不同種植年限對特殊藥材土壤化學(xué)性質(zhì)和微生物多樣性的影響

張英英，魏玉杰，吳之濤，楊憲忠

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅 武威 733006；2.甘肅省特種藥源植物種質(zhì)創(chuàng)新與安全利用重點實驗室，甘肅 武威 733006；3.武威市祁連山區(qū)道地中藥材生態(tài)栽培技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 武威 733006)

特殊藥材包含嗎啡、可待因等30多種生物堿[1]，是重要的藥源植物，其果實的乳汁、果殼、種子嫩苗均可入藥，有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、止咳等多種藥用功效。生產(chǎn)上特殊藥材采用封閉式管理，在同一地塊連續(xù)種植十余年，導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)惡化，霜霉病等病害頻發(fā)，使植株長勢變?nèi)?，產(chǎn)量和品質(zhì)下降，這已成為影響特殊藥材規(guī)范化栽培和生產(chǎn)的重要問題。特殊藥材輪作倒茬在實際生產(chǎn)中難以運用，連作模式難以避免，深入了解特殊藥材連作障礙的產(chǎn)生機理，探索能夠緩解或克服其連作障礙的有效方法已成為特殊藥材種植過程中亟待解決的關(guān)鍵問題。

連作障礙是多種原因共同作用的結(jié)果，前人研究發(fā)現(xiàn)造成連作障礙的原因有以下3點：一是土壤養(yǎng)分失衡，有害代謝產(chǎn)物積累，礦質(zhì)元素含量發(fā)生變化，特別是隨種植年限的增加，養(yǎng)分供給不平衡，微生物種群失衡，導(dǎo)致土壤質(zhì)量嚴重下降[2]；二是連作后土壤微生物結(jié)構(gòu)及多樣性的變化，導(dǎo)致土壤性質(zhì)惡化，微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，主要表現(xiàn)為根際土壤微生物由細菌型向真菌型發(fā)展[3]；三是藥材自身根系分泌物的毒害作用，植株地上部和根系會分泌出某些特殊物質(zhì)抑制其生長和發(fā)育，產(chǎn)生自毒作用，包括酸類、酯類等已被報道的化感自毒物質(zhì)很容易在土壤中積累，造成土壤理化性質(zhì)惡化并對植株的生物膜系統(tǒng)及保護酶系統(tǒng)造成損害，特別是隨著連作年限增加，根系分泌物增加，使得根際微生物群落失調(diào)，植株抗逆能力下降，根際環(huán)境逐漸變?yōu)樗嵝?，有利于真菌的生長而細菌數(shù)量則逐漸減少[4-5]。藥用植物與根際微生物之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系，藥用植物通過根系分泌物對根際微生物的多樣性和豐富度產(chǎn)生影響，而根際微生物的代謝產(chǎn)物對藥用植物的生長發(fā)育、營養(yǎng)吸收、抗病能力、品質(zhì)等都有重要的影響[4,6]。目前，對于藥用植物連作障礙的研究主要集中在地黃、三七、人參等方面[6-8]，引起連作障礙的原因也不盡相同。雖然各種緩解連作障礙的種植模式被不斷提出，但關(guān)于藥用植物連作障礙產(chǎn)生的機制以及根際微生物克服或緩解連作障礙的機制等問題還需更深入的研究。

本研究從藥用植物-土壤-微生物的互作關(guān)系方面入手，利用lluminaNovaSeq高通量測序技術(shù)，對不同種植年限特殊藥材根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行深度研究，并揭示根際微生物、環(huán)境因子之間的相互關(guān)聯(lián)及其互作效應(yīng)，為克服特殊藥材種植引起的連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗概況及土壤樣品的采集

試驗地位于平原和沙漠戈壁邊緣交匯地帶，平均海撥1 700 m，年平均氣溫約7.6℃，多年平均降水量約190 mm，年蒸發(fā)量約2 400 mm，年均日照時數(shù)2 724.8 h，年降水分布不均，主要集中在5—9月。試驗區(qū)土壤為灌漠土，試驗共設(shè)4個處理：種植特殊藥材1 a(Y1)，連續(xù)種植特殊藥材4 a(Y2)，連續(xù)種植特殊藥材24 a(Y3)，試驗地均屬同一封閉區(qū)域的相鄰地塊，因特殊性統(tǒng)一封閉管理，種植、施肥及其他管理措施保持一致，肥料種類及用量均一致；對照(CK)為同一封閉區(qū)域沒有種植過特殊藥材的相鄰地塊，當年施肥量與其他處理一致。于開花期每個處理樣地隨機選取15株特殊藥材，收集根系表面0～5 mm的土壤，混合均勻，一部分保存于-80℃低溫冷凍用于DNA提取，一部分風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)測定，一部分4℃冰箱保存，用于土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量測定。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

有機質(zhì)、pH值、電導(dǎo)率、全氮、堿解氮、全磷、有效磷、速效鉀、有效態(tài)銅、有效態(tài)鋅、有效態(tài)鐵、有效態(tài)錳均參照鮑士旦等[9]的相關(guān)標準方法進行測定；銨態(tài)氮、硝態(tài)氮分別用土壤銨態(tài)氮、土壤硝態(tài)氮試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))提取，SP-765型紫外可見光分光光度計(上海光譜儀器有限公司)測定。

1.3 土壤DNA提取和高通量測序

土壤微生物DNA提?。好總€土樣分別稱取0.500 g，3次重復(fù)，用PowerSoil?DNAIsolationKit試劑盒提取土壤微生物基因組總DNA。所有土壤樣品的細菌16SrDNAV3+V4區(qū)擴增用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和引物806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')進行，所有土壤樣品的真菌ITS1F-ITS2R區(qū)擴增用引物ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS2R(5'-GCTGCGTTCT-TCATCGATGC-3')進行，PCR產(chǎn)物由AMPureXTbeads(BeckmanCoulterGenomics，Danvers，MA，USA)純化，Qubit(Invitrogen，USA)定量。擴增子池用于測序，擴增子文庫的大小和數(shù)量分別在Agilent 2100生物分析儀(Agilent，美國)和Illumina(KapaBiosciences，Woburn，MA，美國)的文庫定量試劑盒上進行評估。在NovaSeq PE250平臺上對庫進行排序。樣品在Illumina NovaSeq平臺上進行測序，測序由TSINGKE提供。建庫和測序工作委托北京擎科生物科技有限公司完成。

1.4 測序數(shù)據(jù)處理與分析

使用Trimmomatic v 0.33軟件，對測序得到的RawReads進行過濾，然后使用Cutadapt 1.9.1軟件進行引物序列的識別與去除，得到不包含引物序列的CleanReads；再使用Usearchv 10軟件，通過overlap對每個樣品的CleanReads進行拼接，然后根據(jù)不同區(qū)域的長度范圍對拼接后數(shù)據(jù)進行長度過濾，使用UCHIMEv 4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)(Effective Reads)。劃分OTUs，進行多樣性分析、差異分析、相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0軟件，采用單因素方差分析方法，檢驗土壤化學(xué)性質(zhì)及高通量測序得到的微生物豐富度、多樣性指數(shù)之間的差異。檢驗水平為α<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種植年限對特殊藥材根際土壤化學(xué)性質(zhì)及微量元素的影響

由表1可知，不同種植年限對特殊藥材根際土壤的pH沒有顯著影響，但與CK相比，各處理均有下降。全氮、堿解氮、全磷、速效鉀、有效態(tài)鐵和有效態(tài)錳均表現(xiàn)為Y1處理顯著高于其他處理。有機質(zhì)含量Y1顯著高于Y3與CK，與Y2差異不顯著。有機質(zhì)、全氮、堿解氮、銨態(tài)氮、全磷、有效磷、有效態(tài)銅、有效態(tài)鐵、有效態(tài)錳含量整體均隨種植年限增加呈現(xiàn)先增后降趨勢。電導(dǎo)率與硝態(tài)氮均表現(xiàn)為Y3處理顯著高于其他處理，電導(dǎo)率分別為CK、Y1、Y2處理的7.20倍、4.26倍、2.00倍，硝態(tài)氮分別為CK、Y1、Y2處理的21.28倍、8.13倍、3.61倍，隨著種植年限增加表現(xiàn)出明顯的增加趨勢，均表現(xiàn)為Y3>Y2>Y1>CK；速效鉀表現(xiàn)為CK顯著低于Y1、Y3處理，與Y2處理差異不顯著，有效態(tài)鋅表現(xiàn)為Y1、Y2、Y3顯著高于CK，2個指標均表現(xiàn)為Y1>Y3>Y2>CK。

表1 不同種植年限對特殊藥材根際土壤化學(xué)性質(zhì)及微量元素的影響Table 1 Effects of different cropping years on soil chemical properties and trace elements of special medicinal rhizosphere soil

2.2 不同種植年限對特殊藥材根際土壤微生物α-多樣性指數(shù)的影響

α-多樣性指數(shù)是反映微生物群落豐富度和均勻度的綜合指標。由表2可知，細菌Coverage指數(shù)為0.9969～0.9970，真菌Coverage指數(shù)為0.9994～0.9997，表明其測序結(jié)果能夠全面反映土壤細菌和真菌的多樣性。不同種植年限對特殊藥材土壤細菌α-多樣性指數(shù)均無顯著影響，但Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)均表現(xiàn)為CK高于其他處理。除Chao1指數(shù)外，ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均隨著種植年限增加呈先增后降趨勢，土壤細菌豐富度和多樣性減少。真菌α-多樣性指數(shù)中ACE指數(shù)Y3顯著高于Y1、Y2，Chao1指數(shù)為Y3顯著高于Y1，Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)各處理間差異均不顯著。真菌α-多樣性指數(shù)均隨著種植年限先降后升，其中除Simpson指數(shù)外，Y1處理其余真菌α-多樣性指數(shù)均最小，后隨種植年限增加土壤真菌豐富度和多樣性增加。

表2 不同種植年限對特殊藥材根際土壤微生物α-多樣性指數(shù)的影響Table 2 Effects of different cropping years on microbial α-diversity index in rhizosphere soil of special medicinal materials

2.3 不同種植年限對特殊藥材根際土壤微生物群落OTU群落聚類的影響

如圖1A、1B所示(見155頁)，不同種植年限特殊藥材根際土壤細菌和真菌OTU數(shù)量存在一定差異，CK、Y1、Y2、Y3處理土壤細菌OTU數(shù)量分別為768、653、661、758，共有的土壤細菌OTU數(shù)量為467，CK、Y1、Y2、Y3特有OTU數(shù)量分別為79、38、30、81。CK、Y1、Y2、Y3處理土壤真菌OTU數(shù)量分別為334、293、315、356，共有的土壤真菌OTU數(shù)量為141，CK、Y1、Y2、Y3特有OTU數(shù)量分別為61、9、16、65。真菌和細菌群落特有OTU數(shù)量均為Y3處理最高，細菌、真菌群落OTU數(shù)量隨種植年限增加先降低后增加。

圖1 不同種植年限特殊藥材根際土壤細菌和真菌群落的OTU韋恩圖Fig.1 Venn diagram based on OTU of bacterial and fungal communities in rhizosphere soil of special medicinal materials with different cropping years

2.4 不同種植年限特殊藥材根際土壤微生物門水平上的群落組成

不同種植年限特殊藥材根際土壤細菌共有22門47綱106目187科380屬415種。其中細菌門水平上的群落組成及相對豐度如圖2A(見155頁)所示，細菌門水平前10位基本一致，分別為Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Rokubacteria(己科河菌門)、Nitrospirae(硝化螺旋菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)，其他類群的相對豐度占比為0.62%～3.61%。Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria為優(yōu)勢菌門，其中Proteobacteria在CK、Y1、Y2、Y3處理中的相對豐度分別為35.77%、40.03%、39.08%、41.30%，Y3最高，CK最低；Acidobacteria相對豐度分別為25.44%、12.36%、17.48%、15.12%，CK顯著高于Y1和Y3；Actinobacteria相對豐度分別為10.89%、16.86%、9.24%、12.74%，各處理間差異不顯著。在Chloroflexi 中Y1、Y2、Y3均高于CK，分別提高了45.91%、100.64%、39.00%，Y2與CK差異顯著；Bacteroidetes中Y1顯著高于CK，Rokubacteria中CK顯著高于Y1和Y3；與CK相比，Proteobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes相對豐度均升高，Acidobacteria、Rokubacteria相對豐度均降低。

不同種植年限特殊藥材根際土壤真菌共有12門25綱56目112科176屬189種。其中真菌門水平上的群落組成及相對豐度如圖2B(見155頁)所示，真菌優(yōu)勢菌門前3位基本一致，分別為Mortierellomycota(被孢霉門)、Ascomycota(子囊菌門)、Basidiomycota(擔(dān)子菌門)，其他類群的相對豐度占比為1.61%～11.86%。其中Mortierellomycota在CK、Y1、Y2、Y3處理中的相對豐度分別為49.64%、69.16%、54.21%、41.83%，Y1最高，Y3最低；Ascomycota相對豐度分別38.33%、23.92%、26.65%、41.28%；Basidiomycota相對豐度分別8.87%、5.30%、7.28%、10.27%，上述優(yōu)勢菌門各處理間差異均不顯著。其他類群中Olpidiomycota Y2處理顯著高于其他處理，Chytridiomycota Y3處理顯著高于Y1、CK處理。除CK外，其余各處理Mortierellomycota相對豐度隨種植年限增加呈降低趨勢，表現(xiàn)為Y1>Y2>Y3；Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota相對豐度隨種植年限增加而增加，均表現(xiàn)為Y3>Y2>Y1。

圖2 不同種植年限特殊藥材根際土壤微生物群落組成在門水平上的相對豐度Fig.2 Relative abundance of rhizosphere soil microbial community composition of special medicinal materials at phylum level in different cropping years

2.5 不同種植年限特殊藥材根際土壤微生物屬水平上的群落組成

如圖3A所示，不同種植年限特殊藥材根際土壤細菌優(yōu)勢屬前10位基本一致，包括Sphingomonas(鞘氨醇單胞菌屬)、未知菌RB41、Lysobacter(溶桿菌屬)和7種不可培養(yǎng)的未知菌屬。其他屬在CK、Y1、Y2、Y3處理中的相對豐度分別為56.56%、60.19%、58.04%、60.22%。優(yōu)勢菌屬Sphingomonas在CK、Y1、Y2、Y3處理中的相對豐度分別為5.33%、9.28%、10.53%、13.07%，Y2、Y3顯著高于CK。Subgroup6在各處理的相對豐度分別為11.52%、5.62%、7.83%、7.44%，CK顯著高于Y1。Gemmatimonadaceae在各處理的相對豐度分別為5.38%、4.26%、5.70%、5.11%，各處理間差異不顯著；RB41相對豐度分別為6.92%、2.99%、1.99%、1.38%，CK處理顯著高于其他處理。Xanthomonadaceae相對豐度分別為1.19%、3.32%、3.08%、4.65%，Y1、Y3處理顯著高于CK；Lysobacter相對豐度分別為1.95%、2.22%、1.61%、1.31%，Y1顯著高于Y3。其他未知菌屬間差異不顯著?？傮w上，Sphingomonas、Xanthomonadaceae相對豐度隨著種植年限增加呈明顯上升趨勢，RB41呈下降趨勢，Lysobacter呈先升后降趨勢。

如圖3B所示，在屬水平上土壤微生物真菌群落種類變化及相對豐度存在差異，4個處理中Mortierella(被孢霉屬)和Fusarium(鐮刀菌屬)是優(yōu)勢種群，Mortierella在CK、Y1、Y2、Y3處理中的相對豐度分別為49.54%、68.81%、53.86%、32.94%，各處理間差異不顯著；Fusarium在各處理的相對豐度分別為16.67%、4.18%、9.78%、22.34%，其中Y3顯著高于Y1、Y2，與CK不顯著。Solicoccozyma在各處理的相對豐度分別為2.89%、4.18%、2.41%、0.06%，Y1顯著高于Y3；Y2處理中Olpidium相對豐度達到7.86%，顯著高于其他處理；Y1處理Thelebolus相對豐度達到5.43%，顯著高于其他處理；Schizophyllum、Cladosporium、Aspergillus在Y3中的相對豐度分別為3.31%、0.80%和1.44%，均高于其他處理。Mortierella、Solicoccozyma、Thelebolus相對豐度均隨種植年限增加呈先增加后下降趨勢，F(xiàn)usarium、Schizophyllum、Cladosporium、Aspergillus相對豐度均隨種植年限增加呈先減少后增加趨勢。

圖3 不同種植年限特殊藥材根際土壤微生物群落組成在屬水平上的相對豐度Fig.3 Relative abundance of rhizosphere soil microbial community composition of special medicinal materials at genus level in different cropping years

2.6 土壤微生物群落PCoA分析

細菌群落PCoA分析結(jié)果表明(圖4A)，群落組成的變異受11個主坐標成分的控制，主坐標成分的特征值均大于0.523，其中前2個主坐標成分影響最大，PC1和PC2分別解釋38.64%和24.08%的方差變異，二者累計貢獻率為62.72%；PC1主坐標成分可將CK的細菌群落與Y1、Y2、Y3明顯區(qū)分開，PC2可將Y3與CK、Y1、Y2明顯區(qū)分開。除Y1外，其余處理組內(nèi)變異均較小。真菌群落PCoA分析結(jié)果表明(圖4B)，群落組成的變異受11個主坐標成分的控制，主坐標成分的特征值均大于1.146，其中前兩個主坐標成分影響最大，PC1和PC2分別解釋32.87%和17.22%的方差變異，二者累計貢獻率為50.09%，各處理間組間差異較大，但PC1處理能區(qū)分不同種植年限的真菌群落變化。

圖4 土壤微生物群落PCoA分析Fig.4 PCoA analysis of soil microbial community

2.7 環(huán)境因子對根際土壤微生物群落的影響

細菌群落RDA分析結(jié)果表明(圖5A)，RDA1和RDA2分別解釋29.85%和21.59%的方差變異，二者累計貢獻率為51.44%。土壤細菌群落主要受pH、電導(dǎo)率、硝態(tài)氮、有效磷、速效鉀的影響較大。其中，Acidobacteria、Rokubacteria、Nitrospirae與pH呈正相關(guān)，與其他環(huán)境因子呈負相關(guān)；土壤硝態(tài)氮和有效磷是影響Chloroflexi、Gemmatimonadetes、Planctomycetes的主要環(huán)境因子；Proteobacteria與pH呈負相關(guān)，與其他環(huán)境因子均呈現(xiàn)正相關(guān)；Firmicutes、Actinobacteria、Bacteroidetes與有機質(zhì)、全磷、堿解氮、速效鉀呈正相關(guān)。

真菌群落RDA分析結(jié)果表明(圖5B)，RDA1和RDA2分別解釋32.23%和16.91%的方差變異，二者累計貢獻率為49.14%。土壤真菌群落主要受pH、電導(dǎo)率、硝態(tài)氮、有效磷、全磷、銨態(tài)氮、堿解氮、有機質(zhì)的影響較大。Basidiomycota、Ascomycota、Chytridiomycota、Mucoromycota與電導(dǎo)率和土壤硝態(tài)氮呈正相關(guān)，Olpidiomycota與有效磷呈正相關(guān)；pH與Monoblepharomycota、Rozellomycota、Glomeromycota呈正相關(guān)，與其他環(huán)境因子呈負相關(guān);Zoopagomycota、Kickxellomycota與有機質(zhì)、全氮、全磷、堿解氮、速效鉀、銨態(tài)氮呈正相關(guān)。

注：OM—有機質(zhì)；TP—全磷；TN—全氮；AN—堿解氮；AK—速效鉀；AP—有效磷；EC—電導(dǎo)率；硝態(tài)氮；銨態(tài)氮。Note：OM-Organic matter；TP-Total phosphorus；TN-Total nitrogen；AN-Alkaline nitrogen；AK-Availablepotassium；AP-Available phosphorus；EC-Electrical nitrogen.圖5 土壤理化性質(zhì)與微生物群落RDA分析Fig.5 RDA analysis of soil physical and chemical properties and microbial community

3 討 論

3.1 種植年限對土壤理化性質(zhì)的影響

連作障礙效應(yīng)突出表現(xiàn)在土壤性質(zhì)惡化、養(yǎng)分失衡、微生物區(qū)系變化，病蟲害頻發(fā)及自毒作用嚴重等方面[2-4]。本研究表明隨著種植年限增加，土壤pH較對照下降，這與前人在附子、枸杞等[10-11]中藥材連作研究的結(jié)果相一致。可能是連作導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡，硝態(tài)氮大量積累，從而導(dǎo)致pH下降。本研究表明土壤有機質(zhì)、堿解氮、銨態(tài)氮、全磷、有效磷及微量元素含量均隨種植年限增加而呈現(xiàn)先增后降的趨勢，電導(dǎo)率和硝態(tài)氮含量隨種植年限增加而明顯增加。土壤硝態(tài)氮過量富集，直接導(dǎo)致土壤次生鹽漬化、養(yǎng)分失衡、土壤結(jié)構(gòu)破壞等問題[12]，這與叢微等[8]對人參連作土壤硝態(tài)氮含量顯著增加，影響人參吸收硝態(tài)氮的研究結(jié)果相一致。但王娟英等[13]研究認為懷牛膝連作土壤全磷、堿解氮、速效磷和速效鉀含量上升，而全氮、全鉀并無明顯變化。上述藥用植物連作后對土壤理化性質(zhì)的影響均與本研究結(jié)果存在差異，原因可能是不同藥用植物對養(yǎng)分的需求不同，養(yǎng)分吸收規(guī)律存在差異，長期連作可能會造成某些土壤營養(yǎng)元素缺乏或富集，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡[7]；另外不同地區(qū)、不同種類的藥用植物管理措施不同，施用的肥料種類、數(shù)量及土壤性質(zhì)有較大差異，連續(xù)的化肥過量施用打破養(yǎng)分平衡，可能導(dǎo)致土壤酸化，理化性質(zhì)變劣，加劇了根系化感自毒作用，根系產(chǎn)生的自毒化感物質(zhì)對土壤微生物種群數(shù)量、結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響[14]，這可能是造成連作障礙的重要原因。但有研究認為土壤理化性質(zhì)改變不是導(dǎo)致連作障礙的主導(dǎo)因子[15]，連作也可能改善土壤根際微環(huán)境，提高土壤養(yǎng)分狀況[13]。因此，不同藥用植物連作對土壤理化性質(zhì)的影響存在差異。

3.2 種植年限對土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

不同種植年限的特殊藥材土壤細菌α-多樣性中ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均隨著種植年限的增加呈先增后降趨勢，真菌α-多樣性中ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)Y3顯著高于Y1，真菌α-多樣性指數(shù)均隨著特殊藥材種植年限先降低后增加，土壤真菌豐富度和多樣性增加，土壤細菌豐富度和多樣性減少。這與地黃[6]、枸杞[11]、丹參[16]連作的研究結(jié)果基本一致，均表現(xiàn)為連作使土壤細菌群落微生物多樣性減少。但李晶晶等[17]研究認為隨種植年限增加，設(shè)施百合紅壤中細菌Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)顯著升高，真菌Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)顯著下降，連作可能導(dǎo)致土壤細菌微生物種群多樣化。這與本研究結(jié)果相反，可能與土壤類型、作物種類、栽培措施等不同有關(guān)。

土壤微生物群落失衡是導(dǎo)致藥用植物連作障礙的重要原因[3-5]。本研究表明不同種植年限特殊藥材根際土壤細菌群落門水平Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria為優(yōu)勢菌門，Proteobacteria與Actinobacteria各處理間差異不顯著，二者均為堿性土壤中的優(yōu)勢菌門，廣泛存在于各種類型土壤中，適應(yīng)性較強[18]。Acidobacteria隨著種植年限增加相對豐度下降，前人研究表明酸桿菌門在動植物殘體多聚物及纖維素降解、鐵循環(huán)、單碳化合物代謝等方面具有重要作用[19]，叢微等[8]研究認為酸桿菌門相對豐度的減少可能導(dǎo)致土壤中硝酸鹽、亞硝酸鹽和鐵等金屬含量的增加，不利于人參的生長，這與本研究結(jié)果相似。而李晶晶等[17]對設(shè)施百合連作研究認為酸桿菌門豐度隨連作年限增加而上升，變形桿菌和放線菌門的豐度則隨連作年限的增加呈下降趨勢，這與本研究結(jié)果存在較大差異，可能與作物種類、土壤類型不同相關(guān)。

本研究表明不同種植年限土壤細菌群落優(yōu)勢菌屬分別是Sphingomonas、未知菌RB41、Lysobacter等，Sphingomonas、Xanthomonadaceae隨著種植年限增加呈明顯上升趨勢。研究表明鞘氨醇單胞菌能夠耐受貧瘠和惡劣環(huán)境，其特殊的代謝調(diào)控機制能抵抗外界不利的環(huán)境變化，也能降解土壤中的有毒物質(zhì)[20]；連作引起的土壤養(yǎng)分失衡及土壤性質(zhì)惡化，可能激發(fā)鞘氨醇單胞菌防御機制和生物代謝，使其相對豐度增加。本研究還表明，連作使Xanthomonadaceae相對豐度明顯增加，Lysobacter相對豐度下降，與地黃、附子等[6,10]中藥材連作后土壤微生物群落變化研究結(jié)果相似，Xanthomonas致病形式多樣，侵染范圍廣，而Lysobacter對病原真菌等有突出的拮抗作用，在生物防治病原菌和線蟲方面優(yōu)勢明顯[21]。因此，土壤有益細菌減少、有害細菌增加是影響特殊藥材連作的重要原因，因現(xiàn)有分析手段有限，本研究還有很多未知屬種需進一步深入探究。

本研究表明土壤真菌群落門水平Mortierellomycota相對豐度隨種植年限增加呈先增后降趨勢，Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota隨種植年限增加而明顯增加。土壤真菌群落屬水平Mortierella、Solicoccozyma、Thelebolus均隨種植年限增加呈先增后降趨勢，F(xiàn)usarium、Cladosporium、Aspergillus均隨種植年限增加呈先降后增趨勢。大多研究認為，根際土壤中的病原微生物是植物發(fā)生土傳病害的主要來源，Yuan等[22]研究認為發(fā)病土壤中Ascomycota的相對豐度更高，而在健康土壤中Mortierellomycota更多，較高的尖孢鐮刀菌相對豐度是發(fā)病土壤的一個重要特征，而某些被孢霉真菌參與有機物料的降解，在提升產(chǎn)量以及改善土壤質(zhì)量方面具有重要作用[23]。栽培人參土壤優(yōu)勢真菌為子囊菌門、擔(dān)子菌門，人參連作導(dǎo)致子囊菌門的相對豐度增加[24]，二者是分解土壤中纖維素、降解高木質(zhì)素的關(guān)鍵菌群[25]，可能會促進微生物及周圍環(huán)境對植物組織的破壞，進而引起植物病害。鐮刀菌屬是引起農(nóng)作物病害的重要病原真菌之一，其侵染寄主范圍較廣，可引起作物根、莖、葉等腐爛，能產(chǎn)生真菌毒素等多種次生代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致作物發(fā)病減產(chǎn)[26]，這可能是引起特殊藥材連作障礙的重要原因。王悅等[27]認為鐮刀菌屬是丹參枯萎病和根腐病的主要病原菌，劉世鵬等[10]研究認為附子連作后鐮刀菌屬和木霉屬豐度增加，真菌群落結(jié)構(gòu)失衡，致使附子減產(chǎn)。而枝孢屬能寄生植物地上部分引起植物病害，是常見的病原真菌[28]。慕東艷等[29]對黑龍江省藥用植物根際土壤真菌多樣性調(diào)查認為Aspergillus、Fusarium是14種藥用植物根際土壤真菌的優(yōu)勢菌群，曲霉屬真菌是藥材主要污染菌之一[30]。因此，Mortierella等有益真菌減少，F(xiàn)usarium、Cladosporium、Aspergillus等有害真菌的增加可能是導(dǎo)致特殊藥材微生物菌群失衡、發(fā)生連作障礙的重要原因。

3.3 環(huán)境因子對根際土壤微生物群落的影響

本研究結(jié)果表明土壤細菌群落受pH、電導(dǎo)率、硝態(tài)氮、有效磷、速效鉀的影響較大；土壤真菌群落受pH、電導(dǎo)率、硝態(tài)氮、有效磷、全磷、銨態(tài)氮、堿解氮、有機質(zhì)的影響較大。Basidiomycota、Ascomycota、Chytridiomycota、Mucoromycota與電導(dǎo)率和土壤硝態(tài)氮呈正相關(guān)。連作可能影響土壤理化性質(zhì)及根系微生物生長代謝，使根系微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，有害微生物及致病菌增加，土壤pH、硝態(tài)氮、電導(dǎo)率等理化性質(zhì)改變是影響特殊藥材連作土壤微生物群落變化的重要因素。

4 結(jié) 論

隨著種植年限增加，特殊藥材根際土壤細菌豐富度和多樣性減少，土壤真菌豐富度和多樣性增加，Sphingomonas、Xanthomonadaceae等相對豐度明顯上升，未知菌屬RB41、Lysobacter相對豐度下降。Fusarium、Cladosporium、Aspergillus等有害真菌相對豐度呈先降后升趨勢，F(xiàn)usarium相對豐度增加是導(dǎo)致特殊藥材連作障礙的重要原因。特殊藥材連續(xù)種植24 a后，電導(dǎo)率與硝態(tài)氮含量顯著高于其他種植年份，土壤pH、硝態(tài)氮、電導(dǎo)率等理化性質(zhì)改變是影響特殊藥材連作土壤微生物群落變化的重要因素。