擴增型和非擴增型CRISPR/Cas系統(tǒng)在食源性致病菌快速檢測領域應用的研究進展

徐文星，邵艷娜，吳清平，王 涓，張菊梅，丁 郁*

（1.廣東省科學院微生物研究所，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物安全與健康重點實驗室，農業(yè)農村部農業(yè)微生物組學與精準應用重點實驗室，廣東 廣州 510070；2.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632；3.華南農業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642）

食源性致病菌是全球范圍內導致食品安全問題的重要因素[1]，其引發(fā)的食品安全事件日益增多，可能造成嚴重的健康問題和經濟損失，目前常見的食源性致病菌包括大腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌等[2-4]，它們通常引起腹痛、腹瀉以及嘔吐等癥狀，嚴重時還會造成死亡。世界衛(wèi)生組織調查發(fā)現，在全球范圍內每年約有6億 例食源性疾病發(fā)生，其中有42萬 人因此死亡[5-6]。2011年5—7月，歐洲暴發(fā)了由腸出血性大腸桿菌O104:H4污染豆芽菜引起的中毒感染[7-9]。2015—2018年，在奧地利、丹麥、芬蘭、英國瑞典等國家出現單核細胞增生李斯特菌污染冷凍玉米，由此引起了持續(xù)性的食源性疾病暴發(fā)[10-11]。2016—2020年，歐洲18 個國家暴發(fā)了由腸炎沙門氏菌引起的食源性疾病，這是有史以來歐洲報道的規(guī)模最大的一次食源性疾病案例[1]。因此，盡早的發(fā)現食源性致病菌是防止食源性疾病暴發(fā)的有效手段?；诩毎囵B(yǎng)的方法雖然一直以來被認為是檢測的金標準，但其分析檢測耗時久（有時長達7 d），并且操作過程繁瑣，難以滿足目前的快速檢測需求。此外，基于核酸檢測的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）以及基于免疫反應的酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）也是較常用的細菌檢測方式（圖1）。雖然它們所需檢測時間短于傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)，但其檢測成本較高，仍難以實現高效、快速的現場檢測。因此，開發(fā)新型快速高效檢測食源性致病菌的技術是目前亟待解決的重要問題。成簇的間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）組成的CRISPR/Cas系統(tǒng)可以通過核酸“指導”的堿基配對方式介導核酸酶對靶標的識別[12]，從而實現對外來核酸的特異性切割，因此，可以通過人工合成向導序列實現對不同目標物的檢測。

圖1 常規(guī)免疫檢測及核酸檢測原理Fig.1 Principles of routine immunoassay and nucleic acid detection

CRISPR/Cas系統(tǒng)是廣泛存在于細菌和古細菌中的一類適應性免疫系統(tǒng)，其免疫反應主要由3 個階段組成：適應、表達和干擾。在適應過程中，外源核酸序列被整合到CRISPR的間隔區(qū)域。在表達和干擾階段，CRISPR基因座轉錄釋放CRISPR RNA（crRNA）以引導Cas蛋白識別和切割降解外源核酸[13-14]。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要分為兩類[15]：1）具有多亞基效應器，每種蛋白發(fā)揮單一功能[16]；2）由不同的遺傳元件編碼的核酸酶[17]，如常用于致病菌檢測的Cas9、Cas12、Cas13[18]。其中，Cas9蛋白具有類似HVH和RuvC兩個核酸酶的結構域。當crRNA與反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）通過堿基互補配對形成二元復合物小向導RNA（small guide RNA，sgRNA）時，可以識別含有NGG（其中N為任意核苷酸）、大約20 個核苷酸的前間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。通過堿基配對識別目標雙鏈DNA，引導Cas9核酸酶對目標雙鏈DNA的切割。與Cas9不同的是，dCas9由于HVH、RuvC核酸酶結構域失活而不具有切割活性，但其sgRNA仍然對于目標DNA具有較強的特異性結合活性。Cas12a具有單個的RuvC核酸酶結構域，crRNA對富含T的PAM序列靶標雙鏈DNA進行特異性識別和結合，激活Cas12a的反式切割活性，從而對單鏈DNA進行非特異性切割。與Cas12a類似，Cas13a也是在crRNA與靶標單鏈RNA結合后激活其對核酸的非特異性反式切割活性，但其具有兩個HEPN結構域，識別的原間隔子側翼位點的3＇-端核苷酸不能為鳥嘌呤。目前CRISPR/Cas系統(tǒng)由于其檢測范圍廣、反應時間短、材料成本低以及靈敏度高等優(yōu)勢已被廣泛應用于食源性致病菌的檢測中。Zhang Ting等[19]通過CRISPR/Cas13a系統(tǒng)實現了對蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌等幾種活的致病菌的檢測，檢出限可達10 CFU?；贑RISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測一般需要通過核酸提取、核酸擴增、信號生成、信號輸出4 個步驟[20]。如圖2所示，通過PCR或等溫擴增等技術對靶標的擴增可以有效提高檢測靈敏度，但是這一過程不僅需要耗費大量的時間，而且存在氣溶膠污染的風險[21]。因此，開發(fā)免擴增的CRISPR檢測系統(tǒng)受到研究者的廣泛青睞。Sha Yong等[22]開發(fā)了CRISPR/Cas級聯(lián)信號放大系統(tǒng)，無需核酸擴增即可達到1.33×10-15mol/L的檢出限。本實驗室在CRISPR/Cas系統(tǒng)快速檢測食源性致病菌領域積累了較豐富的研究成果，目前基于CRISPR/Cas12a技術已實現單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌核酸檢測平臺的搭建[23-26]，通過合理設計crRNA實現不同Cas系統(tǒng)在多種病原菌核酸檢測中的應用[24]?；谝陨涎芯砍晒约按罅课墨I，本文介紹基于核酸擴增和免核酸擴增的CRISPR/Cas系統(tǒng)在食源性致病菌檢測中的研究進展，并討論它們的優(yōu)勢、局限性以及未來的發(fā)展前景，以期為CRISPR/Cas系統(tǒng)在食源性致病菌檢測領域的深入研究提供理論基礎。

圖2 不同類型CRISPR/Cas檢測食源性致病菌的工作流程Fig.2 Workflow of different CRISPR/Cas systems for the detection of foodborne pathogens

1 基于恒溫擴增的CRISPR/Cas核酸檢測技術

為了獲得更高的檢測靈敏度，通常將核酸擴增技術與CRISPR/Cas系統(tǒng)聯(lián)用[27-28]。常規(guī)的PCR技術對溫度控制有較高的要求，所需儀器設備價格昂貴，而目前發(fā)展迅速的等溫核酸擴增技術，不需要加熱循環(huán)且反應時間短，成為傳統(tǒng)PCR良好的替代技術[29]。如表1所示，常用于CRISPR/Cas系統(tǒng)的等溫擴增技術包括LAMP[30]、RPA[31]、RCA[32]以及NASBA[33-34]等。LAMP是一種基于BstDNA聚合酶進行大片段循環(huán)鏈置換DNA合成的技術，它可以在恒溫條件下完成擴增反應[35]。Li Linxian等[36]將CRISPR/Cas12b與LAMP結合，開發(fā)了一種低成本多用途的高效快速核酸檢測系統(tǒng)（one-hour low-cost multipurpose highly efficient system，HOLMES），實現了一步法對靶標核酸進行定量分析，其檢測原理如圖3所示。與LAMP相比，RPA技術只需一對引物即可完成擴增，SHINE一步反應系統(tǒng)（streamlined highlighting of infections to navigate epidemics）[37]基于RPA擴增和CRISPR/Cas13檢測實現對SARS-Cov-2的測定，其中將擴增和檢測簡化為一步反應，縮短了檢測時間，并且可以達到90%的靈敏度和100%的特異性。該系統(tǒng)具有紙基比色和熒光兩種信號讀取方式，熒光信號可以通過手機應用程序完成讀取。Wang Ruixuan等[38]建立了RCA輔助CRISPR/Cas9切割（RCA-assisted CRISPR/Cas9 Cleavage，RACE）核酸檢測平臺，實現了對外膜囊泡中microRNA的高度特異性檢測及單堿基分辨，并且可以同時定量幾個外膜囊泡衍生的miRNA。NASBA是一種RNA等溫擴增技術，可以在41 ℃下完成反應，無需熱循環(huán)儀器[39]，當NASBA與CRISPR/Cas結合使用時，可以實現10-15mol/L寨卡病毒RNA的檢測[40]。

表1 幾種基于等溫擴增的CRISPR/Cas體系Table 1 Several CRISPR/Cas systems based on isothermal amplification

圖3 HOLMESv2的工作原理及應用場景[36]Fig.3 Working principle and application scenarios of HOLMESv2[36]

CRISPR/Cas與等溫擴增聯(lián)用技術也廣泛應用于食源性致病菌的檢測中。例如研究人員將CRISPR/Cas9與等溫指數擴增反應相結合，建立CAS-EXPAR平臺[41]。在該系統(tǒng)中，結合了Cas9對單向導RNA（sgRNA）的特異性切割活性和指數擴增反應（exponential amplification reaction，EXPAR）快速擴增的優(yōu)勢。以Cas切割DNA片段為引物，無需外源添加引物即實現了對單核細胞增生李斯特菌的特異性檢測，靶標核酸物質檢出限可達8.2×10-19mol/L。Zhou Baoqing等[26]利用CRISPR/Cas12a的側向流動檢測分析成功實現了金黃色葡萄球菌的快速檢測。在該項研究中，基于CRISPR/Cas12a的側向流動檢測裝置與熒光量子點QD相結合，當靶標DNA存在時，通過重組酶介導的等溫擴增（recombinase aid amplification，RAA）獲得特定的dsDNA產物，并激活Cas/crRNA的反式裂解活性。被降解的探針未能與檢測線上的捕獲探針相結合從而導致沒有信號積累，而質控線具有明顯的熒光信號。此外，CRISPR/Cas12a結合RPA可以高精度的完成炭疽芽孢桿菌的檢測以及沙門氏菌毒力基因和耐藥基因的雙重檢測[42-43]。CRISPR/Cas14a1與不對稱核酸擴增相結合，可以實現牛奶中多種致病菌的檢測[44]。

目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)與核酸擴增聯(lián)用技術在食源性致病菌中的應用研究中逐漸增加，這些研究建立了多種食品快速檢測平臺，實現了食源性致病菌的精準、快速及高效檢測。相對于傳統(tǒng)的PCR和實時熒光定量PCR檢測，在核酸擴增的后端加入高效的檢測工具——Cas蛋白，在很大程度上提升了檢測的靈敏度和特異性。CRISPR/Cas系統(tǒng)與等溫擴增技術聯(lián)用建立的一系列檢測平臺有效地克服了傳統(tǒng)PCR需要昂貴的熱循環(huán)儀器等缺陷，但將核酸擴增這一步驟引入CRISPR/Cas系統(tǒng)中增加了檢測的復雜度，同時降低了CRISPR體系的優(yōu)勢，而僅體現出它在特異性方面的優(yōu)勢。此外，部分基于擴增的CRISPR/Cas檢測平臺中擴增和檢測是割裂的兩部分，容易發(fā)生污染而造成假陽性，影響檢測結果的準確性。因此，開發(fā)免核酸擴增的CRISPR/Cas系統(tǒng)是目前解決這一問題的有效途徑。

2 免擴增的CRISPR/Cas核酸檢測技術

目前基于免核酸擴增的CRISPR/Cas體系主要分為以下3 類[21]（表2）：1）微容量的CRISPR/Cas系統(tǒng)。通過減小反應體系體積和核酸擴增來增加靶標濃度，反應體系中的靶標濃度是影響Cas蛋白切割活性和效率的重要因素；2）生物傳感器。將Cas蛋白的反式切割活性與電化學生物傳感器串聯(lián)使用，傳感器收集微弱的信號，將其進行放大輸出，從而增加檢測體系的靈敏度；3）Cas介導的級聯(lián)放大系統(tǒng)通過對微弱信號分子的層級放大以實現對目標物質的高靈敏度檢測。目前基于免核酸擴增的CRISPR/Cas技術大多用于新型冠狀病毒SARS-Cov-2等傳播性病毒的檢測，針對食源性致病菌檢測的應用較少，其在食品快速檢測領域具有良好的應用前景。

表2 幾種免擴增CRISPR/Cas體系Table 2 Several amplification-free CRISPR/Cas systems

2.1 微室CRISPR/Cas系統(tǒng)

當靶標達到一定濃度時才可以被Cas蛋白識別并激活Cas蛋白的切割活性，例如Cas12a在存在10-11mol/L的DNA時才具有識別和切割能力[51]。Cas13a需要大約5×10-13mol/L的靶標RNA存在時才可以識別和切割[52]。CRISPR/Cas體系與核酸擴增技術相結合就是為了增加靶標物質的濃度，從而有效地被Cas蛋白識別并切割，但是擴增技術的引入無疑增加了污染風險并延長了檢測時間。為克服以上缺陷，Tian Tian等[53]建立了一種基于Cas13a的RNA檢測系統(tǒng)（圖4）。目標RNA觸發(fā)的Cas13a復合物被限制在細胞樣大小的反應器中，從而增加目標物的濃度。與微升體積的批量反應條件相比，所創(chuàng)建皮升體積的Cas13a系統(tǒng)檢測靈敏度提高了104倍以上，并且能夠實現靶標RNA的絕對定量。此外研究人員將CRISPR/Cas13a核酸檢測系統(tǒng)與微室技術相結合，減小反應體系的體積從而增大靶標濃度，建立了能夠在單分子水平上快速檢測ssRNA的SATORI（CRISPR-based amplification-free digital RNA detection）平臺，能夠快速靈敏地檢測SARS-Cov-2的全基因組RNA，檢出限可達5.7×10-15mol/L（3.4×106拷貝/mL），并可在5 min內完成反應[45]。與此同時，CRISPR/Cas12a反應體系與微室系統(tǒng)相結合，實現了單分子DNA水平的檢測[46]。因此，可以看出CRISPR/Cas系統(tǒng)與微室相結合可以實現對不同類型核酸的無擴增檢測，一些基于微室CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅無需核酸擴增，而且省略了核酸提取步驟，顯著節(jié)約了實驗材料及時間等成本，但目前這些研究大多局限于病毒的檢測，可能由于食品基質成分復雜，這項技術還未廣泛應用于食源性致病菌的檢測中。

圖4 基于CRISPR/Cas13a的微室RNA檢測系統(tǒng)[53]Fig.4 CRISPR/Cas13a-based microchamber RNA detection system[53]

2.2 CRISPR/Cas與生物傳感器聯(lián)用

Cas蛋白的切割活性由目標核酸物質激活[54]。當目標核酸物質濃度較低時，Cas蛋白具有較弱的切割活性，此時輸出的信號也是微弱的。CRISPR/Cas通常通過液相或半固相完成檢測，然后利用熒光讀數器對其產生的信號進行監(jiān)測?？紤]到大多數靶核酸初始濃度較低，導致無擴增的CRISPR/Cas系統(tǒng)可能產生較弱的反式切割活性，因此需要更靈敏的信號檢測方法來檢測微弱的輸出信號。生物傳感器具有靈敏度高、檢測時間短、儀器便攜等優(yōu)勢，與CRISPR/Cas系統(tǒng)聯(lián)用顯示出較大的優(yōu)勢[54-56]。

電化學生物傳感器將物理和生物技術相結合，兼具物理學的高靈敏度、高準確性和生物學的高特異性[57]，因而被廣泛應用于食品檢測領域。但電化學生物傳感器同時也存在潛在毒性、化學穩(wěn)定性較差等缺陷，與CRISPR/Cas技術的結合則可以有效地避免這些劣勢。最近，Li Ziyue等[58]開發(fā)的一種簡單、多功能、電場增強的電化學生物傳感器，可用于檢測溶液中的DNA靶標。通過脈沖電場富集電極表面的核酸，利用化學寡核苷酸探針和Cas蛋白之間對帶負電工作電極的擴散性差異，能夠實現簡單而靈敏的電化學檢測，對HPV-16病毒的檢測靈敏度為10-12mol/L?；贑as12a與亞甲基藍共軛的金納米粒子的電化學生物傳感器已被用于直接檢測許多其他病原體，例如登革熱病毒RNA檢出限為10-13mol/L[59]。通過將電化學生物傳感器與由Cas13a和催化發(fā)夾DNA電路組成的雙信號放大策略相結合，目標RNA的檢出限可達5×10-17mol/L[47]。Cas12a與銀金屬化、方波伏安法結合使用時可以檢測到3.5×10-15mol/L的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌RNA[48]。

此外，CRISPR/Cas系統(tǒng)與新型納米生物傳感器的聯(lián)用也是當前研究的一大熱點[60]。熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）傳感器是基于一定距離范圍內供體熒光基團的發(fā)射光譜和受體熒光基團的激發(fā)光譜重疊而產生的一種能量轉移現象[61]。結合CRISPR/Cas的反式切割活性，可以有效調節(jié)FRET中兩熒光基團之間的距離從而實現熒光的增強或猝滅。CRISPR/Cas與Cu納米粒子結合實現了對DNA的高靈敏度檢測[62]。研究人員以金納米粒子表面修飾熒光標記的DNA鏈形成的球形核酸作為熒光報告分子，當存在目標核酸時，激活Cas12a對熒光信號分子的反式切割活性，從而實現對目標核酸物質的靈敏檢測，檢出限可達10-14mol/L[63]。固態(tài)納米孔傳感器在檢測單分子方面也顯示出巨大潛力，是信號輸出放大的另一種方法。研究人員將Cas12a的高特異性和玻璃納米孔的高靈敏度有效結合，無需預擴增即可檢測高于10 nmol/L的目標核酸[64]。

除電化學、納米材料等生物傳感器外，CRISPR/Cas還與其他多種生物傳感器聯(lián)合使用。例如，將CRISPR/Cas9蛋白與石墨烯相結合也可以完成對核酸的檢測，這種生物傳感器被稱為CRISPR-Chip，它利用催化失活的Cas9蛋白的基因靶向能力與特定的sgRNA復合并固定在晶體管上，從而產生一種無標記核酸檢測裝置，其輸出信號可以用一個簡單的手持閱讀器測量，并可以實現15 min內完成檢測，靈敏度為1.7×10-15mol/L[49]。使用DFHBI-1T染料標記的RNA發(fā)光適配體，當目標RNA存在時，激活Cas13a的反式切割活性，使報告分子發(fā)生熒光猝滅[19]。由于RNA在體外易降解的特性，該體系可以實現對活細菌的檢測，且能夠實現在真實食品樣品中的檢測，其檢出限為10 CFU。

2.3 Cas介導的級聯(lián)放大系統(tǒng)

級聯(lián)放大是病毒、微生物檢測中常用的一種信號放大策略，因此也可用于CRISPR/Cas系統(tǒng)中。在目標核酸物質含量極低的情況下，引入級聯(lián)放大策略，也可有效地提高檢測靈敏度。研究人員將Cas13a和Cas14a結合在一起開發(fā)了casCRISPR系統(tǒng)，其中Cas13a反式切割的產物作為Cas14a的激活劑，并進一步觸發(fā)Cas14a的反式切割活性，放大輸出信號。casCRISPR系統(tǒng)的檢出限達到了1.33×10-15mol/L，比單獨使用Cas13a的靈敏度高1 000 倍[22]。Liu等[50]建立了通過將Cas13a和多亞基效應器Csm6串聯(lián)，實現了在20 min內對每微升大約30 個RNA分子的有效檢測。

除了以上方法外，還有很多其他信號放大策略可以與CRISPR/Cas系統(tǒng)串聯(lián)使用。例如，借助金屬增強熒光原理，將報告基因被切斷后釋放的熒光信號通過金納米粒子二次放大，實現對靶標核酸的高靈敏檢測[65]。借助電化學發(fā)光背景信號低的優(yōu)點建立的免擴增CRISPR-Dx，可以實現10-15mol/L靶標核酸的檢測[66]。通過將由酶催化引起顏色變化的辣根過氧化物酶/3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺反應和CRISPR/dCas9對病毒裂解物中RNA的特異性識別相結合，建立了一種基于比色分析的CRISPR病毒檢測平臺[67]。

3 結 語

針對CRISPR/Cas系統(tǒng)的早期研究關注其作用機制及在基因編輯中的應用。隨著研究的深入，CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性識別結合能力與核酸切割能力逐漸被深刻認識，目前CRISPR/Cas已成為一種有效的核酸檢測工具，迄今為止，已經利用Cas9、Cas12和Cas13蛋白的切割活性以及Cas12和Cas13蛋白的反式切割活性開發(fā)了多種基于CRISPR/Cas的生物傳感器[49]。伴隨CRISPR技術的成熟，研究人員通過結合納米技術和各種生物傳感器技術，實現了檢測信號的放大，極大地提高了檢測的靈敏度，目前已將各種信號放大策略如微室系統(tǒng)、電化學生物傳感器、級聯(lián)放大反應等技術手段結合到CRISPR/Cas系統(tǒng)中，不僅使檢測靈敏度和特異性明顯提高，而且檢測對象也從核酸擴展到離子、小分子、蛋白質、酶、外泌體、細菌、病毒等[68-69]。幾種較為典型的擴增型和非擴增型CRISPR/Cas系統(tǒng)的特點如表3所示。

表3 擴增型和非擴增型CRISPR/Cas系統(tǒng)對比Table 3 Comparison of amplified and non-amplified CRISPR/Cas systems

雖然目前CRISPR/Cas系統(tǒng)在快速檢測領域取得了較為顯著的成就，但其發(fā)展過程中還存在一些困難，需要進一步探索。目前大多數的CRISPR/Cas檢測技術仍集中在核酸檢測領域，非核酸靶點的檢測還處于起步階段，因此對于非核酸靶點的檢測仍有待深入。此外，Cas蛋白的基本性質也有待進一步研究。近年來的研究表明，通過引入輔因子或修飾向導RNA可以提高Cas蛋白的切割活性，也可能為基于CRISPR/Cas的生物傳感系統(tǒng)的設計提供新思路[69-71]。隨著新特性的不斷發(fā)現，現有傳感系統(tǒng)的性能會進一步提高，甚至開發(fā)出一些新的生物傳感器。此外，大多數的基于CRISPR/Cas的生物傳感器都面臨著高背景信號的挑戰(zhàn)[72-73]，尤其是在使用相對較長的反應時間時，降低背景值也是亟待解決的關鍵問題之一。

目前較為先進的CRSIPR/Cas檢測體系大多用于病毒的快速高效檢測，在食源性致病菌檢測中的應用較少且多為基礎的CRISPR/Cas平臺，大多數檢測方法需要核酸提取及擴增的步驟，操作復雜甚至會影響檢測的準確性。此外，目前利用CRISPR/Cas系統(tǒng)檢測食源性致病菌多數針對單一病原菌，而實現多重病原菌檢測可有效提高效率。