鴨坦布蘇病毒病的研究進(jìn)展

郝桂英，陳 玲，殷蓓蓓，趙開強(qiáng)，張 其，陳光芬，宋 浪

（1.西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615013；2.西昌華農(nóng)禽業(yè)有限公司，四川西昌 615000）

鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）隸屬于黃病毒科、黃病毒屬，是恩塔亞病毒群中的一種新型黃病毒，可感染鴨、鵝、雞、鴿、麻雀、鸚鵡等，也可感染小鼠，具有潛在的公共衛(wèi)生安全風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)鴨的危害最大，主要引起蛋鴨產(chǎn)蛋量急劇下降、卵巢出血性壞死，雛鴨或育成鴨腹瀉以及頭頸震顫、站立不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀[1]，嚴(yán)重者出現(xiàn)死亡，是一種急性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率為5%～15%[2]，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。該文從病原、流行病學(xué)、臨床癥狀及病理變化、診斷和防控等方面對(duì)鴨坦布蘇病毒病的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，希望可以為該病的綜合防控提供思路。

1 病原

鴨坦布蘇病毒呈球形，直徑40～50nm，為有囊膜單股正鏈RNA 病毒?；蚪M大小約為11kb，包含5' 端非編碼區(qū)（untranslated regions，UTR，長(zhǎng)度94nt）、1 個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）和3'-UTR（618nt），5'-UTR 和3'-UTR 均高度保守，無多聚腺苷酸尾[3]。ORF 編碼一個(gè)長(zhǎng)度為3245 個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，通過病毒絲氨酸蛋白酶和宿主信號(hào)肽酶剪切成10 個(gè)蛋白，即3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（核衣殼蛋白（caspid，C）、前膜蛋白（premembrane，PrM）、囊膜蛋白（envelope，E））和7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和NS5）[4]。結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒感染時(shí)病毒粒子的吸附、膜融、組裝和出芽，非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的入侵、復(fù)制、翻譯，同時(shí)調(diào)控宿主的抗病毒天然免疫[5,6]。

DTMUV 對(duì)氯仿、乙醚、去氧膽酸鈉等脂溶劑敏感；不耐熱，56℃15min 即可滅活；不耐酸、堿，最適pH 為8.0～8.5；該病毒對(duì)雞、鴨、鵝、鴿、鼠、兔、豬和人的紅細(xì)胞均無凝集特性，但經(jīng)蔗糖-丙酮處理后，可凝集雞、鴨、鵝、鴿和豬的紅細(xì)胞[7]。DTMUV 可以用雞胚或鴨胚進(jìn)行增殖，鴨胚上增殖效果更好；也可在細(xì)胞上傳代培養(yǎng)，如禽源的雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）、鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）、雞胚成纖維細(xì)胞系（DF-1），哺乳動(dòng)物源的幼倉鼠腎細(xì)胞系（BHK-21）、非洲綠猴腎細(xì)胞系（Vero）、人胚胎腎細(xì)胞系（HEK293）、白蚊伊蚊細(xì)胞系C6/36 細(xì)胞等[8]。

根據(jù)ORF 核苷酸的遺傳進(jìn)化關(guān)系，將東南亞流行的坦布蘇病毒分為兩個(gè)譜系，即TMUV 和DTMUV。TMUV 譜系主要分離自蚊及早期東南亞地區(qū)的雞；DTMUV 譜系分為3 個(gè)群，泰國(guó)和馬來西亞等地區(qū)分離株位于1 亞群和2.1 亞群，我國(guó)分離株主要位于2.1 亞群、2.2 亞群和3 亞群，其中2013 年前的分離株聚集在2.2 亞群，近年來的大多數(shù)分離株聚集在2.1 亞群[9]。

2 流行病學(xué)

2.1 易感動(dòng)物

幾乎所有品種的鴨都能感染鴨坦布蘇病毒，包括北京鴨、櫻桃谷鴨、番鴨、山麻鴨、金定鴨、紹興鴨、縉云麻鴨、龍巖鴨、康貝爾鴨、臺(tái)灣白改鴨等，其中以蛋鴨較為易感。還能感染蛋雞、鵝、鴿、麻雀、鸚鵡、野鴨、小鼠。鳥類尤其麻雀是DTMUV 的貯存宿主，一般不會(huì)引起發(fā)病，但在傳播過程中可能起著非常重要的作用。鴨存在健康帶毒狀態(tài)[10]。

鴨坦布蘇病毒對(duì)7 周齡以下的雛鴨具有較強(qiáng)致病性，其中2 周齡內(nèi)的雛鴨更易感，感染率和發(fā)病率高達(dá)90%以上，死亡率5%～30%，2～4 周齡鴨死亡率高達(dá)40%，5～6 周齡鴨死亡率高達(dá)25%。對(duì)育成鴨的致病性與鴨的周齡相關(guān)，7～21 周齡均易感，其中7～10 周齡、18～21 周齡較易感，14～16 周齡有較強(qiáng)抵抗力[11]。7～8 周齡鴨死亡率低于10%。蛋鴨感染后日產(chǎn)蛋率可下降5%～20%，死亡率約為2%～5%。

2.2 傳播途徑

在自然條件下，DTMUV 可通過庫蚊作為媒介傳播病毒，因此，表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性[12]。但通過監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該病一年四季均可發(fā)生，夏季和秋季是高發(fā)期，在冬季依然出現(xiàn)流行，因此該病毒還能通過消化道、呼吸道等方式傳播。該病傳播速度快，一般可在2d 內(nèi)傳遍整欄鴨群。另外，該病還可垂直傳播，導(dǎo)致種蛋孵化率、出殼率下降，死胚及弱雛增多[13]。候鳥可能在DTMUV 跨地域傳播中起重要作用。DTMUV存在跨越種間屏障傳播的可能性。

1955 年首次從馬來西亞吉隆坡的三帶喙庫蚊體內(nèi)分離到坦布蘇病毒，1982 年和1992 年在泰國(guó)北部蚊體內(nèi)分離到；1995 年，從我國(guó)石家莊發(fā)病的康貝爾鴨肝臟、脾臟分離到疑似黃病毒科的病毒。直到2010年4 月我國(guó)鴨場(chǎng)開始暴發(fā)坦布蘇病毒病，已在浙江、江蘇、福建、安徽、江西、山東、河北、黑龍江、北京、廣東、廣西、重慶、上海、山西、湖南、湖北、河南、四川、貴州、云南、內(nèi)蒙古等?。ㄊ校┌l(fā)病和流行[14]。

3 臨床癥狀及病理變化

雛鴨、育成鴨感染后主要表現(xiàn)為精神沉郁、體溫升高、采食量下降、拉綠色稀糞、不愿站立、驅(qū)趕不動(dòng)，部分病鴨出現(xiàn)翻個(gè)、腳軟、歪脖、雙腳麻痹、步態(tài)不穩(wěn)等神經(jīng)癥狀。通常感染后4～7d 為死亡高峰，從第13 天開始逐漸好轉(zhuǎn)。耐過鴨通常表現(xiàn)為發(fā)育不良。剖檢可見各臟器均有不同程度病變，心臟腫大、出血；肺臟腫大；肝臟呈土黃色，表面有點(diǎn)狀壞死灶或塊狀出血；脾大、出血、瘀血，甚至破裂，呈斑駁樣大理石紋；腎臟腫大、有壞死點(diǎn)，偶爾有出血點(diǎn)；腦有不同程度水腫或呈樹枝狀充血。

產(chǎn)蛋鴨感染后的典型癥狀是產(chǎn)蛋量驟降，一般在感染后第2 天出現(xiàn)厭食，隨后3～4d 產(chǎn)蛋率急劇下降，可下降至10%以下，甚至絕產(chǎn)，排綠色糞便。部分病鴨伴隨有雙腳麻痹、搖頭晃腦等神經(jīng)癥狀。病程約數(shù)周，一般可耐過，但新開產(chǎn)鴨表現(xiàn)最為嚴(yán)重，耐過蛋鴨的產(chǎn)蛋水平無法恢復(fù)至發(fā)病前。剖檢可見心肌蒼白，有時(shí)可見條索狀壞死；肝臟發(fā)黃、腫大；脾大甚至破裂，偶見脾臟萎縮；卵巢出血性壞死，卵泡變性、萎縮、破裂，卵泡膜出血；公鴨睪丸、輸精管萎縮。

種鵝感染后潛伏期一般為3～5d，主要表現(xiàn)為體溫升高，采食量下降，產(chǎn)蛋量急劇下降，后期表現(xiàn)為頭頸抽搐、翅膀麻痹、步態(tài)不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)甚至癱瘓等神經(jīng)癥狀，死淘率為5%～10%。耐過種鵝產(chǎn)蛋性能一般不能恢復(fù)到正常水平[15]。肉鵝在40～60 日齡發(fā)病，拉綠色稀便，翅和雙腳麻痹，死淘率約10%。

蛋雞感染后主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋量下降，通常不死亡[16]。

4 診斷

4.1 臨床診斷

根據(jù)臨床癥狀和剖檢病變進(jìn)行初步診斷，然后再通過病毒分離與鑒定、血清學(xué)以及分子生物學(xué)等方法進(jìn)行確診。

4.2 病毒分離與鑒定

采集發(fā)病動(dòng)物的卵巢、肝臟、脾臟、腦等病變組織，經(jīng)研磨、離心、過濾后接種雞胚或鴨胚，也可用DEF、CEF、DF-1、BHK-21、Vero 等細(xì)胞系進(jìn)行病毒的分離鑒定，其中，BHK-21 對(duì)DTMUV 的分離率最高[17]。但該方法對(duì)研究人員的操作技術(shù)要求較高，且成功率相對(duì)較低。

4.3 血清學(xué)診斷

目前，血清學(xué)診斷方法有血凝抑制試驗(yàn)（HI）、乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接免疫熒光（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、膠體金免疫層析及中和試驗(yàn)等[18-22]。

4.3.1 血凝抑制試驗(yàn)（HI）

用雞胚、鴨胚、DEF、BHK-21、Vero 細(xì)胞增殖的坦布蘇病毒不能凝集雞、鴨、鵝的紅細(xì)胞，但用乳鼠腦組織增殖并經(jīng)蔗糖-丙酮處理后可與雞、鴨、鵝、鴿、豬的紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，用于血凝抑制試驗(yàn)。Wang 等[23]建立了鴨坦布蘇病毒HI 抗體檢測(cè)方法。

4.3.2 乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）

萬春和等[24]將純化的DTMUV WR 株制備成致敏乳膠，建立了檢測(cè)抗體的乳膠凝集試驗(yàn)。該方法不需要特殊設(shè)備，在1～5min 內(nèi)肉眼觀察判定結(jié)果，具有簡(jiǎn)便、快速、特異等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床病例的快速診斷和血清流行病學(xué)調(diào)查。

陳浩等[25]用純化的抗DTMUV PrM 單克隆抗體、施少華等[26]用純化的抗DTMUV 單克隆抗體4E11 致敏乳膠，相繼建立了檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的乳膠凝集試驗(yàn)。

4.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA 具有操作簡(jiǎn)單、快速，可同時(shí)檢測(cè)大量樣品的優(yōu)點(diǎn)，在坦布蘇病毒病臨床檢測(cè)中可廣泛應(yīng)用，已報(bào)道有間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 和阻斷ELISA 等。

張德寶等[27]以純化的DTMUV 奉賢株（FX2010）全病毒、施少華等[28]以純化的DTMUV WR 株全病毒作為包被抗原，相繼建立檢測(cè)DTMUV 抗體的間接ELISA，具有較高的敏感性和特異性，更適宜于鴨坦布蘇病毒抗體的檢測(cè)。

郝明飛等[29]以純化的DTMUV E 重組蛋白、傅秋玲等[30]以E 蛋白抗原表位區(qū)E1 蛋白、陳偉國(guó)等[31]以ZJSBL01 株E 蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ（EDⅢ）重組蛋白作為包被抗原，相繼建立檢測(cè)DTMUV 抗體的間接ELISA。

李晨曦等[19]利用DTMUV E 蛋白特異性抗原表位87YAEYI91 建立Epitope-ELISA，該方法的相對(duì)特異性和敏感度分別為100%和96%，具有特異性好、無交叉反應(yīng)性，可用于DTMUV 診斷和抗體水平的評(píng)價(jià)，但該方法陽性樣品的OD 值均偏低，在親和力上還有待進(jìn)一步優(yōu)化提高。

謝星星等[32]以純化的鵝源坦布蘇病毒JS804 株NS1 重組蛋白、萬春和等[33]以純化的DTMUV WR 株NS1 重組蛋白、提金鳳等[20]以SDSG 株NS1 重組蛋白作為包被抗原，相繼建立間接NS1-ELISA。

謝星星等[34]以鵝源坦布蘇病毒JS804 株制備的多克隆抗體為捕獲抗體，抗鵝坦布蘇病毒NS1 蛋白的單克隆抗體4A9 作為檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)坦布蘇病毒的雙抗體夾心ELISA。

Bai 等[35]使用單克隆抗體IF3 和3B6，建立抗原捕獲ELISA（AC-ELISA）檢測(cè)臨床樣品中的DTMUV E抗原，與RT-PCR 法相比較，AC-ELSIA 的特異性和敏感性分別為94.1%和98.0%。

Fu 等[36]以滅活的DTMUV 全病毒為包被抗原，兔抗DTMUV 陽性血清為競(jìng)爭(zhēng)抗體、抗兔IgG-HRP 作為酶標(biāo)二抗，建立固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA，不僅能夠檢測(cè)DTMUV，還能夠檢測(cè)來源于不同宿主血清中的DTMUV 抗體。用該方法檢測(cè)44 份血清樣品，并與病毒中和試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，兩種方法符合率為100%。

Li 等[22]以純化的FX2010 株全病毒作為包被抗原，單克隆抗體1F5 建立一種阻斷ELISA，用于檢測(cè)DTMUV 的中和抗體。

用全病毒建立的ELISA 方法存在抗原制備煩瑣、每批全病毒純度差異大、成本高等缺點(diǎn)，而且容易與其他黃病毒出現(xiàn)交叉反應(yīng)；用NS1 建立的ELISA 方法不僅可用于DTMUV 早期感染的診斷，還可用于免疫后抗體水平監(jiān)測(cè)；而以E 蛋白建立的ELISA 方法不能區(qū)分活毒或滅活苗的免疫。

4.3.4 膠體金免疫層析條帶法（ICS）

該方法利用微孔膜的滲透和毛細(xì)作用，在固定膜上提供快速的抗原-抗體反應(yīng)，不需要儀器設(shè)備，室溫靜置15min 即可觀察結(jié)果。與其他方法相比，快速簡(jiǎn)便、成本低，可操作性強(qiáng)，適合臨床樣品的快速檢測(cè)，且試紙條保存期長(zhǎng)。

Deng 等[37]研制了檢測(cè)DTMUV 抗原的膠體金快速檢測(cè)試紙條和DTMUV 抗體的雙抗原夾心式免疫層析試紙條。

劉艷紅[38]以重組E 蛋白和羊抗鼠IgG 作為金標(biāo)蛋白制備了雙抗原夾心的膠體金免疫層析方法，Yu 等[21]采用E 蛋白純化單克隆抗體A12D3 標(biāo)記膠體金，以E 蛋白多克隆C12D1 抗體用作捕獲抗體，用山羊抗鼠IgG 分別劃線制備了DTMUV 膠體金免疫試紙條。

但目前該方法對(duì)DTMUV 感染的檢測(cè)仍僅限于實(shí)驗(yàn)室，至今仍無商品化的膠體金試劑盒用于DTMUV及其抗體的檢測(cè)。

4.4 分子生物學(xué)診斷

自DTMUV 暴發(fā)以來，已建立RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（RT-qPCR）、反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）等檢測(cè)方法，其中以RT-PCR 最常見，適用于流行病學(xué)調(diào)查和診斷。

4.4.1 RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)

王建昌等[39]建立基于DTMUV E 基因、提金鳳等[40]建立了基于NS1 基因、Cao 等[41]建立基于NS3 基因、Ninvilai 等[42]建立基于NS5 基因的RT-PCR 檢測(cè)方法，可直接檢測(cè)病料，能夠達(dá)到快速檢測(cè)要求。

4.4.2 RT-qPCR 檢測(cè)技術(shù)

陳國(guó)強(qiáng)等[43]建立基于DTMUV E 基因、萬春和等[44]建立了基于NS1 基因、劉青濤等[45]建立基于NS2A 基因、王巧萍等[46]建立基于NS5 基因的RT-qPCR 檢測(cè)方法，可從病料中快速檢測(cè)出DTMUV。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 不僅具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、花費(fèi)時(shí)間少等優(yōu)點(diǎn)，還能對(duì)病毒進(jìn)行定量，但該技術(shù)需要熒光PCR 儀，對(duì)操作人員的要求較高，在基層推廣受到一定限制。

4.4.3 RT-LAMP 檢測(cè)技術(shù)

該技術(shù)是針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異性引物，利用鏈置換DNA 聚合酶在恒溫條件（65℃左右）高效擴(kuò)增核酸，且在水浴鍋中1h 即可完成反應(yīng)。肉眼直接觀察結(jié)果，具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，特別適合基層早期快速檢測(cè)。但該方法存在重復(fù)性較差、無法定量也難以判斷是否發(fā)生非特異擴(kuò)增等缺點(diǎn)。

韓凱凱等[47]建立了基于RT-LAMP 的鴨坦布蘇病毒檢測(cè)方法。

4.4.4 納米PCR 檢測(cè)技術(shù)

Wanzhe 等[48]建立一種以DTMUV E 基因?yàn)榘悬c(diǎn)的納米PCR 方法，其檢測(cè)限為1.8×102拷貝/μL，具有較高的特異性和敏感性，對(duì)臨床標(biāo)本中DTMUV 的快速檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

5 防控

5.1 疫苗免疫

疫苗免疫是預(yù)防和控制鴨坦布蘇病毒病最有效的措施之一，目前商品化的疫苗主要有鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB 株）、鴨坦布蘇病毒病活疫苗（WF100株、FX2010-180P 株）。同時(shí)基因重組疫苗、DNA 疫苗、亞單位疫苗等也是目前研究的重點(diǎn)。用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的截短的E 蛋白能誘導(dǎo)雛鴨產(chǎn)生特異性抗體，有望成為預(yù)防雛鴨感染的潛在候選疫苗[49]；E蛋白融合表位蛋白rTBE 具有免疫原性及保護(hù)力，有望作為一種安全有效的新型DTMUV 候選亞單位疫苗[50]。用腺病毒和沙門氏菌作為載體開發(fā)DTMUV 重組載體疫苗，可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生高水平的中和抗體，能產(chǎn)生100%的攻毒保護(hù)作用[51]。重組塞姆利基森林病毒（SFV）復(fù)制子在DEF細(xì)胞中可高度表達(dá)E 蛋白，用這種DNA 疫苗肌肉注射雛鴨后，能產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并能抵抗AH-F10 強(qiáng)毒株[52]。重組融合肽Tα1-BP5 能顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答水平，對(duì)DTMUV 滅活疫苗有免疫增強(qiáng)作用[53]。DTMUV 滅活疫苗與胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤寡聚脫氧核苷酸（CpG ODN）、白介素2（IL-2）聯(lián)用，能增強(qiáng)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此pUC18-CpG、IL-2 可作為DTMUV 滅活疫苗的佐劑[54,55]。

通過對(duì)DTMUV 分離株全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，DTMUV 具有高度遺傳多樣性，而現(xiàn)行的滅活疫苗、弱毒疫苗對(duì)所有分離株是否均具有免疫保護(hù)力還未知，需要進(jìn)一步的研究。

5.2 對(duì)癥治療，控制疫情傳播

目前尚沒有藥物對(duì)黃病毒病有很好的治療效果，可使用抗病毒藥物（如金剛烷胺、利巴韋林等）治療DTMUV 感染，或使用清熱解毒中草藥（如清瘟敗毒散、雙黃連、板藍(lán)根、金銀花、白術(shù)等）和干擾素。EGCG（存在于綠茶中的多酚）、石蒜堿，在感染雛鴨中有抗DTMUV 功效[56]。同時(shí)添加氨芐西林、硫酸阿米卡星、林可霉素、鹽酸恩諾沙星等抗生素類藥物防止細(xì)菌病繼發(fā)感染。在發(fā)病早期，可采用卵黃抗體對(duì)健康鴨進(jìn)行緊急接種，用2 倍使用劑量對(duì)發(fā)病鴨進(jìn)行緊急治療。

5.3 其他生物安全措施

在日常養(yǎng)殖工作中必須做好驅(qū)蚊、滅蚊、滅鼠、驅(qū)逐麻雀等工作，同時(shí)保持環(huán)境清潔衛(wèi)生，污水、垃圾以及衛(wèi)生死角等要及時(shí)清除，減少蚊蟲滋生；加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，對(duì)圈舍、料盤、飲水器和周圍環(huán)境等定期消毒；注意通風(fēng)，對(duì)病死禽進(jìn)行生物安全處理；在日糧中添加復(fù)合維生素和微量元素，提高禽群的免疫力和抵抗力。由于DTMUV 可感染雞、鴨、鵝，應(yīng)避免不同禽類的混養(yǎng)。

6 小結(jié)

對(duì)DTMUV 進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查及遺傳變異分析，為有效、快速地對(duì)DTMUV 進(jìn)行防控極其重要。但在傳播途徑、致病機(jī)制、藥物開發(fā)、新型疫苗研制、公共衛(wèi)生等方面還需要進(jìn)一步的研究。