糖尿病腎病中微小RNA在腎臟內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的調(diào)控機(jī)制

袁蕓 李宇宸 楊璐瑤 胡瓊英

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 1附屬醫(yī)院檢驗科，四川 成都 611137；2醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院)

內(nèi)皮細(xì)胞是一種呈多邊形厚度極薄的扁平狀細(xì)胞，由其嵌合排列組成毛細(xì)血管、小動脈、動脈、靜脈和淋巴管等血管結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面，參與調(diào)節(jié)和維持血管通透性及物質(zhì)交換的過程〔1〕。特殊情況下，完全分化的內(nèi)皮細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化為其他類型細(xì)胞的可塑性，內(nèi)皮細(xì)胞被生長因子刺激后發(fā)生形態(tài)功能變化，獲得間充質(zhì)樣標(biāo)志物，這一過程稱為內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)〔2〕。機(jī)體在纖維化過程中，由成纖維細(xì)胞組成的纖維化組織不受控制地過度積累，同時分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，導(dǎo)致器官發(fā)生進(jìn)行性功能障礙〔3〕。研究表明，腎纖維化主要成分成纖維細(xì)胞的來源除駐留在原地維持正常器官組織的成纖維細(xì)胞(50%)外，還包括來自骨髓的前體纖維細(xì)胞(35%)及從內(nèi)皮細(xì)胞(10%)和上皮細(xì)胞(5%)轉(zhuǎn)化而來的間充質(zhì)細(xì)胞〔4〕，這一結(jié)果證實腎纖維化與EndMT的內(nèi)在聯(lián)系。Chen等〔5〕對小鼠進(jìn)行5/6腎切除術(shù)誘導(dǎo)慢性腎病，在小鼠的腎皮質(zhì)交界處觀察到大量平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD)31陽性細(xì)胞，經(jīng)抗纖維化處理后再未觀察到這種陽性內(nèi)皮源性細(xì)胞，提示阻斷內(nèi)皮EndMT過程有效阻止腎纖維化進(jìn)程。

微小RNA(miRNA)是一種長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過靶向沉默基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)在表觀遺傳水平上調(diào)節(jié)編碼各種蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)，miRNA的表達(dá)直接影響著人體正常生命活動和各種疾病的發(fā)生發(fā)展〔6〕。糖尿病腎病(DKD)是糖尿病中的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，也是各個國家終末期腎臟疾病(ESRD)的主要病因，而長期高糖環(huán)境下引發(fā)的腎臟纖維化是DKD典型的病理表現(xiàn)〔7〕，在DKD中的腎纖維化部分由具有內(nèi)皮源性的成纖維細(xì)胞導(dǎo)致，提示EndMT參與DKD腎間質(zhì)纖維化早期發(fā)展〔8〕。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)DKD患者體內(nèi)某些miRNA的特異性表達(dá)缺失或低表達(dá)可以使促進(jìn)EndMT腎纖維化的靶向基因不受控制地翻譯為相關(guān)功能蛋白，進(jìn)一步加重病情〔9〕。盡管已經(jīng)確定DKD的發(fā)病機(jī)制，但針對腎纖維化方面的研究和相關(guān)治療仍不太樂觀。因此確定影響腎纖維化EndMT途徑相關(guān)因子表達(dá)的miRNA及具體的作用靶點可為DKD提供更精準(zhǔn)的診斷方法與更優(yōu)越的潛在治療手段。本文就涉及DKD下調(diào)的常見miRNA在EndMT誘導(dǎo)腎纖維化過程中調(diào)控的機(jī)制研究作一綜述，以期加深對DKD腎纖維化發(fā)病機(jī)制的了解，為DKD診斷和靶向治療提供新的生物標(biāo)志物。

1 miR-29

在一項關(guān)于DKD中miRNA的生物信息學(xué)分析中，Yang等〔10〕從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)獲得與DKD相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，經(jīng)GEO2R篩選DKD患者和正常個體之間的差異表達(dá)基因(DEG)，確定表達(dá)下調(diào)的miR-29，同時分析指出，尿液中的miR-29水平反映患者蛋白尿和頸動脈內(nèi)膜中層厚度的嚴(yán)重程度〔11〕。有實驗證實，對小鼠進(jìn)行單側(cè)輸尿管梗阻后，過表達(dá)miR-29能有效阻止腎臟的進(jìn)行性纖維化〔12〕。二肽基肽酶(DPP)-4在內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用，DPP-4通過與整合素(integrin)β1相互作用可誘導(dǎo)血管表皮生長因子受體(VEGFR)1表達(dá)，促進(jìn)EndMT進(jìn)程，抑制DPP-4或intagrin β1會阻礙轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β2刺激的TGF-β受體TGF-βRs二聚體形成，消除TGF-β介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)〔13〕。Shi等〔14〕在對DKD治療藥物作用機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，DPP-4抑制劑利格列汀通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-29水平靶向DPP-4的3′-UTR結(jié)合片段抑制其表達(dá)，參與TGF-β2誘導(dǎo)的EndMT，有效治療DKD腎纖維化。而Sun等〔15〕通過實驗發(fā)現(xiàn)，新型家族蛋白(Smad)3依賴性的纖維化長鏈非編碼RNA-Erbb4-IR可結(jié)合miR-29的3′-UTR區(qū)抑制其轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)糖尿病中的腎纖維化和腎功能障礙。結(jié)合上述實驗結(jié)果可知，miR-29參與的TGF-β/Smad3/miR-29/DPP-4調(diào)控通路可能為控制DKD中EndMT的有效靶點。目前DKD的有效治療主要以降血壓、降血糖兩方面為主，實驗人員發(fā)現(xiàn)用高血壓藥物卡托普利和利尿劑螺內(nèi)酯聯(lián)合干預(yù)治療DKD小鼠，處理組小鼠miR-29a/b/c表達(dá)水平增加，并伴隨TGF-β和蛋白尿的下降〔16〕，提示miR-29與病情的改善有直接關(guān)系。一項關(guān)于糖尿病視網(wǎng)膜病變的實驗證明，在高糖培養(yǎng)可誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)miR-29a/b表達(dá)下降，miR-29a/b通過下調(diào)神經(jīng)源性基因座缺口同源蛋白(Notch)2抑制糖尿病視網(wǎng)膜纖維化病變中的EndMT〔17〕，這一結(jié)果說明由miR-29調(diào)控的Notch2信號傳導(dǎo)可能參與同為糖尿病微血管病變的DKD腎纖維化EndMT過程。

2 miR-let-7

在參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞能量和代謝的同時，miR-let-7還調(diào)節(jié)胰島素的信號傳導(dǎo)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，從而影響糖尿病的病情發(fā)展〔18〕。Wang等〔19〕對DKD患者的血漿進(jìn)行miRNA差異性分析，與健康對照組相比，DKD組中miR-let-7家族的表達(dá)降低，其診斷性能驗證受試者工作特征曲線下面積(AUC)>0.7提示miR-let-7在DKD中潛在的診斷價值。研究表明，F(xiàn)GF通過調(diào)節(jié)miR-let-7控制TGF-β相關(guān)配體和受體表達(dá)，減弱內(nèi)皮細(xì)胞對TGF-β的響應(yīng)，進(jìn)而抵抗TGF-β介導(dǎo)的EndMT〔20〕。Wang等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，在DKD過程中被抑制下調(diào)的miR-let-7b直接靶向結(jié)合TGF-β受體TGFβR1的mRNA3′-UTR區(qū)降低下游蛋白Smad3活性從而抑制TGF-β途徑的腎纖維化。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶底物AcSDKP作為一種內(nèi)源性抗纖維化肽，可將DKD小鼠中表達(dá)被抑制的FGFR1和miR-let-7恢復(fù)至正常水平，提示其EndMT抑制作用〔22〕。實驗證實，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體合成障礙或功能異常引起EndMT，抑制FGFR1表達(dá)消除AcSDKP對線粒體動力學(xué)的正向促進(jìn)作用；上調(diào)miR-let-7b-5p恢復(fù)由AcSDKP介導(dǎo)的線粒體分裂融合的相對平衡〔23〕。由此可知，miR-let-7在維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中存在雙重積極作用，一方面，調(diào)節(jié)EndMT激活因子TGF-β活性；另一方面，參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞線粒體動力學(xué)，維持線粒體的功能和質(zhì)量，保證內(nèi)皮細(xì)胞的正?；顒?。另外，miR-let-7和miR-29在發(fā)揮抗纖維化作用時存在串?dāng)_作用，AcSDKP發(fā)揮抗腎臟纖維化作用時，內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-29上調(diào)，抑制干擾素-γ，進(jìn)而激活FGFR1磷酸化，阻止TGF-β和其相關(guān)信號傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致miR-let-7增加〔24〕，這一結(jié)果表明miR-let-7和miR-29之間的這種相互作用對于AcSDKP/FGFR1調(diào)節(jié)軸維持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)及抗纖維化至關(guān)重要。

3 miR-126

Wang等〔25〕在對DKD患者尿白蛋白排泄率等臨床指標(biāo)及相應(yīng)miRNA進(jìn)行系統(tǒng)評價后，發(fā)現(xiàn)DKD患者體內(nèi)特異性下調(diào)的miR-126。具有重度蛋白尿癥狀的DKD患者的miR-126表達(dá)水平比微量蛋白尿患者更低，與對照組相比，患者miR-126水平與空腹血糖、糖化血紅蛋白、三酰甘油和低密度脂蛋白含量呈負(fù)相關(guān)〔26〕?？刂苹颊哐恰⒀?、血壓及蛋白尿一直是DKD治療及預(yù)后的重要措施，這些結(jié)果提示miR-126水平與DKD的病情發(fā)展密切相關(guān)，與DKD常規(guī)檢測指標(biāo)聯(lián)合使用可成為一項有力的DKD風(fēng)險評估生物標(biāo)志物。使用特定RNA拮抗劑阻斷內(nèi)皮祖細(xì)胞微泡中具有促血管生成作用的miR-126，微泡對缺血再灌注腎損傷的腎臟保護(hù)作用被消除，促進(jìn)腎纖維化〔27〕。Zhang等〔28〕用TGF-β1誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞EndMT，觀測到miR-126表達(dá)下降，過表達(dá)miR-126逆轉(zhuǎn)EndMT發(fā)生；經(jīng)靶點研究確認(rèn)miR-126可結(jié)合PIK3R2的PI3K/AktB信號通路參與的EndMT，上調(diào)CD31等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，下調(diào)α-SMA等間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)。E26轉(zhuǎn)錄因子(ETS)轉(zhuǎn)錄因子ETS-1被證實通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-2組織抑制劑(TIMP)-2的系統(tǒng)平衡影響ECM沉積，影響DKD腎纖維化進(jìn)程〔29〕。研究表明，在內(nèi)皮細(xì)胞中敲減ETS轉(zhuǎn)錄因子組合ETS相關(guān)基因(ERG)和Friend白血病整合素(FLI)1轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EndMT及細(xì)胞動態(tài)表觀遺傳變化，miR-126作為兩種轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵下游靶標(biāo)部分阻斷EndMT的誘導(dǎo)〔30〕。然而，也有研究得出不同的實驗結(jié)論，Beltrami等〔31〕發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，DKD患者組尿液中的miR-126含量顯著增加，經(jīng)組織miRNA定位和釋放后發(fā)現(xiàn)，與足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞相比，miR-126在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中呈富集狀態(tài)。這一結(jié)果與之前的研究不一致，但miR-126與多種檢測指標(biāo)的密切聯(lián)系及在EndMT中的直接調(diào)控作用仍表明miR-126對于DKD而言是一種極具診斷潛力的生物標(biāo)志物。與此同時，miR-126在其他細(xì)胞系中也發(fā)揮改善DKD的作用，如Cao等〔32〕發(fā)現(xiàn)茶多酚可通過miR-126調(diào)控Akt-p53-p21信號通路來緩解高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞衰老。

4 miR-424

先后有研究表明，不管是在DKD患者的尿液中還是在DKD動物模型的腎組織內(nèi)，DKD組的miR-424含量都處于低水平，上調(diào)miR-424調(diào)節(jié)改善DKD大鼠腎功能，修復(fù)糖尿病性腎臟病變〔33,34〕。Chamorro-Jorganes等〔35〕通過生物信息學(xué)方法鑒定出VEGF，VEGFR2和FGFR1可作為調(diào)節(jié)血管生成的重要調(diào)節(jié)基因，同時利用可結(jié)合序列分析和熒光素酶報告預(yù)測影響上述物質(zhì)表達(dá)的靶標(biāo)miRNA，確定miR-424靶向VEGF，VEGFR2和FGFR1的3′UTR區(qū)抑制三種因子的表達(dá)及相關(guān)信號傳導(dǎo)，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及血管自主生成。上述關(guān)于miR-29及miR-let-7的闡述中提及VEGF及FGF均表現(xiàn)出對TGF-β刺激的EndMT的阻礙作用，由此可推斷出，miR-424通過靶向調(diào)節(jié)這些因子及相關(guān)受體的活性參與DKDEndMT。另外，研究指出由高糖誘導(dǎo)的EndMT實際上依賴于MAPK/ERK1/2的激活〔36〕，Yang等〔37〕指出在內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)miR-424靶向FGFR1抑制bFGF/FGFR1途徑，調(diào)節(jié)ERK1/2磷酸化水平，這一結(jié)論同樣支持上述miR-424抗EndMT的觀點。合理的飲食在DKD治療中極其關(guān)鍵，主要以低蛋白、低糖、低脂為主。一項飲食改善疾病研究顯示，長時間攝入獼猴桃果汁可提升糖尿病患者血清中的miR-424、抗氧化因子核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2和Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白(Keap)1，降低炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6，改善患者血脂和炎癥情況;Spearman等級相關(guān)度分析顯示，患者血清miR-424水平與IL-1β、IL-6呈負(fù)相關(guān)，與抗氧化物超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)等呈正相關(guān)〔38〕。綜上所述，miR-424既可阻止由EndMT介導(dǎo)的腎纖維化，又可阻止機(jī)體長期高血糖環(huán)境下的炎癥和氧化應(yīng)激，在糖尿病進(jìn)程中發(fā)揮保護(hù)性作用。

5 其他miRNA

除上述miRNA外，還有一些其他DKD中呈下調(diào)趨勢的miRNA被證實參與EndMT進(jìn)程發(fā)揮其抗纖維化作用，如miR-25〔39,40〕、miR-497〔41〕、miR-346〔42〕、miR-448-3p〔43〕，部分miRNA基于其表達(dá)水平與患者體內(nèi)蛋白尿含量呈負(fù)相關(guān)，可作為檢測病情的有效指標(biāo)。Liu等〔40〕在DKD小鼠體內(nèi)注射miR-25激動劑后可緩解小鼠的蛋白尿水平、腎纖維化程度及繼發(fā)性血壓癥狀，隨后的靶基因研究結(jié)果顯示miR-25靶向原癌基因Ras下游效應(yīng)物CDC42活性，抑制Ras的激活，減弱MEK/ERK信號級聯(lián)通路對TGF-β的放大效應(yīng)〔44〕，從而緩解腎臟EndMT的發(fā)生。最新發(fā)現(xiàn)褪黑素可通過激活miR-497含量靶向抑制ROCK1和ROCK2，緩解糖尿病大鼠腎小球組織中的EndMT和暴露于TGF-β2的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中的EndMT，達(dá)到治療DKD的目的〔41〕。miR-346在EndMT經(jīng)典激活通路TGF-β/Smad下游蛋白Smad3/4的3′-UTR中存在多個互補(bǔ)結(jié)合位點，用帶有miR-346的質(zhì)粒處理糖尿病小鼠顯著改善DKD引起的腎功能障礙〔42〕。miR-448-3p被證實通過靶向DPP-4抑制TGF-β/Smad信號通路介導(dǎo)的EndMT進(jìn)程，改善糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙〔43〕，阻止腎纖維化。

綜上，對血糖、血壓及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻斷劑的合理控制已成為治療DKD的常規(guī)策略，但基于這些研究的新藥未能在人類隨機(jī)臨床試驗中證明其有效性和安全性。通過靶向腎小球濾過膜、炎癥途徑激活和腎纖維化等具體發(fā)病機(jī)制的治療能夠從根本上延緩DKD的病情，所以進(jìn)一步了解DKD致病的分子機(jī)制有助于新型靶向藥物的開發(fā)〔45〕。內(nèi)皮細(xì)胞作為腎臟的主要構(gòu)成細(xì)胞系之一，易被高血糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物、氧化應(yīng)激產(chǎn)物或生長因子刺激發(fā)生功能障礙、表型改變，轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞參與腎纖維化，阻斷這一過程將是腎纖維化治療的有力措施。見圖1。

關(guān)于miRNA的研究仍然存在一些局限性，將其列入臨床上DKD腎纖維化常規(guī)的診斷和治療方法面臨理論和實踐上的挑戰(zhàn)。主要問題有：miRNA的內(nèi)在聯(lián)系還有待探究。由于廣泛調(diào)控的特性，miRNA不止參與EndMT進(jìn)程還會參與其他信號通路產(chǎn)生交互調(diào)控的現(xiàn)象，若在人體中應(yīng)用是否會影響到相關(guān)miRNA最終的抗纖維化效果？EndMT的多致病性。除了誘導(dǎo)纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展，EndMT被證實促進(jìn)惡性腫瘤，心血管疾病，并且與感染性炎癥密切相關(guān)〔3〕。通過控制DKD中表達(dá)下調(diào)的miRNA介導(dǎo)EndMT相關(guān)的腎纖維化過程，是否還會激活機(jī)體其他病理過程？而激活的病理過程又是否會進(jìn)一步惡化腎纖維化病情？關(guān)于miRNA的研究已成為生命科學(xué)與人類醫(yī)學(xué)的熱點，相信經(jīng)過人們的不斷探索后，這些問題終將迎刃而解。