CRISPR/Cas9系統(tǒng)技術(shù)難關(guān)：脫靶效應(yīng)及其優(yōu)化方法

于宗菲 翁麗涵 孫誠誠 曹曉鈺 葉 振

1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250117；2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000

作為第三代基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在基因編輯特異性以及效率方面的優(yōu)越性趕超鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activatorlike effectors nucleases，TALENs），但其存在的脫靶問題至今仍未完全解決，嚴(yán)重限制了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)展。在生物體研究中，脫靶意味著基因編輯的準(zhǔn)確性低，基因治療效果得不到保證。目前，科學(xué)家們?nèi)灾铝τ陂_發(fā)和研討如何使脫靶效應(yīng)最小化。因此，亟需明確CRISPR/Cas9 系統(tǒng)潛在的可產(chǎn)生脫靶效應(yīng)的環(huán)節(jié)，并對此制定降低脫靶效應(yīng)的策略，解決了脫靶效應(yīng)的限制，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)基因編輯潛力會得到更充分的發(fā)揮。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)概述

CRISPR作為基因編輯領(lǐng)域3大編輯工具之一，經(jīng)證實(shí)為細(xì)菌和古細(xì)菌免疫系統(tǒng)的防御武器。CRISPR/Cas 系統(tǒng)由成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)基因序列CRISPR與Cas基因家族共同組成。CRISPR基因序列主要包括3部分：基因前端的前導(dǎo)序列、短而高度保守的重復(fù)序列以及大量間隔序列。CRISPR 通過間隔序列與靶基因進(jìn)行識別并形成分子記憶，當(dāng)相應(yīng)的外源DNA 再次入侵時，CRISPR/Cas 系統(tǒng)可發(fā)揮精準(zhǔn)靶向作用［1］。Cas 基因也稱CRISPR關(guān)聯(lián)基因，位于CRISPR基因周圍或分散在基因組其他位點(diǎn)，編碼的蛋白可與CRISPR 序列發(fā)生作用。根據(jù)編碼蛋白的不同可將CRISPR/Cas 系統(tǒng)分成單Cas蛋白復(fù)合體和多Cas蛋白復(fù)合物2類，分別包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型和Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型［2］。其中Ⅱ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)中的Cas9蛋白已廣泛應(yīng)用于基因工程。

1.2 CRISPR/Cas9的作用原理

第一步：俘獲外源基因。Cas1和Cas2蛋白識別出首次入侵的外源DNA 的前間隔區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）區(qū)域，選取與PAM鄰近的靶基因進(jìn)行切割，進(jìn)而將這一靶基因序列整合至CRISPR 序列前導(dǎo)區(qū)下游，作為一種分子記憶來防止同一外源基因的后續(xù)入侵［3］。第二步：sgRNA-Cas9 復(fù)合物的合成。CRISPR 基因進(jìn)行表達(dá)，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，CRISPR 序列轉(zhuǎn)錄形成前體crRNA（precursor RNA， pre-crRNA）和 反 式 激 活CRISPR RNA （trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA），隨后pre-crRNA 在RNase Ⅲ核酸酶的加工剪切下成熟。成熟的crRNA（CRISPR RNA）與tracrRNA 結(jié)合組成sgRNA， Cas 蛋白與sgRNA 組成最終的復(fù)合物［4］。第三步：靶向干擾。復(fù)合物通過與識別出的PAM 序列相結(jié)合。由Cas9 酶的HNH（作用于與crRNA 互補(bǔ)的鏈）和RuvC（作用于非互補(bǔ)鏈）核酸酶結(jié)構(gòu)域切割入侵基因［5］，DNA 雙鏈被解開，形成“R-Loop”（圖1）。當(dāng)存在同源DNA 序列時，斷裂位點(diǎn)可進(jìn)行精確的同源重組修復(fù)（homology directed repair，HDR）。源DNA 序列時，斷裂位點(diǎn)將依靠DNA 連接酶進(jìn)行非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）［6］。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用原理

1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)促進(jìn)腫瘤基因水平治療突破性發(fā)展，如構(gòu)建腫瘤模型、靶向敲除癌基因致病位點(diǎn)、恢復(fù)抑癌基因活性、減少腫瘤細(xì)胞耐藥性、進(jìn)行腫瘤免疫治療等。Ciampricotti 等［7］使用CRISPR/Cas9 體細(xì)胞編輯技術(shù)獲得RLF-Mycl 基因融合的小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer， SCLC）小鼠模型，與人類RLF-MYCL SCLC 的基因表達(dá)相似。RLFMYCL融合加速了小鼠SCLC的轉(zhuǎn)化和增殖，增加了轉(zhuǎn)移性傳播和轉(zhuǎn)移部位的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR 技術(shù)敲除肺癌患者程序性死亡受體-1（programmed cell death protein 1，PD-1）可促進(jìn)T 細(xì)胞啟動免疫反應(yīng)肺癌［8］。Dong 等［9］發(fā)現(xiàn)敲除RNA解旋酶DHX37 基因可提高抗原特異性CD8+T 細(xì)胞對 三 陰 性 乳 腺 癌（triple negative breast cancer，TNBC）免疫治療靶點(diǎn)上的有效性。Kim 等［10］使用CRISPR 技術(shù)編輯的CD33 基因敲除的造血干細(xì)胞和原代細(xì)胞可以產(chǎn)生功能性造血，但對抗原靶向治療有抵抗力，不受CD33靶向CAR-T細(xì)胞的影響，使CAR-T 細(xì)胞免疫治療急性髓系白血病成為可能。Wang等［11］對TNBC小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)CRISPR基因剔除（knockout， KO）篩選發(fā)現(xiàn)，在癌細(xì)胞中刪除E3泛素連接酶Cop1 會減少巨噬細(xì)胞相關(guān)趨化因子的分泌，減少腫瘤巨噬細(xì)胞浸潤，增強(qiáng)抗腫瘤免疫力，并加強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）治療癌癥。CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)基因敲除肽基丙基異構(gòu)酶A （peptidylprolyl isomerase A，PPIA），有效提高了多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對蛋白酶體抑制劑的敏感程度［12］。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)

設(shè)計(jì)的特異sgRNA 與非靶位點(diǎn)DNA 序列形成錯配，導(dǎo)致基因位點(diǎn)發(fā)生非預(yù)期的突變，稱為脫靶效應(yīng)（off-target effects）。非靶位點(diǎn)的sgRNA 局部錯配的形式有2 種：（1）脫靶DNA 序列與sgRNA 只出現(xiàn)堿基的錯誤匹配，長度一致；（2）脫靶DNA序列與sgRNA的長度不同，通過DNA序列的插入或缺失使其出現(xiàn)堿基錯配［13］。研究顯示，脫靶不僅會降低基因組編輯效率，還會導(dǎo)致染色體的重新排列，甚至?xí)茐牟煌耆ヅ涞幕颍?4］。除此之外，還可能會導(dǎo)致功能基因喪失活性［15］。

2.1 影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶的因素

2.1.1sgRNA 對脫靶的影響 sgRNA 與靶序列的錯誤匹配是造成脫靶現(xiàn)象的關(guān)鍵因素。研究顯示，在一定范圍內(nèi)，體內(nèi)sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的相對濃度越低，靶點(diǎn)的專一性越高［16］。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)研究顯示［17］，短sgRNA序列與標(biāo)準(zhǔn)sgRNA序列相比，前者的脫靶率更低；且脫靶出現(xiàn)的概率和sgRNA序列與靶基因sgRNA序列的同源程度呈正相關(guān)。研究表明，在不降低切割活性的基礎(chǔ)上，將sgRNA 5’端的2 ～3個堿基截短，能夠大大降低脫靶率［18］。綜上表明，sgRNA本身序列、濃度、長度及其與靶基因的同源性在一定程度上決定CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶向性。

2.1.2PAM對脫靶的影響 PAM序列是區(qū)分靶序列與其他DNA序列的一段高度保守區(qū)域，其可以限制基因組的編輯［19］。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯過程中，Cas1、2 蛋白和sgRNA-Cas9 復(fù)合體先后對PAM序列進(jìn)行特異性識別［20］，最終精準(zhǔn)獲取目的基因。金黃色釀膿葡萄球菌Cas9蛋白（staphylococcus aureus， SaCas9）識別的PAM 區(qū)為NNGRRT，該系統(tǒng)用于體內(nèi)基因組編輯，即表明使用較長的PAM 序列，潛在的脫靶位點(diǎn)少，脫靶出現(xiàn)的可能性?。?1］。近來通過對sgRNA 的活性及特異性進(jìn)行檢測與評估，發(fā)現(xiàn)PAM 近端1 ～ 5 位堿基序列是更精準(zhǔn)地決定sgRNA特異性的種子區(qū)域（seed sequence）［22］。綜上所述，PAM自身序列、長度、鄰近的種子區(qū)域等在一定程度上能夠?qū)γ摪挟a(chǎn)生影響。

2.1.3Cas9 對脫靶的影響 Cas9 自身結(jié)構(gòu)、剪切活性、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度等在一定程度影響脫靶。野生型Cas9蛋白形成的雙鏈斷裂可致脫靶，通過對Cas9進(jìn)行改造可提高切割靶基因的特異性。Cas9 的HNH結(jié)構(gòu)域通過調(diào)控剪切活性，干預(yù)sgRNA與靶位點(diǎn)結(jié)合能力，進(jìn)而影響脫靶效應(yīng)。其中，Cas9 的剪切活性與錯配堿基的位置分布、數(shù)量密切相關(guān)。緊鄰PAM 序列的DNA-RNA 雙鏈錯誤匹配會降低Cas9活性，此外發(fā)生兩個或更多堿基的錯配對降低Cas9活性的程度遠(yuǎn)高于單堿基錯配［23］。研究顯示，Cas9 蛋白能容忍sgRNA 與DNA 的錯誤匹配，由此推測，一定范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)Cas9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的相對濃度越低，靶點(diǎn)的專一性越高［24］。通過修飾Cas9自身結(jié)構(gòu)，已形成多個高保真性Cas9 突變體，對脫靶的改進(jìn)具有質(zhì)的提升［20］。

2.1.4其他因素對脫靶的影響 Cas9與sgRNA作為CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的重要組成部分，二者既可相對獨(dú)立又可相互聯(lián)合對脫靶產(chǎn)生影響。研究顯示，體外Cas9/sgRNA 的豐度值過高，容易切割PAM 區(qū)域的非靶向位點(diǎn)，使sgRNA 錯配發(fā)生的機(jī)率升高［25］。此外，標(biāo)靶序列的CpG島甲基化也會對脫靶產(chǎn)生影響，CpG 島甲基化與基因沉默表達(dá)相關(guān)。研究表明，超過一定范圍，隨著甲基化程度增高，Cas9蛋白與標(biāo)靶基因的親和力降低，靶點(diǎn)結(jié)合的專一性降低，進(jìn)而增加脫靶效應(yīng)［26］。值得注意的是，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型也是影響脫靶的一個關(guān)鍵因素。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源基因?qū)氚唏R魚胚胎細(xì)胞和小鼠體內(nèi)［27］，其靶向突變率極高；而通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源基因?qū)肴薑562 細(xì)胞［28］，其脫靶率保持在較低水平，且CRISPR/Cas9 系統(tǒng)具有較高的活性。

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的優(yōu)化方法

2.2.1以sgRNA為基礎(chǔ)的改進(jìn)策略

2.2.1.1修飾sgRNA 研究證實(shí)，sgRNA 的基因編輯準(zhǔn)確率和特異性同sgRNA種子區(qū)GC含量成正比，當(dāng)GC 含量在40% ～ 60%時，不易發(fā)生脫靶；當(dāng)在sgRNA 的5’末端添上2 個G 堿基時，可降低脫靶事件的發(fā)生率［29］。Kocak等［30］將sgRNA 5'端設(shè)計(jì)延伸20個核苷酸，使其自身折疊形成發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)并插入到間隔上，發(fā)夾結(jié)構(gòu)指導(dǎo)RNA（hairpin construction， hp-sgRNA）可以作為R 環(huán)形成的空間和能量屏障，阻斷SpCas9 構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚悦摪泻嗣?，?dǎo)致Cas9 特異性的增加。死亡RNA 脫靶抑制（dead RNA off-target suppression， dOTS）方法中，脫靶位點(diǎn)可以通過協(xié)同使用dead-RNAs （dRNAs）來屏蔽活性Cas9-sgRNA 復(fù)合體，截短的引導(dǎo)RNA 直接與Cas9 結(jié)合但不切割。dRNAs 可以在保持對靶標(biāo)編輯的同時，以最小的優(yōu)化有效抑制大范圍的脫靶［31］。

研究發(fā)現(xiàn)，對PAM 近端、遠(yuǎn)端的sgRNA 堿基序列進(jìn)行調(diào)整可使目標(biāo)位點(diǎn)DNA 發(fā)生精確斷裂。如果PAM 遠(yuǎn)端第15 個堿基是胞嘧啶，可以提高sgRNA 的特異性；對于PAM 近端sgRNA 序列來說，種子區(qū)第1 個堿基通常選擇鳥嘌呤，因鳥嘌呤使sgRNA 有更大的折疊傾向，形成的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，脫靶出現(xiàn)減少［32］。

2.2.1.2截短sgRNA 序列 CRISPR/Cas9 的基因靶向性會受到sgRNA 序列長短的影響［33］。降低脫靶率最快捷簡便的方法就是將sgRNA截短，但這一方法可能會導(dǎo)致特異性sgRNA 與靶點(diǎn)結(jié)合的效率降低。如果把常用的由20 個核苷酸組成的sgRNA引導(dǎo)序列截短2 ～ 3個核苷酸，則既能保證靶向結(jié)合位點(diǎn)的效率，還可使脫靶的發(fā)生比例降低［34］。

2.2.1.3采用RE-DSRNP 技術(shù)策略 RE-DSRNP（reporter RNA enriched dual-sgRNA/CRISPR/Cas9 ribo-nucleoproteins）的方法通過使用雙sgRNA 結(jié)合報(bào)告RNA富集CRISPR/Cas9核糖核蛋白，最終生成精確編輯的供體細(xì)胞，以供基因組學(xué)和疾病研究［35］。RE-DSRNP 技術(shù)優(yōu)勢在于雙sgRNA 精準(zhǔn)靶向系統(tǒng)具有較高的編輯效率、較低的脫靶效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用RE-DSRNP 來生產(chǎn)帶有野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1 （WIP1）基因缺失的克隆豬時，在32頭斷奶克隆豬中，31頭（97%）攜帶WIP1編輯，15頭（47%）為設(shè)計(jì)的片段缺失的純合子，使用該方法后沒有檢測到脫靶事件。

2.2.1.4采用Bi-PE 策略 新型編輯技術(shù)先導(dǎo)編輯（prime editing，PE）能直接支持小規(guī)模的靶向點(diǎn)突變、精準(zhǔn)插入和刪除，同時不會導(dǎo)致DNA 雙鏈的斷裂，但編輯效率較低。2022 年，四川大學(xué)姚少華團(tuán)隊(duì)［36］提出雙向啟動編輯（Bi-PE）策略，其在目前優(yōu)化的先導(dǎo)編輯（PE）工具基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，通過nick sgRNA 定位在prime editing guide RNA（pegRNA）的模板序列附近，并且將2 個引導(dǎo)RNA 工程化為pegRNA 以實(shí)現(xiàn)Bi-PE，大大提高靶向準(zhǔn)確性和基因編輯的效率。

2.2.2以Cas9為基礎(chǔ)的改進(jìn)策略

2.2.2.1突變體Cas9 策略 Cas 蛋白有2 個核酸酶結(jié)構(gòu)域RuvC和HNH，RuvC負(fù)責(zé)切割與sgRNA互補(bǔ)的DNA，HNH負(fù)責(zé)切割另一條DNA。當(dāng)Cas活性位點(diǎn)H840A失活時，得到僅具有切割DNA的1條鏈能力的nCas9（Cas9 nickase）［37］；當(dāng)2 個活性位點(diǎn)D10A和H840A均失活時，得到無切割能力的dCas9（dead Cas9）［38］。融合dCas9 和野生型Fok I 核酸內(nèi)切酶的功能結(jié)構(gòu)域，得到融合蛋白dCas9-Fok I，由核酸內(nèi)切酶Fok I 行使切割雙鏈DNA 的作用，核酸內(nèi)切酶Fok I 需要進(jìn)行二聚化才發(fā)揮切割作用。融合蛋白d Cas9-Fok I 單體只有和2 個sgRNA 結(jié)合在一起時才有切割能力，進(jìn)而形成正確的雙鏈切口，降低脫靶［39］。

2.2.2.2SpCas9變體 普遍運(yùn)用于基因編輯的化膿性鏈球菌Cas9 （streptococcus pyogenes， SpCas9）識別的PAM 序列為NGG。若將N 固定為一種核苷酸或?qū)AM 序列延長，均可則可減少Cas9 識別的目標(biāo)序列，提高靶向?qū)Ｒ恍裕?0］。

2015 年，D1135V/R1335Q/T1337R（VQR）和D1135V/G1218R/R1335E/T1337R（VRER）等變體相繼衍生。VQR-SpCas9 變體在位點(diǎn)分析結(jié)果中，耗盡了帶有NGAN 的PAM 位。VRER-SpCas9 變體在定量分析增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）中，于NGCG PAM 上顯示最高的活性［41］。這些變體的全基因組特異性更好，極大地保證了靶向效應(yīng)的準(zhǔn)確性。此外，有研究者使用噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)（phage-assisted continuous evolution， PACE）得 到 了SpCas9 變 體xCas9，經(jīng)過相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其可識別更廣泛的PAM序列（NG、GAA 和GAT 等），兼容性更廣，一定程度上擴(kuò)大了基因靶向范圍，同時新的變體表現(xiàn)出更高的特異性［42］。研究人員篩選了一個在REC3域攜帶隨機(jī)突變的SpCas9變體庫，確定了既可以保證編輯效率同時具有較高編輯準(zhǔn)確性的突變體，如HypaCas9。另外發(fā)現(xiàn)，通過結(jié)合4 個有益突變生成的evoCas9 變體的保真度超過野生型，其目標(biāo)編輯效率與野生型保持一致。與HypaCas9 相比，evoCas9 的特異性更高，產(chǎn)生的脫靶位點(diǎn)更少［43］。通過變體對PAM 序列進(jìn)行限定或拓展進(jìn)而降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)到目前為止仍在探索研究。

2.2.2.3SaCas9 變體 SaCas9 通常被用于進(jìn)行體內(nèi)的基因組編輯，但是野生型SaCas9在單核苷酸分辨率上有脫靶效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在不影響靶標(biāo)效率的前提下，可設(shè)計(jì)具有高度特異性的全基因組活性的SaCas9 工程變體（SaCas9-HF）。在15 名受試者中，該變體幾乎不會對目標(biāo)基因位點(diǎn)發(fā)生偏離，并且在一些極易發(fā)生脫靶的序列位點(diǎn)處，SaCas9-HF與野生型相比其脫靶活性也顯著降低。對該變體做進(jìn)一步改變并命名為KKH-SaCas9，其具有更大的PAM識別范圍，脫靶活動也顯著減少［44］。利用定向篩選系統(tǒng)，研究者在人類細(xì)胞中鑒定出了增強(qiáng)保真度SaCas9（efSaCas9），可以有效地辨別單堿基對發(fā)生的不匹配情況，并進(jìn)一步避免該情況的發(fā)生［45］。

2.2.2.4改變Cas9 蛋白的帶電性 Slaymaker等［46］發(fā)現(xiàn)，改變Cas9 蛋白的氨基酸帶電性，如把正電性氨基酸殘基變?yōu)殡娭行?，會減少與非靶向鏈的互補(bǔ)作用，降低脫靶率。

2.2.2.5終止Cas9 酶活性 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯可永久逆轉(zhuǎn)病理性DNA突變，在完成治療性DNA 修飾后需要終止Cas9 酶活性，避免潛在的非靶向編輯。

實(shí)驗(yàn)證明，用抗寡核苷酸可以關(guān)閉Cas9 活性，從而減少或防止非目標(biāo)DNA編輯，開辟了一條通過Cas9 核糖核蛋白失活提高基因編輯安全性的途徑［47］。在臨床應(yīng)用中，若只需要在一個組織中編輯目標(biāo)基因，那么在非目標(biāo)組織中預(yù)先給予抗寡核苷酸可防止非靶向效應(yīng)。針對此問題，利用熒光偏振技術(shù)對SpCas9-PAM 的相互作用進(jìn)行初步篩選分析，通過結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系確定了抑制SpCas9 的藥效團(tuán)為BRD0539，BRD0539 通過與NGG 競爭或結(jié)合到變構(gòu)點(diǎn)來發(fā)揮作用，可以有效停止對非靶向基因的編輯［48］。通過以核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）形式傳遞Cas9和sgRNA限制Cas9活性的持續(xù)時間，減少脫靶突變效應(yīng)［49］。

在噬菌體和質(zhì)粒等遺傳元件中存在抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR proteins， ACR），其中該蛋白家族的AcrIIA17 和AcrIIA18，也已被研究證實(shí)可以通過調(diào)節(jié)sgRNA來抑制Cas9活性［50］。

2.2.2.6開發(fā)Cas9同源蛋白 來自于不同細(xì)菌種類的Cas9 蛋白具有不同的識別PAM 序列的能力，所以如果改變Cas9蛋白的細(xì)菌來源，可以在一定程度上減少脫靶事件的發(fā)生。腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9 （neisseria meningitidis， Nm Cas9）識別的PAM序列為5’-NNNRRT-3’或5’-NNNNGMTT-3’［51］，由于PAM序列較長，Cas9識別PAM的特異性更高，出現(xiàn)脫靶的可能性減少。同樣識別較長PAM 序列的還有嗜熱鏈球菌Cas9（streptococcus thermophilus，St1Cas9）［52］、空 腸 彎 曲 桿 菌Cas9 （campylobacter jejuni， CjCas9）［53］。

2.2.3改進(jìn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送方式 CRISPR/Cas9系統(tǒng)本身組件為大分子，需整合至細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。目前體外遞送技術(shù)有一定發(fā)展，如電穿孔［54］、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染等［55］。許多體內(nèi)遞送系統(tǒng)正不斷改進(jìn)，如用由疏水尾的二硫鍵組成的生物可還原脂質(zhì)納米BAMEAO16B 輸送［56］、質(zhì)粒/病毒載體遞送［57］、非病毒載體遞送［58］、新型病毒載體遞送［59］、結(jié)合質(zhì)粒供體DNA 模板和Cas9-RNP 方法［60］、選擇性響應(yīng)加速基因遞送系統(tǒng)（HPT-PFs）［61］、新型基因遞送載體（CA3S2）［62］。最新開發(fā)的低脫靶效應(yīng)的CRISPR /Cas9 質(zhì)粒和模板DNA 傳遞系統(tǒng)-CRISPR/Cas9 復(fù)合聚乙烯亞胺磁性納米顆粒（polyethyleniminemagnetic nanoparticles，PEI-MNPs），PEI-MNPs 有效提高基因編輯的安全性和實(shí)用性［63］。

2.2.4其他優(yōu)化方法 （1）集成學(xué)習(xí)框架的提出。有研究者提出將一系列單一非目標(biāo)預(yù)測工具與基因組注釋聯(lián)合應(yīng)用，把多種組合進(jìn)行比較，擇出最優(yōu)組合，最大限度提高對非目標(biāo)活動的預(yù)測［64］。該研究協(xié)同工具進(jìn)行CRISPR/Cas9脫靶預(yù)測以實(shí)現(xiàn)整體洞察和實(shí)際應(yīng)用，對精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)有重要研究價值。（2）利用高通量方法CHANGE-seq，用于在體外確定CRISPR/Cas9 核酸酶的全基因組活性，探究影響Cas9活性的靶向和非靶向序列的因素，預(yù)測非靶點(diǎn)活性，選擇出高度特異的靶點(diǎn)，識別與非靶點(diǎn)突變相關(guān)的染色質(zhì)特征，并測量人的遺傳和變異對核酸酶活性的影響［65］。（3）應(yīng)用去甲基化技術(shù)。表觀遺傳學(xué)相關(guān)的理念也可以用于降低脫靶率的發(fā)生。TET1 作為一種雙加氧酶，可以幫助啟動DNA 去甲基化。將TET1 催化結(jié)構(gòu)域（TET1-CD）連接到已插入噬菌體MS2 RNA 的sgRNA2.0 系統(tǒng)，引導(dǎo)dCas9和MS2 菌噬菌體涂層蛋白來靶向特定基因組位點(diǎn)去甲基化，有效降低脫靶率［66］。（4）減少Cas9/sgRNA復(fù)合物的濃度。以質(zhì)粒為工具轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，若直接減少sgRNA 用量或者改變所用的啟動子種類來影響sgRNA 的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到降低復(fù)合物濃度的目的，降低脫靶［67］。但需要通過實(shí)驗(yàn)確定合適的Cas9/sgRNA 濃度，盡可能避免復(fù)合物濃度的減少所帶來的切割效率降低。

3 小結(jié)與展望

作為一種新穎的基因治療法，CRISPR/Cas9 技術(shù)因精準(zhǔn)高效、易于操作等優(yōu)勢，已逐漸成為具有前瞻性、創(chuàng)新性的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，展現(xiàn)出強(qiáng)大的臨床應(yīng)用潛力。目前，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)與多種技術(shù)結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對腫瘤等相關(guān)疾病的精準(zhǔn)治療。但是，明確和優(yōu)化脫靶效應(yīng)是當(dāng)前解決臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一，同時也需重點(diǎn)關(guān)注CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送方式地改進(jìn)、提高脫靶檢測準(zhǔn)確度的方法等。希望通過研究人員的不懈努力，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)將會不斷優(yōu)化，在醫(yī)學(xué)等各領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突