巨噬細(xì)胞極化調(diào)控頜骨再生的研究進(jìn)展*

劉琨 羅新 李君 孟春秀 張玉玨 呂兆勇 劉鳳珍 張彬

頜骨缺損通常源于腫瘤、創(chuàng)傷、炎癥或先天畸形等，嚴(yán)重影響患者面部美觀和咀嚼、發(fā)音等功能，降低了患者的生活質(zhì)量。頜骨缺損的修復(fù)一直是困擾口腔臨床醫(yī)生及科研人員的難題。

近年來，生物醫(yī)用材料與干細(xì)胞和各種生長(zhǎng)因子結(jié)合的骨組織工程是近幾年頜骨修復(fù)研究的熱點(diǎn)。在人工骨生物材料植入頜骨后，免疫細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞在骨組織再生修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。其形成的免疫微環(huán)境對(duì)成骨的影響等，已成為骨修復(fù)相關(guān)領(lǐng)域的焦點(diǎn)問題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）具有成脂、成骨、成軟骨的多向分化潛能，在骨組織愈合過程中起到重要的作用。巨噬細(xì)胞與BMSCs之間的相互作用影響骨組織再生修復(fù)。

本文我們總結(jié)了頜骨缺損修復(fù)重建過程中，不同極化表型的巨噬細(xì)胞對(duì)缺損區(qū)BMSCs 成骨分化的調(diào)控作用及其機(jī)制探索，為骨組織工程或原位骨組織再生的臨床應(yīng)用提供新的創(chuàng)新點(diǎn)。

1.巨噬細(xì)胞在頜骨再生中的作用

骨組織工程修復(fù)頜骨缺損，生物材料植入后必然經(jīng)歷免疫應(yīng)答的幾個(gè)階段：致敏階段、反應(yīng)階段、效應(yīng)階段［2］。在所有免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞作為關(guān)鍵的抗原識(shí)別和提呈細(xì)胞，參與了細(xì)胞免疫和體液免疫全過程。巨噬細(xì)胞可以通過改變其表型和生理活性來對(duì)外界環(huán)境的改變進(jìn)行應(yīng)答［3］。在組織損傷發(fā)生后，巨噬細(xì)胞首先表現(xiàn)經(jīng)典活化型（M1型），M1型巨噬細(xì)胞能夠引發(fā)炎癥和機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，另外CXCL8，CCL2，CCL3 等相關(guān)趨化因子和TNF-α,IL-1β,IL-6 等相關(guān)促炎因子是由M1型巨噬細(xì)胞合成分泌的。然后，巨噬細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N抗炎表型（M2型），由M2型巨噬細(xì)胞分泌的PDGF，F(xiàn)GF，IL-10，TGF-β 等相關(guān)因子，可以抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)局部組織修復(fù)的作用［4,5］。

骨組織的再生修復(fù)是一種多細(xì)胞多因子多步驟，發(fā)生時(shí)序性行為的結(jié)果。巨噬細(xì)胞可被招募至炎癥部位，吞噬和消化細(xì)胞殘片和病原菌，并激活淋巴細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞，對(duì)病原體作出反應(yīng)。BMSCs 具有向成骨細(xì)胞分化的潛能，在骨組織愈合過程中發(fā)揮重要的作用。

膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨是兩種常見的成骨方式，其中來源于外胚層的頜骨，主要是以膜內(nèi)成骨的方式發(fā)育成骨。而以軟骨內(nèi)成骨方式發(fā)育成骨的長(zhǎng)骨來源于中胚層。與長(zhǎng)骨相比，頜骨的BMSCs 具有部位特異性，具有自我更新能力、成骨能力以及血管生成能力，并隨著年齡的增加其增殖和成骨分化的功能強(qiáng)于長(zhǎng)骨［6］。巨噬細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)BMSCs 的成骨分化在維持骨穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)骨修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)對(duì)BMSCs成骨的影響

巨噬細(xì)胞在骨穩(wěn)態(tài)中起到重要的作用，M1 和M2型巨噬細(xì)胞分別作用于骨修復(fù)的不同時(shí)期。M1型巨噬細(xì)胞作用于骨修復(fù)的早期，影響骨的形成。M2型巨噬細(xì)胞作用于骨修復(fù)的中后期，能夠促進(jìn)新骨的形成。初期M1型巨噬細(xì)胞的炎性程度和炎性時(shí)間長(zhǎng)短、中期M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換為M2型巨噬細(xì)胞的時(shí)間，以及后期M2 巨噬細(xì)胞的調(diào)控都是影響骨再生的關(guān)鍵因素［7］。

2.1 巨噬細(xì)胞對(duì)于維持骨穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)骨修復(fù)至關(guān)重要 骨組織的修復(fù)始于炎癥，炎癥類型的轉(zhuǎn)換決定骨組織修復(fù)的結(jié)果。巨噬細(xì)胞在骨組織再生修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，巨噬細(xì)胞-BMSCs相互作用有利于骨組織再生修復(fù)。Vi L 等［8］發(fā)現(xiàn)敲除巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因小鼠在發(fā)育過程中會(huì)發(fā)生早期骨骼生長(zhǎng)遲緩和進(jìn)行性骨質(zhì)疏松，此外，巨噬細(xì)胞的敲除導(dǎo)致BMSCs 數(shù)量減少60%，并使這些細(xì)胞的成骨能力下降。He XT 等［9］研究發(fā)現(xiàn)小鼠M1 巨噬細(xì)胞上清能夠增強(qiáng)小鼠BMSCs 的增殖和成脂分化能力，且巨噬細(xì)胞能促進(jìn)BMSCs 的成骨分化，M2型巨噬細(xì)胞上清在一定程度上也促進(jìn)了BMSCs的成骨分化潛能。

2.2 骨愈合早期，短暫的炎癥微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞促進(jìn)成骨活動(dòng) 骨生物材料植入體內(nèi)，最初的炎癥反應(yīng)和促炎性M1 巨噬細(xì)胞活化有助于將BMSCs、骨祖細(xì)胞和血管祖細(xì)胞募集到缺損部位。同時(shí)M1 巨噬細(xì)胞會(huì)分泌相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子，以往的研究認(rèn)為M1巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成并增強(qiáng)其活性，從而導(dǎo)致骨質(zhì)吸收。但是，最近的一些研究證實(shí)M1 巨噬細(xì)胞能起到促進(jìn)成骨的作用。

斯坦福大學(xué)的Stuart B.Goodman教授課題組的系列研究中［10,11］，將小鼠BMSCs與M1、M2型巨噬細(xì)胞體外共培養(yǎng)，研究表明骨形成過程取決于最初的M1介導(dǎo)的促炎期，然后是M2介導(dǎo)的抗炎期。72至96小時(shí)的促炎環(huán)境對(duì)于最佳基質(zhì)礦化至關(guān)重要。另外，Sadowska JM［12］將巨噬細(xì)胞系RAW264.7與羥基磷灰石、β-磷酸三鈣兩種材料共培養(yǎng)，然后將上清用于人BMSCs的成骨誘導(dǎo)，研究表明羥基磷灰石能夠引起共孵育的巨噬細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子，且更有效地上調(diào)BMSCs 中Ⅰ型膠原生成和成骨基因（Runx2）表達(dá)。這表明生物材料在體內(nèi)的局部炎性微環(huán)境也影響了生物材料的成骨分化。Lei H等［13］用脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化，并與BMSCs共培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞顯著增強(qiáng)了BMSCs的遷移和成骨能力，并且甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）表達(dá)上調(diào)。當(dāng)METTL3的表達(dá)被敲低時(shí)，情況正好相反。因此，M1巨噬細(xì)胞通過分泌METTL3誘導(dǎo)BMSCs成骨分化和遷移。

以上結(jié)果表明，初期炎癥階段對(duì)于增強(qiáng)骨形成至關(guān)重要，在骨修復(fù)早期存在的炎癥性M1巨噬細(xì)胞有助于骨形成。但是牙周炎或者骨髓炎等炎性狀態(tài)下會(huì)引起M1巨噬細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生大量促炎性細(xì)胞因子，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)和成骨細(xì)胞活性被抑制而導(dǎo)致骨吸收。Zhou LN等［14］在人牙周炎的牙齦樣本中可觀察到M1巨噬細(xì)胞數(shù)量更多（M1/M2比例更高），并且TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-12水平明顯比正常牙齦升高。而牙周炎組織中更高程度的M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)影響牙周炎的恢復(fù)并且導(dǎo)致牙槽骨的吸收。因此，M1介導(dǎo)的炎癥的持續(xù)時(shí)間很關(guān)鍵，短暫的急性炎癥是有益的，而慢性炎癥對(duì)骨骼的愈合非常不利。

2.3 骨愈合中后期，M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)BMSCs成骨分化M2巨噬細(xì)胞主要是在成骨中后期發(fā)揮作用。M1巨噬細(xì)胞的存在會(huì)導(dǎo)致纖維囊的形成。如果M1巨噬細(xì)胞可以有效地向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，則能促進(jìn)骨生成型細(xì)胞因子釋放更多，形成新生骨組織［15］。

Zhang Y等［16］發(fā)現(xiàn)，M2巨噬細(xì)胞與MSCs共培養(yǎng)后，能增強(qiáng)MSCs的礦化作用。Loi F等［17］分別將M0、M1和M2原代小鼠巨噬細(xì)胞和小鼠前體成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞共培養(yǎng)，以研究未激活的M0，促炎性M1和組織再生M2巨噬細(xì)胞對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞體外成骨能力的影響。結(jié)果表明，M0,M1和M2巨噬細(xì)胞均可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨能力。接種后72小時(shí)，IL-4誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞，可以進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)MC3T3-E1的成骨作用。Zhang JK等［18］合成負(fù)載IL-4的富鈣水凝膠，并在體內(nèi)外評(píng)估了水凝膠對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響及巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)對(duì)BMSCs成骨分化的影響。研究表明，水凝膠不但能夠促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化，而且還可以高表達(dá)TGF-β 1，然后激活TGF-β1/Smad信號(hào)通路，進(jìn)而促骨再生。

以上研究表明，在骨愈合后期，M2巨噬細(xì)胞可通過與BMSCs相互作用促進(jìn)骨形成。這樣提示，巨噬細(xì)胞可塑性會(huì)提供新的策略來調(diào)節(jié)生物材料植入體內(nèi)后的局部炎癥微環(huán)境，從而潛在地增強(qiáng)骨骼修復(fù)。

3.巨噬細(xì)胞與BMSCs細(xì)胞之間的調(diào)控機(jī)制

巨噬細(xì)胞與BMSCs兩種細(xì)胞，相互作用的途徑包括：細(xì)胞間直接接觸、供體細(xì)胞分泌蛋白或分泌囊泡運(yùn)輸?shù)绞荏w細(xì)胞，調(diào)控受體細(xì)胞的生物學(xué)功能。調(diào)控的方式多種多樣，可以通過信號(hào)通路調(diào)控下游基因，也可以通過影響轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等，或者配體受體結(jié)合、非編碼基因的調(diào)控等多種方式［19］。

3.1 細(xì)胞間直接接觸或分泌細(xì)胞因子 巨噬細(xì)胞與BMSCs細(xì)胞間的通訊方式可以通過直接共培養(yǎng)，利用細(xì)胞直接接觸來進(jìn)行調(diào)控［20］。巨噬細(xì)胞也可以通過其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子調(diào)控BMSCs的成骨分化，這也是目前主要的研究方向［10-13］。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）、OSM等，它們可通過調(diào)節(jié)BMSCs中主要的成骨分化信號(hào)通路影響骨形成。

Romero-López M等［20］在體外模型中，將巨噬細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)，將其誘導(dǎo)成骨分化，觀察巨噬細(xì)胞對(duì)新骨形成的影響。結(jié)果顯示，與單獨(dú)的BMSCs相比，不同類型的巨噬細(xì)胞均增加了成骨分化，促炎性M1巨噬細(xì)胞最有效地增強(qiáng)了新骨的形成。這項(xiàng)研究說明了細(xì)胞間的互相接觸在骨組織形成中的重要作用。Lu LY等［10］將極化后的小鼠原代巨噬細(xì)胞與BMSCs，按照播種密度5∶1進(jìn)行直接共培養(yǎng)并誘導(dǎo)成骨。所有巨噬細(xì)胞-BMSCs共培養(yǎng)物中的骨礦化都增加了，并且促炎性M1巨噬細(xì)胞-BMSCs共培養(yǎng)物中最為顯著。M1巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)的初始促炎期與成骨早期的前列腺素E2（PGE2）分泌密切相關(guān)，通過COX-2-PGE2途徑促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的成骨作用。

3.2 供體細(xì)胞分泌囊泡運(yùn)輸?shù)绞荏w細(xì)胞 除了細(xì)胞間的接觸和分泌細(xì)胞因子外，巨噬細(xì)胞還可以通過旁分泌囊泡調(diào)節(jié)成骨。旁分泌的囊泡中，外泌體起到了非常重要的作用。外泌體的粒徑大小在30-150 nm之間，是細(xì)胞間通訊的重要載體［21］。巨噬細(xì)胞外泌體可以攜帶微小RNA（miRNAs）、蛋白、脂質(zhì)等小分子在巨噬細(xì)胞與BMSCs之間進(jìn)行信息交換，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨重塑相關(guān)信號(hào)通路［22］。不同極化狀態(tài)巨噬細(xì)胞的外泌體，可以對(duì)成骨分化發(fā)揮不同的調(diào)控作用。

在炎癥初期，M1型巨噬細(xì)胞的外泌體調(diào)控成骨分化。Xia Y［23］等用不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向M1或M2極化，并從非極化（M0）和極化（M1和M2）巨噬細(xì)胞中分離出外泌體。然后用正常培養(yǎng)基和補(bǔ)充有M0、M1、M2外泌體的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠BMSCs，測(cè)定并分析了BMSCs的成骨分化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來源于M1巨噬細(xì)胞的外泌體促進(jìn)了細(xì)胞的成骨分化。另有研究表明［24］，LPS刺激的人外周血單核細(xì)胞釋放外泌體培養(yǎng)MSCs 72小時(shí)后，成骨相關(guān)基因Runx2和BMP-2的表達(dá)。

中后期，M2 巨噬細(xì)胞外泌體調(diào)控成骨分化。Kang MY等［25］研究了M0、M1和M2極化巨噬細(xì)胞衍生的外泌體在骨修復(fù)中的作用。用M0、M1或M2來源的外泌體分別處理大鼠顱骨缺損，在3周和6周時(shí)發(fā)現(xiàn)M0 和M2分泌的外泌體促進(jìn)骨修復(fù)。Xiong Y等［26］發(fā)現(xiàn)miR-5106在M2巨噬細(xì)胞衍生的外泌體中明顯過表達(dá)，并且靶向SIK2 和SIK3 基因來誘導(dǎo)BMSCs 成骨分化。此外，向骨折部位局部注射miR-5106 激動(dòng)劑或M2 巨噬細(xì)胞外泌體加速骨折愈合。

巨噬細(xì)胞外泌體可以被受體細(xì)胞BMSCs攝取，通過其攜帶的miRNAs等物質(zhì)，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要的作用［26］。但是，巨噬細(xì)胞外泌體被BMSCs攝取并調(diào)控成骨的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4.免疫調(diào)節(jié)在頜骨再生中的應(yīng)用

通過免疫調(diào)節(jié)促進(jìn)骨骼愈合的方法，可以利用預(yù)處理MSCs 以增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)特性。預(yù)處理的MSCs首先與促炎細(xì)胞因子一起培養(yǎng)或暴露在缺氧條件下幾天以模擬炎癥微環(huán)境，然后再將其用于體外和體內(nèi)研究。這與骨生物材料在植入初期時(shí)，短暫的炎癥階段增強(qiáng)骨形成的觀點(diǎn)是一致的。Lu ZF等［27］研究表明，人脂肪MSCs分泌的外泌體能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。用腫瘤壞死子-α（TNF-α）處理脂肪組織MSCs，3天后，觀察到MSCs分泌的外泌體能增強(qiáng)人成骨細(xì)胞的增殖和分化，這模擬了骨骼愈合的急性炎癥初期。

其次，可以通過骨生物材料修飾，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2極化來增強(qiáng)骨再生。Chen ZT等［28］強(qiáng)調(diào)了免疫應(yīng)答在生物材料介導(dǎo)成骨過程中的重要性，并討論了骨生物材料關(guān)于骨免疫調(diào)節(jié)性能的評(píng)價(jià)策略。目前關(guān)于生物材料引起的免疫反應(yīng)對(duì)成骨的影響，主要集中在通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2極化來增強(qiáng)骨骼再生的可能性［29,30］。Qiao W等［31］在大鼠股骨缺損模型中使用釋放Mg2+的藻酸鹽水凝膠修復(fù)骨缺損，證明生物材料周圍單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-破骨細(xì)胞譜系的連續(xù)激活，促進(jìn)骨再生的生物學(xué)過程。對(duì)于骨生物材料在骨形成過程中的免疫調(diào)節(jié)，適宜的免疫反應(yīng)可以營(yíng)造促骨形成的微環(huán)境，而不利的免疫反應(yīng)則可能誘發(fā)慢性炎癥，影響骨組織的愈合。

另外，還可以利用生物材料負(fù)載細(xì)胞因子或外泌體等，進(jìn)行組織工程骨修復(fù)骨缺損。部分細(xì)胞因子對(duì)成骨的調(diào)控作用取決于所用劑量和時(shí)間，適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子的濃度和時(shí)間有利于誘導(dǎo)成骨，不當(dāng)?shù)膭┝亢蜁r(shí)間會(huì)導(dǎo)致骨吸收。Zhao DW等［32］使用不同濃度的IL4為3D打印鈦種植體周圍的BMSCs成骨和巨噬細(xì)胞極化創(chuàng)造仿生環(huán)境。結(jié)果表明，3D打印鈦植入物結(jié)合30 ng/ml IL4從第3天到第7天調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2極化以促進(jìn)骨再生。這將為我們把巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和外泌體進(jìn)行骨組織工程的臨床轉(zhuǎn)化，提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

5.研究展望

骨生物材料植入的初期炎癥階段，M1 巨噬細(xì)胞清除部分碎屑并啟動(dòng)骨修復(fù)。隨著巨噬細(xì)胞由M1型轉(zhuǎn)化為M2型，新生骨組織逐漸形成。但是，巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或外泌體的最佳作用劑量和時(shí)間，適當(dāng)?shù)臐舛群瓦f送方法對(duì)成骨的影響仍然需要精準(zhǔn)化。因此，應(yīng)在今后研究中進(jìn)一步評(píng)估使用骨生物材料修飾、細(xì)胞因子和外泌體的序貫緩釋、預(yù)處理BMSCs，或這些策略的組合，用以調(diào)控骨愈合過程。