心肌梗死相關(guān)miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用

王雯雯，延偉偉，莫霄云

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧 530299；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

隨著人們生活方式的改變，心血管疾病的發(fā)生率和病死率不斷上升，目前心血管疾病在我國所有疾病中的病死率高居首位［1］。心肌梗死（MI）是指冠狀動脈發(fā)生的一種心肌缺血性壞死疾病，且MI能夠誘發(fā)心源性休克、心房顫動、心力衰竭等［2］，嚴(yán)重威脅患者的健康。目前臨床對于MI 的治療仍以藥物治療及手術(shù)治療為主，但隨著對MI發(fā)病機(jī)制深入研究發(fā)現(xiàn)，通過抗血小板聚集、再灌注治療及溶栓、取栓、血管重建術(shù)等改善心肌缺血及心室重構(gòu)，可有效緩解疾病的進(jìn)展［3］。盡管如此，MI 的病死率仍不斷上升［4］，預(yù)計(jì)到2030 年我國將有3 000 萬MI 患者［1］。生物信息學(xué)通過對生物醫(yī)藥領(lǐng)域的信息進(jìn)行收集、處理以及利用，進(jìn)而從基因分子層面揭示疾病的發(fā)生機(jī)制及潛在規(guī)律。因此，本研究通過生物信息學(xué)對MI 中差異表達(dá)微小RNA（miRNA）和差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，并建立MI 的miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為MI的治療及其預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 MI患者miRNA數(shù)據(jù)集的選取 選擇基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds），檢索該數(shù)據(jù)庫2021年12月—2022年9月的數(shù)據(jù)，以“miocardial infarction”“miRNA”等為關(guān)鍵詞，通過勾選Homo sapiens（智人）種屬和Non-coding RNA profiling by array 研究類型，共檢索到234 篇有關(guān)MI 的文獻(xiàn)；根據(jù)其是否具有樣本獨(dú)立性、組間可比性、樣本類型等標(biāo)準(zhǔn)最終篩選得到GSE61741 基因表達(dá)譜，包含外周血樣本（MI患者樣本62例、正常人樣本94 例）的miRNA 微陣列數(shù)據(jù)集，該平臺芯片為GPL9040（febit Homo Sapiens miRBase13.0）。本研究以62 例MI 疾病樣本作為MI 疾病組，62 例正常人樣本作為正常組。

1.2 差異表達(dá)miRNA 的篩選 用Perl 軟件對miRNA 基因表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因重注釋，并用R語言對其進(jìn)行校正、分類，用limma包對miRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為：P＜0.05，|logFC|＞1。用pheatmap 包根據(jù)篩選出來的差異miRNA 繪制熱圖和火山圖。

1.3 差異表達(dá)miRNA 下游靶基因預(yù)測 用miRNet（https：//www.mirnet.ca/miRNet/upload/MirUpload-View. xhtml）在線網(wǎng)站分析miRNA-mRNA 的相互作用關(guān)系，對差異表達(dá)的miRNA 下游靶基因進(jìn)行預(yù)測。

1.4 差異表達(dá)miRNA 上游結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測 采用FunRich3.1.3 分析基因和蛋白質(zhì)功能富集、相互作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測在MI患者外周血中存在目標(biāo)靶基因的差異表達(dá)miRNA 上游結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，在該軟件內(nèi)分別輸入所獲取的差異表達(dá)miRNA，并取排名前10且具有意義的轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子。

1.5 差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)處理 采用GEO 數(shù)據(jù)庫獲取mRNA 數(shù)據(jù)集并對差異表達(dá)miRNA 的可靠性及其預(yù)測下游靶基因的真實(shí)性進(jìn)行驗(yàn)證。在GEO 數(shù)據(jù)庫中檢索“miocardial infarction”“mRNA”等關(guān)鍵詞，最終由GPL570 平臺｛［HG-U133_Plus_2］ Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array｝分析GSE66360 數(shù)據(jù)集。利用Perl 對mRNA 數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因重注釋，并利用R語言校正、分類，篩選標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05，|logFC|＞1。用limma 包對mRNA 數(shù)據(jù)集中的50 個(gè)正常組及49 個(gè)MI 疾病組進(jìn)行差異分析，制作火山圖。

1.6 差異表達(dá)miRNA 下游目標(biāo)基因的篩選 利用GEO 數(shù)據(jù)庫明確上述獲得的MI 疾病組與正常組樣本間的上、下調(diào)表達(dá)mRNA，并將上調(diào)表達(dá)miRNA與下調(diào)表達(dá)mRNA 取交集；將下調(diào)表達(dá)miRNA 與上調(diào)差異mRNA 取交集，從而得到差異表達(dá)miRNA 下游目標(biāo)基因，最后繪制韋恩圖。

1.7 基因本體（GO）生物學(xué)功能注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 使用enrichplot包、clusterProfiler 包及DOSE 包，通過R 語言對MI 中差異表達(dá)miRNA 下游目標(biāo)基因進(jìn)行GO 生物學(xué)功能注釋及KEGG通路富集分析，其中GO包括生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）。

1.8 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因鑒定 采用String 數(shù)據(jù)庫，綜合得分≥0.4 的條件下構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用cytoscape3.9.1軟件的插件“cytohubba”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，并利用Degree 度、邊過濾成分、最大鄰居組件、BottleNeck 等四種不同算法分別篩選出PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前10 的關(guān)鍵基因，將不同算法的前10名基因取交集獲得Hub基因。

1.9 Hub 基因及關(guān)鍵miRNA 的預(yù)測 采用miRNet在線數(shù)據(jù)庫，將所獲取的Hub 基因?qū)爰传@得相應(yīng)miRNA，通過可視化呈現(xiàn)Hub 基因及相應(yīng)miRNA 的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，通過綜合分析篩選出與Hub 基因相關(guān)性排名前5的miRNA。

2 結(jié)果

2.1 芯片數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)miRNA 共得到162 個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中表達(dá)上調(diào)基因93 個(gè)、表達(dá)下調(diào)基因69個(gè)。

2.2 差異表達(dá)miRNA 的下游靶基因 得到在外周血中存在下游靶基因的17 個(gè)差異表達(dá)miRNA。其中4 個(gè)表達(dá)上調(diào)miRNA，分別為miR-19b-3p、miR-132-5p、miR-223-3p、miR-223；13 個(gè)表達(dá)下調(diào)miRNA，分 別 為miR-155-5p、miR-20a-5p、miR-21-5p、miR-455-3p、miR-33a-5p、miR-20a-3p、miR-33a-3p、miR-33b-3p、miR-155-3p、miR-21、miR-155、miR-20a、miR-33a。在miRNet 數(shù)據(jù)庫中，表達(dá)上、下調(diào)miRNA 各自含有2 105、7 991個(gè)對應(yīng)的下游靶基因。表達(dá)上、下調(diào)miRNA-靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.3 差異表達(dá)miRNA 的上游結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 通過FunRich（http：//www. funrich. org/）在線預(yù)測17 個(gè)差異表達(dá)miRNA 在外周血中的上游結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，取評分最高的前10 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。差異表達(dá)miRNA中4個(gè)表達(dá)上調(diào)基因的前10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別為配對盒 基 因6（PAX6）、2 級POU 結(jié) 構(gòu) 域 轉(zhuǎn) 錄 因 子1（POU2F1）、核受體亞家族6A 組成員1（NR6A1）、特異性蛋白1（SP1）、同源框A9（HOXA9）、前B 細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)錄因子1（PBX1）、同源盒基因A13（HOXA13）、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A（MEF2A）、胚胎外組織精子發(fā)生同源盒基因1（ESX1）、同源盒基因B13（HOXB13），其中PAX6、POU2F1、NR6A1、SP1 差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。差異表達(dá)miRNA中13 個(gè)表達(dá)下調(diào)基因前10 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別為SP4、早期生長反應(yīng)因子1（EGR1）、POU2F1、SP1、SOX1、MEF2A、FOXA1、ras 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（RREB1）、FOXO1、HOXA3，差異表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。由于POU2F1、SP1 轉(zhuǎn)錄因子均與表達(dá)上、下調(diào)基因存在調(diào)控關(guān)系，故POU2F1、SP1 在此最為重要。

2.4 MI 差異表達(dá)基因 獲得289 個(gè)上調(diào)和62 個(gè)下調(diào)顯著差異表達(dá)mRNA。使用維恩圖對差異表達(dá)mRNA 及差異表達(dá)miRNA 所預(yù)測的下游靶基因取交集，可獲得表達(dá)上調(diào)miRNA 的靶向目標(biāo)基因2個(gè)，下調(diào)的靶向目標(biāo)基因163個(gè)。

2.5 GO 和KEGG 富集分析結(jié)果 GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)基因的生物學(xué)過程主要與細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)等相關(guān)；在細(xì)胞組分中主要富集在三級顆粒、富含纖膠凝蛋白1顆粒體、分泌顆粒腔等；在分子功能中主要富集在細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性等。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)基因主要在TNF 信號通路、IL-17 信號通路、NF-κB信號通路中顯著富集。

2.6 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及Hub 基因的篩選 獲得居前7位Hub 基因：FOS、纖維連接蛋白1（FN1）、JUN、NFKBIA、腫瘤壞死因子（TNF）、趨化因子CXC 基序配體8（CXCL8）、IL-1β。

2.7 7 個(gè)Hub 基因與相關(guān)miRNA 的預(yù)測 通過綜合評價(jià)篩選出排名前5 的核心miRNA，分別為miR-34a-5p、miR-155-5p、miR-130a-3p、miR-129-2-3p、miR-24-3p。

3 討論

miRNA 作為表觀遺傳學(xué)的一種方式，在基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，但絕大多數(shù)miRNA-mRNA之間的相互作用并未完全闡明［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 能夠通過負(fù)向調(diào)控mRNA 的表達(dá)，進(jìn)而降低因缺氧而導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷，認(rèn)為miRNA 可以作為診斷MI 的生物標(biāo)志物［6］。但是，未進(jìn)一步探究與MI 中的miRNA 分子機(jī)制，且MI 疾病發(fā)展過程中參與miRNA 介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制的分子網(wǎng)絡(luò)也尚未明確。因此，本研究從生物分子學(xué)角度出發(fā)，利用生物信息學(xué)挖掘出與MI 相關(guān)的調(diào)控基因及其相關(guān)miRNA，明確其分子機(jī)制，為防治MI 提供一定的理論依據(jù)。

在本研究中，通過分析miRNA 基因芯片數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)情況，進(jìn)而得到17 個(gè)具有異常表達(dá)的miRNA，其中表達(dá)上調(diào)miRNA 有4 個(gè)，表達(dá)下調(diào)miRNA 有13 個(gè)。miR-19b-3p 作為早期診斷MI 的重要指標(biāo)，其在MI 患者血漿中處于高表達(dá)狀態(tài)［7］；MI患者血漿中miR-223-3p 的水平較健康人群明顯上升［8］；此外，miR-223 在MI 患者的血清中也存在高表達(dá)，其高表達(dá)可加速心肌細(xì)胞的凋亡［9］。研究表明，MI 患者血清中miR-21 的表達(dá)上升，能夠誘發(fā)心肌梗死的發(fā)生［10］；另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p 表達(dá)下調(diào)可通過Cab39 /AMPK 信號通路，延緩人類間充質(zhì)干細(xì)胞衰老，進(jìn)而起到預(yù)防MI 的作用［11］。這與本研究結(jié)果有差異，可能由于標(biāo)本采集的組織、部位及實(shí)驗(yàn)室所選擇的方法不同造成的，仍需進(jìn)一步探究。

miRNA 與結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子之間可發(fā)生相互作用，miRNA 的表達(dá)受相關(guān)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的支配，其也可以反作用于轉(zhuǎn)錄因子，二者聯(lián)合可調(diào)控下游mRNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯，是細(xì)胞代謝的重要調(diào)節(jié)劑［12］。為此本研究通過預(yù)測差異表達(dá)miRNA 的相關(guān)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)SP1作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠參與生物細(xì)胞的生長分化、增殖、凋亡等基本生物學(xué)過程，其在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長凋亡及防治MI的作用得到了證實(shí)［13］。POU2F1 也被稱為八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1，是一種位于1q24 染色體上的重要轉(zhuǎn)錄因子；有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠MI 組織中的POU2F1 高表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分化，進(jìn)而加重細(xì)胞外基質(zhì)的硬度，導(dǎo)致MI發(fā)生［14］。EGR1 作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥和干預(yù)心肌細(xì)胞纖維化中起到了關(guān)鍵作用；當(dāng)EGR1 表達(dá)下調(diào)時(shí)，可降低心肌細(xì)胞中的炎癥因子的產(chǎn)生和細(xì)胞纖維化，因此下調(diào)EGR1 表達(dá)可能是治療MI 及其并發(fā)癥的一種防治手段［15］。

本研究通過對差異表達(dá)miRNA 及其下游差異表達(dá)mRNA 進(jìn)行整合，得到miRNA 表達(dá)上調(diào)靶向目標(biāo)基因2個(gè)和表達(dá)下調(diào)靶向目標(biāo)基因163個(gè)。經(jīng)GO功能注釋及KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)165 個(gè)目標(biāo)基因主要富集在細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、三級顆粒、細(xì)胞因子活性等相關(guān)生物功能以及聚集在TNF、IL-17、NF-κB等信號通路中。TNF-α作為炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，其誘導(dǎo)的信號通路在細(xì)胞對炎癥和損傷的反應(yīng)中扮演了重要角色；炎癥免疫反應(yīng)是MI 的誘因之一，而激活的TNF-α信號通路可以改善血管循環(huán)、緩解冠狀動脈硬化、修復(fù)心肌損傷和心臟重構(gòu)，進(jìn)而對MI 起到防治作用［16］。IL-17 是一種能夠以血管作為靶目標(biāo)的炎癥細(xì)胞因子，其不僅可與相同細(xì)胞因子結(jié)合增加血小板聚集，增加血栓形成風(fēng)險(xiǎn)；而且可通過募集白細(xì)胞和活化內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌胞凋亡，加重心肌缺血和再灌注損傷程度，最后加快MI的發(fā)展進(jìn)程［17］。心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)及凋亡是MI發(fā)病后出現(xiàn)的病理變化，其嚴(yán)重程度可判斷MI的進(jìn)展［6，18］。NF-κB 是一種具有多種轉(zhuǎn)錄功能的蛋白，其參與多種細(xì)胞活動；有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/NF-κB 信號通路在介導(dǎo)MI 的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，TLR4/NF-κB在MI心肌組織中呈高表達(dá)，當(dāng)其信號通路激活時(shí)可加重心肌損傷；而使用氧化物酶2（Prdx2）蛋白抑制TLR4/NF-κB 信號通路時(shí)可降低心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡水平，起到治療MI的作用［18］。因此上述不同途徑均可成為MI 治療的潛在機(jī)制。

本研究進(jìn)一步通過構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，采用四種不同算法篩選出前10位目標(biāo)基因，并取交集進(jìn)而獲得7個(gè)Hub基因，分別為JUN、FOS、TNF。CXCL8、FN1、NFKBIA、IL-1β。CXCL8 作為趨化因子家族中的一員，在心臟損傷、修復(fù)和重塑中起到關(guān)鍵介導(dǎo)作用，可通過募集白細(xì)胞及控制中心粒細(xì)胞浸潤進(jìn)而減緩MI 所引發(fā)的炎癥反應(yīng)［19］；FN1 參與了MI 誘導(dǎo)的心肌纖維化和炎癥反應(yīng)，其在MI 患者的心肌組織中呈高表達(dá)，當(dāng)使用FNI 拮抗劑劑后可有效改善MI 所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)［20］；NFKBIA 是NF-κB 的抑制劑，通過抑制NF-κB 信號通路激活，降低NF-κB在MI中的促炎作用，進(jìn)而保護(hù)心?。?1］；IL-1β 是一種炎癥因子，在心血管疾病發(fā)生中起關(guān)鍵作用，MI 患者中使用IL-1β 抑制劑后，心血管不良事件發(fā)生率降低［22］。由此可見，CXCL8、FN1、NFKBIA、IL-1β、TNF 參與MI 的發(fā)生發(fā)展過程，但目前尚未發(fā)現(xiàn)JUN、FOS、MI的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

為進(jìn)一步驗(yàn)證MI 相關(guān)miRNA，根據(jù)篩出的7 個(gè)Hub 基因利用miRNet 在線數(shù)據(jù)庫對其有關(guān)miRNA進(jìn)行預(yù)測，并取前5 位miRNA。目前對于miRNA 的相關(guān)研究與日俱增，但miR-34a-5p、miR-155-5p、miR-130a-3p、miR-24-3p 與MI 的報(bào)道并不多見。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血引起的缺氧是導(dǎo)致MI的重要原因，而miR-34a-5p過度表達(dá)會加重心肌缺氧的發(fā)生；通過構(gòu)建缺氧MI 細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)抑制miR-34a-5p表達(dá)可以保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧損傷［23］。miRNA（包括miR-24-3p）在MI 中不同的表達(dá)及其對下游靶基因的作用影響著MI 的發(fā)生。有研究表明，miR-24-3p 在心肌缺血/再灌注中表達(dá)上調(diào)，其下游靶基因RIPK1 表達(dá)上調(diào)；RIPK1 高表達(dá)可增加心肌梗死面積，加速細(xì)胞凋亡，而miR-24-3p 可通過抑制RIPK1 表達(dá)進(jìn)而保護(hù)受損心肌細(xì)胞［24］。此外亦有研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a-3p 具有類似的調(diào)控效果，上調(diào)miR-130a-3p表達(dá)可抑制過度的心肌母細(xì)胞自噬并改善心肌缺血/再灌注損傷［25］。miR-129-2-3p在MI 中的調(diào)控作用經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)后并未見相關(guān)報(bào)道。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了MI 相關(guān)的miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)CXCL8、FN1、NFKBIA、IL-1β、TNF 及其所對應(yīng)的miR-34a-5p、miR-155-5p、miR-130a-3p、miR-24-3p 在MI 發(fā)生發(fā)展及其防治過程中發(fā)揮調(diào)控作用。本研究仍存在不足，如所篩選的基因芯片樣本數(shù)量不夠多，只進(jìn)行了理論層面的分析，而未對MI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。