宋河大曲放線菌的分離鑒定及其混菌作用

苑建偉，崔夢(mèng)嬌，侯小歌，梁晨晨

1.周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)牧工程學(xué)院（周口 466000）；2.周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院（周口 466000）

放線菌是一類主要呈菌絲狀生長(zhǎng)和以孢子繁殖的陸生性較強(qiáng)大的原核生物，其代表屬有鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬、放線菌屬等[1]，被廣泛應(yīng)用于抗生素、各種酶制劑、有機(jī)酸和維生素等的生產(chǎn)，同時(shí)也應(yīng)用于烴類發(fā)酵、石油脫蠟和污水處理等方面，但有些放線菌會(huì)對(duì)人類構(gòu)成危害[2]。

大曲作為中國(guó)濃香型白酒的主要糖化發(fā)酵劑，富含酵母菌、細(xì)菌、霉菌和放線菌，放線菌作為白酒釀造微生物中的一類，在培曲和糟醅發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生纖維素酶，破壞谷物細(xì)胞壁，利于淀粉釋放，提高淀粉的利用率[3]。同時(shí)大多放線菌可產(chǎn)生大量次級(jí)代謝產(chǎn)物，尤其是抗生素，對(duì)多種菌種均有抑制作用，因此大曲中放線菌的種群結(jié)構(gòu)和功能特性直接影響大曲的質(zhì)量，進(jìn)而影響濃香型白酒的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。近年來(lái)，對(duì)白酒釀造過(guò)程中放線菌的研究主要集中在其對(duì)白酒風(fēng)味的影響及發(fā)酵過(guò)程中對(duì)其他菌群的抑制作用[5-6]。

宋河白酒作為豫東地區(qū)的典型代表，對(duì)其釀酒微生物的研究已有不少報(bào)道，但是對(duì)白酒中放線菌的研究較少。以宋河大曲為原料，對(duì)放線菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其中典型的放線菌與宋河大曲其他主要菌株的相互作用進(jìn)行初步探索，以期對(duì)改善白酒風(fēng)味、放線菌的利用與開(kāi)發(fā)提供方法和理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

高氏一號(hào)培養(yǎng)基[7]、糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基[8]、淀粉培養(yǎng)基[9]、明膠培養(yǎng)基[10]、硝酸鹽培養(yǎng)基[11]、指示紅曲霉菌培養(yǎng)基[12]、指示酵母菌培養(yǎng)基[13]、指示芽孢菌培養(yǎng)基[14]（所有培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃、0.1 MPa高溫高壓滅菌20 min待用）。

電子天平（型號(hào)AL204），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)（型號(hào)JJ-CJ-2FD），蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)DHP-9162），上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；滅菌鍋（型號(hào)SYQ-PSX-280B），上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)V-5000），上海元析儀器有限公司生產(chǎn)；等。

1.2 放線菌的分離

將大曲粉碎，在無(wú)菌條件下取10 g粉碎樣品加入90 mL無(wú)菌水，搖床振蕩30 min后靜置，做梯度稀釋。取10-2，10-3和10-4梯度進(jìn)行涂布平板，于30 ℃倒置培養(yǎng)5～7 d，在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中篩選數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)放線菌和具有明顯特征的放線菌單菌落分別純化后低溫保藏備用[15]。

1.3 放線菌形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

主要包括菌落特征和濕室培養(yǎng)的顯微鏡細(xì)胞觀察[16]。

1.3.2 生理生化特性試驗(yàn)

1.3.2.1 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)

將放線菌接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)5 d。取清潔的載玻片，在載玻片上滴1滴3% H2O2，挑取1環(huán)菌絲，在H2O2溶液中涂抹，5 min內(nèi)觀察是否有氣泡產(chǎn)生[17]。

1.3.2.2 耐鹽試驗(yàn)

在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中分別加入3%，5%和8% NaCl配制成耐鹽培養(yǎng)基，將待測(cè)菌絲接種到耐鹽培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，以未添加NaCl的高氏一號(hào)培養(yǎng)基為對(duì)照，觀察放線菌生長(zhǎng)情況[17]。

1.3.2.3 生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)

將分離得到的放線菌各接種4個(gè)平板，分別在30，34，37和42 ℃條件下培養(yǎng)7 d，觀察對(duì)比放線菌的生長(zhǎng)情況[17]。

1.3.2.4 硝酸鹽還原試驗(yàn)

將1環(huán)菌絲接種于還原硝酸鹽培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)7 d后，分別加入硝酸鹽還原試劑甲液和乙液各2滴[17]。

1.3.2.5 淀粉水解試驗(yàn)

用點(diǎn)種法將菌種接種在淀粉瓊脂培養(yǎng)皿上，于30℃培養(yǎng)7 d，在菌落周圍滴加1～2滴碘液，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象[17]。

1.3.2.6 明膠液化試驗(yàn)

在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中加入1%明膠，傾注平板。將平板分區(qū)分別點(diǎn)種，培養(yǎng)5 d，在菌落上滴加Frazier試劑，10～20 min后觀察菌體周圍是否出現(xiàn)透明圈[17]。

1.3.2.7 糖發(fā)酵試驗(yàn)

制備果糖、葡萄糖、麥芽糖液體培養(yǎng)基，分裝到不同的試管中，將1環(huán)放線菌接種到3種液體培養(yǎng)基中，并在試管內(nèi)放入杜氏小管，在30 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察液體是否變紅，杜氏小管中是否有氣泡，確定放線菌對(duì)糖醇的利用情況[17]。

1.3.2.8 Voges Proskauer（VP）試驗(yàn)

吸取2滴0.5%肌酸溶液注入潔凈小試管中，取1環(huán)放線菌菌絲接種。加入3滴5%α-萘酚，2滴40% KOH溶液，振蕩后放置5 min，觀察顏色是否變化[17]。

1.4 典型混菌作用研究

1.4.1 放線菌對(duì)大曲酒曲優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)的抑制作用

制備放線菌菌懸液，使用不含瓊脂的高氏一號(hào)培養(yǎng)基按5%接種量接種放線菌，在28 ℃條件下，搖床培養(yǎng)7～10 d。

分別挑取大曲數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)芽孢菌Sp1、Spm1、Spm2，耐高溫酵母菌Y1、Y2，以及10環(huán)紅曲霉菌菌苔，加入到20 mL無(wú)菌水中，搖勻，制備菌懸液，依次按10倍梯度稀釋。取1 mL合適稀釋度的菌懸液涂布在酵母菌指示平板上，分別做好標(biāo)記。用鑷子夾住直徑約1 cm的無(wú)菌圓濾紙片，蘸取少許放線菌發(fā)酵液，貼到有各指示菌平板上，每個(gè)平板上貼3～4片，在30 ℃條件下培養(yǎng)3 d，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，如果出現(xiàn)抑菌圈，精確測(cè)量各個(gè)抑制圈直徑（R/cm），并計(jì)算抑制圈直徑與濾紙片的直徑（r/cm）的差值（R-r/cm）。通過(guò)比較差值大小，分析放線菌典型抑菌活性。

1.4.2 放線菌對(duì)大曲典型菌株的混合發(fā)酵作用

分別挑取10環(huán)芽孢菌、酵母菌、紅曲霉菌，加入到20 mL無(wú)菌水中，搖勻，制備菌懸液，依次10倍梯度稀釋。按2%接種量，分別將芽孢菌Sp1、Spm1、Spm2，酵母菌Y1、Y2及紅曲霉菌這6種菌的種子液接入液態(tài)基本培養(yǎng)基中，按接種量1%接入放線菌。未接種放線菌的為空白對(duì)照，做2組平行試驗(yàn)，在28 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)5～7 d。

采用分光光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定淀粉酶活力，采用蒸餾法和酒精計(jì)測(cè)定法測(cè)定其產(chǎn)酒力，采用滴定法測(cè)定酯化酶活力[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌的分離鑒定

從宋河高溫大曲中共分離純化到5株放線菌，分別編號(hào)為F1、F2、F3、FM、Fh，菌株的典型菌落特征和鏡檢特征如圖1所示。

圖1 放線菌的菌落特征和鏡檢特征

分離得到的各種放線菌的生理生化特性如表1所示。放線菌F1、F2、F3、Fh、FM均能利用葡萄糖、麥芽糖和果糖，明膠液化及VP試驗(yàn)均為陽(yáng)性，均不能使硝酸鹽還原；F2、Fh含有過(guò)氧化氫酶，F(xiàn)1、F3、FM不含過(guò)氧化氫酶；F1、F2能使淀粉水解，F(xiàn)3、Fh、FM不能使淀粉水解。根據(jù)溫度生長(zhǎng)情況可知：F1、F2、F3、FM為中溫菌，F(xiàn)h為中高溫菌；F1、F2耐鹽性較強(qiáng)，F(xiàn)3耐鹽性一般，F(xiàn)M、Fh耐鹽性較弱。

綜合圖1和表1可知：菌株F1、F3、Fh、FM這4株放線菌形態(tài)基本上相同，生理生化特征也基本相似，參照《微生物分類學(xué)》《鏈霉葛鑒定手冊(cè)》[19-20]，F(xiàn)1、F3、Fh、FM這4株放線菌基本上都符合放線菌鏈霉菌屬的特征，F(xiàn)2基本符合放線菌擬諾卡菌屬的特征，故初步鑒定放線菌F1、F3、Fh、FM為鏈霉菌屬，F(xiàn)2為擬諾卡菌屬。

表1 放線菌的生理生化特性

2.2 放線菌與大曲典型菌株的混菌作用

2.2.1 放線菌對(duì)大曲典型菌株生長(zhǎng)的抑制作用

放線菌F1對(duì)大曲3類典型菌株的抑菌情況如表2所示。菌株F1對(duì)酵母菌Y1、Y2的生長(zhǎng)抑制作用較大，對(duì)芽孢菌Spm1、Spm2的抑菌作用較小，對(duì)芽孢菌Sp1、紅曲霉菌沒(méi)有抑制作用。由此可知，放線菌F1并不影響芽孢菌Sp1、紅曲霉菌的生長(zhǎng)，但不能與酵母菌Y1、Y2混合生長(zhǎng)，在糟醅發(fā)酵過(guò)程中不利于產(chǎn)酒。

表2 菌株F1抑菌情況 單位：cm

放線菌F2的抑菌情況如表3所示。菌株F2對(duì)芽孢菌Spm2的生長(zhǎng)有抑菌作用，對(duì)其他2株芽孢菌沒(méi)有抑菌作用，對(duì)酵母菌Y1、Y2的生長(zhǎng)也有抑菌作用，對(duì)紅曲霉菌的生長(zhǎng)沒(méi)有抑菌作用。由此可知，放線菌F2對(duì)部分芽孢菌生長(zhǎng)有抑制，對(duì)酵母菌抑制能力低于放線菌株F1，在白酒生產(chǎn)上可以加以利用。

表3 菌株F2抑菌情況 單位：cm

放線菌F3的抑菌情況如表4所示。菌株F3對(duì)酵母菌Y2生長(zhǎng)抑制作用非常明顯，對(duì)酵母菌Y1、芽孢菌Spm2也有抑制作用，對(duì)其他菌株沒(méi)有抑制作用。由此可知，菌株F3對(duì)酵母菌抑制作用強(qiáng)，不利于白酒生產(chǎn)。

表4 菌株F3抑菌情況 單位：cm

菌株FM的抑菌情況如表5所示。放線菌FM對(duì)所有菌都有抑制作用，對(duì)紅曲霉菌的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)其他菌株的生長(zhǎng)也有不同程度的抑制作用，不利于培曲和糟醅發(fā)酵。

表5 菌株FM抑菌情況 單位：cm

菌株Fh的抑菌情況如表6所示。菌株Fh對(duì)酵母菌Y2、Y1和芽孢菌Spm1、Spm2也有抑制作用，對(duì)芽孢菌Sp1、紅曲霉菌并沒(méi)有抑制作用。

表6 菌株Fh抑菌情況 單位：cm

在大曲培養(yǎng)和糟醅發(fā)酵過(guò)程中，放線菌與其他菌株混雜生長(zhǎng)，芽孢菌Sp1和紅曲霉菌分別作為大曲數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)菌和重要的功能性菌株，除放線菌株FM外，其他放線菌并不影響其生長(zhǎng)，但5株放線菌均能抑制酵母菌的生長(zhǎng)，因此放線菌對(duì)制曲影響不大，但不利于糟醅發(fā)酵。

2.2.2 放線菌與大曲典型菌株的液態(tài)發(fā)酵作用

2.2.2.1 放線菌對(duì)優(yōu)勢(shì)芽孢菌產(chǎn)淀粉酶能力的影響

由表7可知：除放線菌Fh使芽孢菌Sp1，放線菌F2、F3、Fh使芽孢菌Spm1產(chǎn)淀粉酶能力增強(qiáng)外，其余放線菌對(duì)芽孢菌的產(chǎn)酶能力的影響均表現(xiàn)為抑制，但是抑制效果并不明顯，所以在液體發(fā)酵過(guò)程中放線菌對(duì)芽孢菌的產(chǎn)淀粉酶能力并不明顯，并且可以利用放線菌Fh提高芽孢菌Sp1的產(chǎn)淀粉酶能力。

圖2 淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表7 放線菌對(duì)芽孢菌產(chǎn)淀粉酶能力的影響單位：U/mL

2.2.2.2 放線菌對(duì)大曲紅曲霉菌產(chǎn)酯化酶能力的影響由表8可知：放線菌F1使紅曲霉菌的產(chǎn)酯化酶能力升高，菌株F2、Fh和FM使紅曲霉菌產(chǎn)酯化酶能力降低，但并不明顯，菌株F3對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶能力沒(méi)有影響。由此可知，在白酒生產(chǎn)過(guò)程中合理利用菌株F3能使紅曲霉菌產(chǎn)酯化酶能力提高，達(dá)到提高白酒品質(zhì)的目的。

表8 放線菌對(duì)酒曲優(yōu)勢(shì)紅曲霉菌產(chǎn)酯化酶能力的影響單位：U/mL

3 結(jié)論

通過(guò)以宋河大曲為試驗(yàn)材料分離放線菌并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，分離得到5種放線菌F1、F2、F3、Fh、FM，其中F1、F3、Fh、FM為放線菌鏈霉菌屬，F(xiàn)2為擬諾卡氏菌屬。

分別采用抑菌片法和液態(tài)發(fā)酵法考察放線菌對(duì)大曲優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)抑制和相互作用，5株放線菌均抑制大曲酵母菌的生長(zhǎng)但并不抑制其產(chǎn)酒力，除放線菌株FM外，其他4株不抑制大曲優(yōu)勢(shì)芽孢菌Sp1和紅曲霉的生長(zhǎng)，5株放線菌均不同程度地抑制芽孢菌Spm1和Spm2的生長(zhǎng)和產(chǎn)淀粉酶能力，但影響并不大。放線菌F1使紅曲霉菌的產(chǎn)酯化酶能力升高，其余4株并不影響其產(chǎn)酶。