介紹一種新型普魯士藍(lán)與油紅O套染的技術(shù)方法

陳 菲，李 麗，包春娟

鐵死亡是一種與傳統(tǒng)細(xì)胞凋亡、壞死、自噬不同的新型細(xì)胞程序性死亡，其主要機(jī)制是在鐵離子或酯氧合酶的作用下，催化細(xì)胞的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生大量的活性氧，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[1]。其中鐵胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與鐵蛋白自噬釋放鐵離子、不飽和脂肪酸聚合和氧化均需利用病理技術(shù)手段來(lái)鑒定。因此，涉及普魯士藍(lán)與油紅O染色兩類特殊染色技術(shù)，常規(guī)方法是用連續(xù)2張組織切片分別染色、觀察結(jié)果，弊端是無(wú)法在1張切片上直觀展示兩者的相關(guān)性。本文首次采用肺鐵死亡模型樣本進(jìn)行前固定，冷凍切片后將兩種染色套染，最終在1張切片上呈現(xiàn)鐵顆粒和脂滴的分布關(guān)系，以鑒定造模成功與否，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料冷凍組織OCT包埋劑(Thermo NEG50)，一次性刀片(Thermo MX35 ULTRA)，蘇木精(Thermo Hematoxylin 7211)，普魯士藍(lán)染色試劑盒(Solarbio G1422)，油紅O染色試劑盒(珠海貝索614041)，針式濾膜過(guò)濾器(Millipore 0.22ìm SLGP033RB)，5 mL無(wú)菌注射器，4%多聚甲醛，蔗糖溶液，巴氏滴管，吸水紙，緩沖甘油，冷凍切片機(jī)(Thermo NX70)，顯微鏡(Olympus BX51)。

1.2 方法

1.2.1冷凍切片 小鼠肺鐵死亡標(biāo)本10例，戊巴比妥處死后取肺組織，分割成單葉后立即置于4%多聚甲醛中，瓶口處塞入棉球使組織完全浸泡液體于4 ℃冰箱固定24 h、轉(zhuǎn)入15%蔗糖溶液8 h、30%蔗糖溶液24 h脫水處理，待肺葉沉底后，取出放于吸水紙上，吸除多余水分并擠適量冷凍組織OCT包埋劑浸泡15 min(圖1)。冷凍托盤加入少量OCT，待凝固后放置肺葉呈橢圓形方向涂膠包埋速凍、制片(圖2)。切片厚8 μm，貼于粘附載玻片，自然風(fēng)干備用。

1.2.2普魯士藍(lán)與油紅O套染 本實(shí)驗(yàn)分為兩部分染色，均選用商品化試劑盒。(1)新鮮配置亞鐵氰化鉀和稀鹽酸混合液(將A1：Perls stainA與A2：Perls stainB等量混合)，在肺組織切片上滴染1 min，顯微鏡下控制，用巴氏滴管吸取去離子水充分清洗后，瀝水、平鋪于濕盒。(2)取油紅O染液與水3 ∶1混合，用注射器吸取并接入針式濾膜過(guò)濾器上端，勻速推注射器使染液經(jīng)過(guò)濾器從下端流出，均勻滴在切片組織上[2]，30 s后用巴氏滴管從側(cè)面清洗。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1 min，去離子水清洗3次，緩沖甘油封固。

2 結(jié)果

肺組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，普魯士藍(lán)與油紅O套染顯示，鐵顆粒呈藍(lán)綠色，脂滴呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色(圖3)。鐵顆粒與脂滴的分布廣泛，兩者既有獨(dú)立區(qū)域也有共染區(qū)域(圖4)，肺鐵死亡模型造模成功。

①②③④

3 討論

隨著鐵死亡的深入分析，如鐵過(guò)載導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病(阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈病、帕金森綜合征等)、急性腎損傷、心臟缺血性損傷、遺傳性血色病、腫瘤的發(fā)生與鐵死亡失衡亦有關(guān)聯(lián)[3-6]，對(duì)于缺血-再灌注損傷模型的建立有重大意義。普魯士藍(lán)與油紅O套染法在同一張切片上可直觀了解鐵離子與脂質(zhì)的關(guān)系，整個(gè)染色操作簡(jiǎn)便、用時(shí)短，對(duì)鐵顆粒及脂質(zhì)有良好保護(hù)作用，其優(yōu)勢(shì)已成為特殊染色中不可或缺的技術(shù)手段。

本套染技術(shù)難點(diǎn)在于肺組織主要由各級(jí)支氣管分支及終末的大量肺泡組成含有大量氣體的海綿狀結(jié)構(gòu)。新鮮肺組織行冷凍切片易形成大面積空洞造成組織丟失；油紅O染色為防止脂滴被破壞僅能使用冷凍切片；普魯士藍(lán)染色多為石蠟切片，冷凍切片方法鮮有報(bào)道，染色時(shí)間需嚴(yán)格把控。因此，將肺組織前固定再行冷凍切片的設(shè)計(jì)方案，既能有效減少肺部空氣，又可保存鐵顆粒及脂滴的形態(tài)，其可行度高。本科室經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)摸索及重復(fù)后，已獲得穩(wěn)定及良好的染色效果：(1)4%多聚甲醛較為溫和、穿透力較強(qiáng)并能使組織硬化，可有效保護(hù)抗原、細(xì)微結(jié)構(gòu)及脂類物質(zhì)，常用于冷凍切片、細(xì)胞培養(yǎng)、心臟灌注等；蔗糖梯度脫水能減少組織中水分的殘留[7]。4%多聚甲醛及蔗糖溶液均用0.01 mol/L PBS配制最佳，其具有鹽平衡可調(diào)整pH值，起緩沖、溶解保護(hù)試劑的作用，可有效防止甲醛氧化生成甲酸，使長(zhǎng)時(shí)間浸泡的鐵離子溶解丟失。因此，首選PBS作為溶劑。(2)肺組織較為特殊，固定時(shí)切忌漂浮狀態(tài)。由于肺內(nèi)含空氣體積較輕，易漂浮于固定液表面，放入器皿時(shí)用紗布或棉球覆蓋，固定液為體積的30～50倍，搖床振蕩可促進(jìn)肺固定[8]；也可用4%多聚甲醛灌注后再取材固定。(3)肺葉取出時(shí)需吸除多余水分，用適量OCT包埋劑浸泡15 min以上，使包埋劑充分滲透到組織內(nèi)部，填充疏松的肺泡腔，與包埋劑更融合。(4)若組織較小或較薄時(shí)，冷凍托盤需加入少量OCT包埋劑墊高，需在常溫涂抹后再冷凍，避免溫差過(guò)大導(dǎo)致組織在切片過(guò)程中脫落。包埋劑沿長(zhǎng)軸呈橢圓形涂抹使切片受力面積小，減少皺褶產(chǎn)生；冷凍切片必須使用粘附載玻片，不宜立即水洗，應(yīng)自然風(fēng)干30 min以上再操作，可有效防止脫片。(5)普魯士藍(lán)與油紅O染色套染順序?qū)Y(jié)果影響較小，本實(shí)驗(yàn)先用油紅O染色再套染普魯士藍(lán)，由于使用了針式濾膜過(guò)濾器[2]，避免異丙醇分色且整個(gè)操作用時(shí)短，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如使用傳統(tǒng)油紅O染色法建議先染脂滴，防止異丙醇清洗導(dǎo)致普魯士藍(lán)褪色。(6)普魯士藍(lán)染液應(yīng)現(xiàn)配、現(xiàn)用，勿使用金屬鐵制品容器，清洗切片時(shí)以去離子水為宜，防止普通水中含有鐵質(zhì)影響染色結(jié)果。染色時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制，避免過(guò)染。(7)區(qū)分核固紅與油紅O的顏色，本實(shí)驗(yàn)選用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，染色效果良好。封片使用起保濕作用的緩沖甘油，切忌使用含乙醇或二甲苯的封片劑，導(dǎo)致脂滴溶解。該套染方法已獲得研究者認(rèn)可，順利完成50余例肺鐵死亡模型的染色，建議推廣使用。