK)葉片的Ft表現出典型的OJIP瞬態(tài)(圖2A)，在150 mmol·L-1NaCl處理3 d后，Fm和Fo與CK相比有較大程度的降低，分別降低了20.86%和24.20%；與Na150相比，當施加外源CO時Fm和Fo無明顯變化。與CK相比，鹽脅迫降低了加工番茄的OJ期，此外，JI和IP后段在鹽脅迫下熒光變化幅度減小。為了更好地分析瞬時葉綠素熒光，在Fo處進行了一階歸一化(Ft/Fo)(圖2B)，顯示了典型的O、J、I和P步驟。與CK相比，鹽脅迫下加工番茄葉片可變熒光提高，在外源施加CO后，相較Na150，葉片可變熒光進一步提高。為了避免不同的Fo和Fm值產生的任何干擾和異質性，對Fm處的熒光值進行了第二歸一化步驟(圖2C)，得到相對可變熒光(VOP)；NaCl處理3 d后，VOP發(fā)生了改變，熒光升高趨勢相對于CK在0.2 ms至1 ms時變緩。

分別對O到P瞬變的主要波段進行微分曲線處理:L波段(O-K)和K波段(O-J)。這些波段的曲線是用未處理(CK)和受到鹽脅迫的植株之間歸一化瞬變的差異繪制的(圖2E、圖2G)。由圖2E可知，ΔVOK顯示鹽處理植株會出現一條負帶(L帶)，與鹽脅迫下的植株相比，外源施加CO會使L-帶的振幅逐漸減小。ΔVOJ的動力學差異揭示了在NaCl處理的植株中出現的所謂的K-帶，它在300 μs時VOJ之間出現一個峰值(圖2G)。處于鹽脅迫下的植株K-帶均呈現負偏差，與鹽脅迫下的植株相比，H1處理會使K-帶的振幅逐漸增大。

針對I-P相的測量，對在30～300 ms時間范圍內熒光瞬變VOI和在30～200 ms時間范圍內進行瞬時VIP歸一化處理。不同處理間的熒光VOI差異顯著(圖2H)。與CK相比，鹽脅迫下的植株的VOI略有上升。同時VIP變化與其幾乎相似但差異不明顯(圖2I)。

圖2 外源CO對鹽脅迫下加工番茄幼苗葉片快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP曲線)的影響Fig.2 Effects of CO treatments on the fast induction curves of chlorophyll a fluorescence(OJIP) in leaves of processing tomato seedlings under NaCl stress

2.6 外源CO對NaCl脅迫下加工番茄幼苗JIP-test參數的影響

對快速葉綠素熒光誘導動力學曲線的信息進行數學解析，可以得到多個熒光參數。為了表征處理下加工番茄幼苗PSII的狀態(tài)，根據葉綠素熒光曲線得出JIP-test參數并制成雷達圖(圖3)。其中以CK為參考對每個變量進行歸一化處理。

圖3 外源CO對鹽脅迫下加工番茄幼苗JIP-test參數的影響Fig.3 Effects of exogenous CO on JIP-test parameters of processing tomato seedlings under NaCl stress

以有活性的反應中心(RC)為基礎，在鹽脅迫下，單位有活性反應中心吸收的光能(ABS/RC)、捕獲的光能(TRo/RC)、熱耗散的光能(DIo/RC)以及電子傳遞的能量(ETo/RC)顯著降低，說明脅迫時葉片減少了用于電子傳遞的能量份額，反應中心RC活性降低，而外源噴施高鐵血紅素會使ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC、ETo/RC的數值下降，其中H1處理緩解效果更明顯,與鹽脅迫相比分別降低了6.59%、6.12%、8.67%、1.37%，H2處理效果不明顯。對葉片受光單位面積(CSm)來說，在鹽脅迫下活性反應中心密度(RC/CSm)、單位面積吸收(ABS/CSm)、捕獲(TRo/CSm)、傳遞(ETo/CSm)和單位面積熱耗散(DIo/CSm)的能量明顯降低，而外源噴施CO后RC/CSm和ETo/CSm有小幅的升高，其中H1處理緩解效果更明顯,與鹽脅迫相比分別提高了12.40%和6.02%。

與CK相比，鹽脅迫下的葉綠素反應中心密度RC/ABS、性能指標PIABS和表現指數PICSM分別增加了21.55%、31.33%和2.57%，與鹽脅迫相比外源施加CO會進一步提高RC/ABS、PIABS和PICSM，其中H1處理更為明顯，分別提高了7.04%、6.25%和11.57%。

2.7 外源CO對NaCl脅迫下加工番茄幼苗葉片滲透性調節(jié)物質的影響

表4表明，單獨NaCl處理會顯著降低加工番茄幼苗的葉片相對含水率，相比于CK降低了15.72%，顯著提高脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的含量，相比于CK分別提高了377.58%、119.23%、47.35%。外施高鐵血紅素處理顯著提高了鹽脅迫下的葉片相對含水率，與Na150相比，H1和H2處理分別提高了10.39%和9.56%；降低了鹽脅迫下的葉片脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的含量，其中H1分別降低了40.16%、25.18%、4.36%，H2分別降低了28.41%、18.75%、8.75%。

表4 外源CO對NaCl脅迫下加工番茄幼苗 葉片生理指標的影響Table 4 Effects of CO treatments on some physiological indexes of processing tomato seedlings under NaCl stress

3 討 論

鹽脅迫對植株的傷害是多方面的，會對植物造成滲透脅迫、離子脅迫和氧化脅迫[23-24]，本研究發(fā)現150 mmol·L-1NaCl脅迫，破壞了加工番茄幼苗細胞膜結構的完整性，導致相對電導率的增加，進而限制植物的正常生長發(fā)育。噴施0.010 mmol·L-1高鐵血紅素會提高滲透性調節(jié)物質(可溶性糖、可溶性蛋白)的含量，緩解滲透脅迫，從而降低電解質滲出率和丙二醛含量，提高干物質的積累，降低鹽脅迫對加工番茄的傷害,這與袁星星等[15]對外源CO處理下小麥幼苗耐鹽性中的研究結果一致。

植物光合作用的能量主要源自光合色素捕獲的光能，光合色素含量在很大程度上反映出植物葉片的光合能力。其中類胡蘿卜素Car作為植物體內重要的抗氧化劑，是光吸收復合體的重要組成部分，可以有效減輕活性氧對光合結構的破壞[25-26]。本研究表明鹽脅迫使加工番茄葉片中Chl a、Chl b、Chl (a+b)的含量降低，外源CO處理提高了葉片光合色素含量，有效緩解鹽脅迫對加工番茄幼苗的傷害，提高加工番茄光合能力。

鹽脅迫下葉片光合同化速率的降低是鹽脅迫抑制植物生長重要因素之一[27]。本試驗表明NaCl脅迫會導致番茄幼苗葉片Gs顯著降低，導致Pn和Tr的降低，試驗結果與鄭州元等[6]在鹽脅迫番茄中研究結果相同，本試驗結果還表明外源CO供體會顯著提高加工番茄葉片的Tr和Gs，提高葉片的CUEapp，提高NaCl脅迫下番茄幼苗葉片對CO2和光能資源的綜合利用效率，改善并提高葉片的光合性能，從而緩解鹽脅迫對加工番茄葉片光合作用的限制，提高植物抗性。

葉綠素熒光主要來源于在PSⅡ中的葉綠素a，幾乎所有的光合過程變化都會通過葉綠素熒光反映出來。近年來諸多研究顯示鹽脅迫能引起植物產生復雜的生理生化反應，對植物葉綠體的光合器官造成傷害, 使PSII反應中心受損[28-30]，高鹽度和長時間的鹽脅迫可能會使從天線復合體到PSII反應中心的激發(fā)能量轉移增加而導致Fo的顯著下降。高鹽度使電子轉移到PSII受體一側的效率受到了抑制從而降低Fm[31]。快速葉綠素熒光誘導動力學曲線包含了大量關于PSⅡ反應中心原初光化學反應的信息，通過對曲線中各個參數的分析可以深入了解環(huán)境條件對光合機構(主要是PSⅡ供體側、受體側和反應中心)的影響[32],其曲線中的O、J、I、P相表現出明顯差異的熒光參數，可以反映鹽脅迫對植物PSII的傷害情況[21]。

本研究結果表明鹽脅迫會降低Fo和Fm，導致光合作用受到抑制。同時在針對不同階段葉綠素熒光時，O-J、J-I和I-P步驟隨著鹽脅迫下不同濃度的CO處理改變，其中ΔVOK和ΔVOJ的變化代表了外源噴施CO后在鹽脅迫下加工番茄可以更好地激發(fā)能量利用效率，緩解氧復合體(OEC)損傷和PSII供體光抑制，使葉綠體有更好的系統(tǒng)穩(wěn)定性。另外根據對活性反應中心RC和受光單位面積CSm來看，ABS/RC、ABS/CSm等參數明顯降低，可能歸因于活性反應中心天線尺寸的增加，此結果與Goussi等[21]在擬南芥中的研究中5 d時中等鹽脅迫下的結果相同，這表明PSII活性反應中心的穩(wěn)定性與植物對鹽脅迫反應有關；而本研究中外源施加CO處理H1與其低鹽脅迫5 d下趨勢一致，外源CO對鹽脅迫下加工番茄受到的傷害有緩解作用，因此認為外源CO可能是通過提高活性反應中心天線尺寸和穩(wěn)定性來緩解鹽脅迫對光系統(tǒng)的傷害。此外本研究認為鹽脅迫下加工番茄性能參數(PIABS)的提高是由于植物抵御鹽脅迫時產生了自我保護機制，且外源施加CO可以進一步提高自我保護機制的效果，緩解鹽脅迫對加工番茄的傷害。

4 結 論

對鹽脅迫下加工番茄外源施用CO可以通過提高活性反應中心天線尺寸和穩(wěn)定性，更好地激發(fā)能量利用效率，緩解鹽脅迫對PSⅡ反應中心的損傷，激活自我保護機制(葉綠素含量提高、滲透性調節(jié)物質積累)，降低鹽脅迫對植物細胞的損傷(MDA、相對電導率降低)，提高葉片的光合能力(Pn上升)，緩解鹽脅迫對加工番茄葉片光合作用的限制，增加干物質積累，進而提高植物抗性，有效緩解脅迫對加工番茄幼苗生長的抑制。