丹參萌發(fā)期抗旱性鑒定及抗旱指標(biāo)篩選

張紅瑞，張麗欣，李夢荷,2，何立威，楊丹丹，高致明

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,河南 鄭州 450046；2.新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453000；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長垣分院，河南 長垣 453400)

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)是唇形科鼠尾草屬植物，其干燥根及根莖為我國常用的大宗藥材[1]，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等功效[2-3]。萌發(fā)期是丹參整個生育期的第一個關(guān)鍵階段，直接影響其以后的生長發(fā)育與產(chǎn)量形成[4-6]。目前河南地區(qū)多采用育苗移栽的方式種植丹參，通常在第1年3—10月間播種育苗，10—11月初或第2年春季移栽。春播時，剛出土幼苗生長能力差，春季氣溫升高、光照增強，土壤容易失水；秋播時氣溫降低，雨水減少，常造成死苗[7]；夏播時，氣候炎熱、地表溫度高，受干旱影響而導(dǎo)致出苗率低、幼苗生長緩慢[8]，因此干旱是目前該地區(qū)丹參栽培面臨的主要問題之一。已有研究表明，適宜濃度的引發(fā)劑引發(fā)種子[7-8]和種子包衣[9]能提高丹參的發(fā)芽率及其抗旱性。選育萌發(fā)期抗旱性強的丹參種質(zhì)，鑒定其抗旱性是提高河南地區(qū)丹參產(chǎn)量和質(zhì)量的有效途徑之一。

目前，國內(nèi)外關(guān)于玉米、大麥、小麥、水稻等[10-13]作物的抗旱性鑒定和指標(biāo)篩選報道較多，而關(guān)于丹參的抗旱性研究相對較少。不同栽培類型因其遺傳背景、育種目標(biāo)及栽培方式的不同，抗旱性表現(xiàn)各異。因此，鑒定丹參種質(zhì)的抗旱性，篩選抗旱指標(biāo)，培育抗旱品種非常必要。種子萌發(fā)期是植物生命史中最為重要的階段，是對外界滲透脅迫響應(yīng)比較敏感的時期，逆境條件下植物在這一時期的表現(xiàn)對農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量具有決定性的作用，是進行抗旱性研究的重要時期[14]，且在這一時期進行抗旱性研究具有省時、容量大、環(huán)境因素影響小等優(yōu)點。因此本研究采用聚乙二醇(PEG-6000)模擬不同程度的干旱脅迫，研究丹參發(fā)芽率、發(fā)芽勢、胚芽長、胚根長、子葉長、子葉寬、十芽重等指標(biāo)對干旱脅迫的響應(yīng)，并通過主成分分析、相關(guān)性分析和隸屬函數(shù)分析等綜合分析方法明確不同丹參栽培類型的抗旱性，篩選丹參萌發(fā)期抗旱指標(biāo)，為丹參抗旱性評價體系的建立及抗旱性育種奠定基礎(chǔ)。

1 試驗設(shè)計

1.1 試驗材料

供試5份材料為課題組從前期收集的丹參野生種質(zhì)資源中篩選獲得(表1)。各類型間性狀差異明顯、性狀穩(wěn)定、整齊度高，適宜在河南省洛陽、南陽、三門峽等地區(qū)及類似生態(tài)類型區(qū)域種植。根段繁殖擴繁后收集種子，選用色澤一致、外觀均一、籽粒飽滿、無病蟲害的5個丹參栽培類型健康種子為供試材料。

表1 試驗材料Table 1 Tested material

1.2 PEG溶液配制

參照原小燕等[15]的配制方法分別將30、60、90、120 g PEG-6000溶解在1 000 mL蒸餾水中，即得到 3%、6%、9%、12%的PEG-6000溶液。本次萌發(fā)試驗PEG-6000脅迫濃度設(shè)置及材料選擇，均在前期預(yù)試驗基礎(chǔ)上進行。預(yù)試驗內(nèi)容如下：PEG-6000脅迫濃度為5%、10%、15%、20%、25%，基于丹參出苗率得出PEG-6000適宜脅迫濃度范圍為0%～15%。

1.3 試驗設(shè)計

挑選大小一致、種粒飽滿、外表完整的5種栽培類型丹參種子各150粒(3次重復(fù)，每次重復(fù)50粒)，用1%高錳酸鉀溶液消毒，蒸餾水沖洗干凈置于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底層平鋪雙層濾紙作為發(fā)芽床。分別加入10 mL蒸餾水、3 g·mL-1的PEG-6000溶液、6 g·mL-1的PEG-6000溶液、9 g·mL-1的PEG-6000溶液、12 g·mL-1的PEG-6000溶液，形成PEG-6000濃度分別為0%、3%、6%、9%、12%的5個處理，25℃恒溫培養(yǎng)。從種子置床之日起開始觀察，以胚根突破種皮1 mm、胚芽為種子長1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，定時記錄發(fā)芽的丹參種子數(shù)，記錄時長為10d。

1.4 調(diào)查項目

1.4.1 種子發(fā)芽率 種子置床后第10 天取出培養(yǎng)皿，調(diào)查參試材料各處理每個重復(fù)的發(fā)芽數(shù)，并計算發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=第10天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

1.4.2 種子發(fā)芽勢 種子置床后第5天取出培養(yǎng)皿，調(diào)查參試材料各處理每個重復(fù)的發(fā)芽數(shù)，并計算發(fā)芽勢。

發(fā)芽勢(%)=第5天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

1.4.3 胚根長、胚芽長、子葉長、子葉寬 各材料種子置床后第10天，各處理每個重復(fù)隨機取30粒發(fā)芽種子測定胚根長、胚芽長、子葉長及子葉寬，求其平均值。

1.4.4 十芽重 種子置床后第10天參試材料各處理每個重復(fù)隨機選取10株幼苗，用萬分之一天平稱量其芽鮮重，求其平均值[16]。

1.4.5 萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù) 萌發(fā)指數(shù)GI=∑(DG/DT)，DG為逐日發(fā)芽數(shù)，DT為DG對應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)(d)；活力指數(shù)VI=GI×最后1天測的胚根長[17]。

1.4.6 隸屬函數(shù)法對參試材料抗旱性評估 以抗旱相關(guān)生理及形態(tài)指標(biāo)測定結(jié)果為依據(jù)，參照郝小琴等[18]的隸屬函數(shù)分析法對丹參5個栽培類型的抗旱相關(guān)指標(biāo)的加權(quán)平均隸屬函數(shù)值進行計算，并分別綜合評價各品種的抗旱性。隸屬函數(shù)分析中涉及的相關(guān)參數(shù)的計算參照下式：

相對值(抗旱系數(shù))=測定值/對照值

標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)：

權(quán)重系數(shù)：

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參不同栽培類型各指標(biāo)對PEG脅迫的響應(yīng)

由表2可知，PEG模擬干旱脅迫處理后，不同栽培類型丹參萌發(fā)期的生長發(fā)育指標(biāo)發(fā)生了一系列的變化。B和C的發(fā)芽率、發(fā)芽勢隨著脅迫濃度的增加表現(xiàn)為先升高后降低再升高的雙峰趨勢，而其他3個栽培類型的發(fā)芽勢均表現(xiàn)為隨PEG濃度增加呈先升高再降低趨勢，低濃度(3%PEG-6000)處理促進作用最大，高濃度(12% PEG-6000)產(chǎn)生抑制；A、E發(fā)芽率與其發(fā)芽勢變化趨勢相同，而D的發(fā)芽率則表現(xiàn)為隨著脅迫濃度增大而逐漸減小的趨勢。5個丹參栽培類型中D在PEG-6000濃度為0%、3%、6%時發(fā)芽率均高于相同濃度處理下的其他材料，最高可達56.5%，C、D和E在12% PEG-6000下發(fā)芽率最低，僅為0%。低濃度(3%PEG-6000)處理對丹參種子的發(fā)芽及生長發(fā)育具有促進作用，但濃度過高(12% PEG-6000)會抑制丹參種子的萌發(fā)。隨著干旱脅迫程度的增大，除D外其他栽培類型發(fā)芽勢、發(fā)芽率表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，5個丹參栽培類型中除E 外子葉長和子葉寬也均表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，除A和D外其他類型的十芽重、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)均表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。各類型材料不同的指標(biāo)對干旱脅迫的反映表現(xiàn)趨勢不一致，敏感程度也不同，用單一指標(biāo)值進行抗旱性評價雖然簡單易行但具有片面性，故需運用多個指標(biāo)進行抗旱性綜合評價。

表2 不同干旱脅迫處理下丹參的主要形態(tài)指標(biāo)Table 2 Main morphological growth indexes of S. miltiorrhiza under different drought stress

5個丹參栽培類型在PEG-6000溶液的濃度達到12%時，種子萌發(fā)受到明顯抑制，其中C、D、E種子沒有萌發(fā)。9% PEG-6000濃度比6% PEG-6000濃度對A、B、D和E的胚芽長、胚根長、子葉長、子葉寬的傷害率高，對A、D和E的萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)傷害率也較高。因此，9% PEG-6000是較適宜的丹參種子萌發(fā)期抗旱性鑒定濃度。

2.2 利用主成分分析及相關(guān)性分析篩選抗旱鑒定指標(biāo)

對9個指標(biāo)的相對值(表3)進行主成分分析(表4)，結(jié)果表明，第1和第2主成分累積貢獻率達82.635%，表明前2個主成分概括了5個丹參栽培類型的9個指標(biāo)82.635%的數(shù)據(jù)信息。因此，提取出前2個主成分。第1主成分中，發(fā)芽勢、胚芽長、子葉長、子葉寬、十芽重、活力指數(shù)有較大的特征向量；第2主成分中胚根長和萌發(fā)指數(shù)有較大的特征向量。綜合2個主成分所攜帶的信息，可選2個主成分中8個較大的特征向量：發(fā)芽勢、胚芽長、子葉長、子葉寬、十芽重、胚根長、活力指數(shù)和萌發(fā)指數(shù)來概括9個指標(biāo)的大部分信息。然后對篩選出的8個綜合指標(biāo)的相對值進行因子分析。結(jié)果表明，前兩個因子的特征根λ>1，能夠充分概括絕大多數(shù)數(shù)據(jù)。提取出前2個因子，將具有相同本質(zhì)的變量歸為一類，把原來8個單項指標(biāo)轉(zhuǎn)換為2個新的相互獨立的綜合指標(biāo)(公因子)。根據(jù)公因子的載荷矩陣(表5)可以發(fā)現(xiàn)，第1個公因子F1中子葉長、子葉寬、十芽重有較大的載荷，可初步判斷第1個公因子反映的是丹參種子在PEG脅迫下子葉和胚芽的生長情況；第2個公因子F2中發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù)有較大的載荷，進一步說明在PEG脅迫下，發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)是比較明顯的抗旱指標(biāo)。因此根據(jù)2個公因子的載荷，可將子葉長、子葉寬、十芽重等劃為抗旱性主要鑒定指標(biāo)，發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù)等劃為重要指標(biāo)。

表3 不同干旱脅迫處理下丹參主要形態(tài)指標(biāo)相對值Table 3 Relative values of main morphological indexes of S. miltiorrhiza under different drought stress

表4 主成分分析結(jié)果Table 4 Results of principal components analysis

表5 各指標(biāo)因子載荷、特征根和貢獻率Table 5 Factor loading, characteristic root, and contribution rate of each comprehensive index

2.3 利用隸屬函數(shù)分析鑒定抗旱性

為了消除遺傳背景差異和單個指標(biāo)研究的局限性，本研究對9% PEG-6000脅迫下各抗旱指標(biāo)相對值的隸屬函數(shù)值與加權(quán)平均隸屬函數(shù)值進行綜合性分析。由表6可知，所測9個指標(biāo)的相對值變異系數(shù)變幅為64.01%～134.39%，說明本研究選用的丹參材料類型豐富，具有較好的代表性。以標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)賦予權(quán)重，求得各項指標(biāo)的隸屬函數(shù)值和綜合隸屬函數(shù)值(D值)，綜合值越大, 說明該栽培類型的抗旱性就越強，反之越弱。根據(jù)綜合隸屬函數(shù)值可得出丹參抗旱性強弱依次為E、C、B、D、A，其綜合隸屬函數(shù)值分別為：0.071、0.068、0.054、0.043、0.028，說明E和C抗旱能力相對較強，A的抗旱能力相對較弱。

3 討 論

萌發(fā)期是植物生長發(fā)育的起始階段，植物在這一時期最容易受到各種逆境脅迫，逆境脅迫通過影響出苗率和成苗率決定了全田基本苗數(shù)，最終影響產(chǎn)量構(gòu)成。所以在萌發(fā)期鑒定品種抗旱性對干旱地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。植物抗旱性鑒定一般采用土壤干旱和高滲溶液模擬干旱2種方法，其中聚乙二醇高滲溶液模擬干旱脅迫的方法簡單、可重復(fù)、穩(wěn)定，適合在萌發(fā)期快速鑒定大量品種(系)的抗旱性，目前已成為對很多植物種子在萌發(fā)期進行抗旱性研究的重要手段。本研究采用5個濃度的PEG-6000溶液對丹參萌發(fā)期抗旱性進行分析，根據(jù)發(fā)芽率和對各種指標(biāo)的傷害率情況將9%作為丹參萌發(fā)期抗旱性鑒定的適宜PEG濃度。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度PEG對種子萌發(fā)產(chǎn)生明顯的抑制作用，且各指標(biāo)對滲透脅迫的響應(yīng)并不一致，這與安永平等[19]、趙海明等[20]、王贊等[21]、鞠樂等[11]的研究一致。12% PEG-6000下C、D和E種子發(fā)芽率為0，可能是因為丹參種子在萌發(fā)初期會快速吸水以保證萌發(fā)所需水分，過高的滲透脅迫抑制種子吸水，從而導(dǎo)致其無法萌發(fā)。低濃度的PEG脅迫(3%或6%)促進部分栽培類型丹參種子的萌發(fā)及胚根、胚芽、子葉生長，這與趙方媛等[22]低濃度(10%，20%)PEG-6000有利于小黑麥種子萌發(fā)，并對幼苗根與胚芽的生長有一定促進作用的研究一致，與王濤等[23]低濃度的PEG處理有利于促進丹參種子萌發(fā)和保證出苗的研究結(jié)論一致。據(jù)表6 各指標(biāo)在9% PEG-6000的隸屬函數(shù)值的變異系數(shù)大小可知，發(fā)芽勢、子葉長、子葉寬的變異系數(shù)分別為134.39%、117.46%和133.03%，說明這3個指標(biāo)對干旱脅迫反應(yīng)較敏感。

表6 9% PEG-6000濃度時各抗旱相關(guān)指標(biāo)隸屬函數(shù)值Table 6 Membership function values of drought resistance indexes at 9% PEG-6000

鑒定作物的抗旱性除了選擇合適的評價指標(biāo)外，還有要有適宜的鑒定方法。隸屬函數(shù)法既能消除個別指標(biāo)鑒定帶來的片面性，又可使所有供試材料抗旱性具有可比性。主成分分析則可以在保證原有信息不損失的前提下，將復(fù)雜的多個單項指標(biāo)轉(zhuǎn)化為幾個綜合指標(biāo)。近年來主成分分析聯(lián)合隸屬函數(shù)法等多方法多指標(biāo)相結(jié)合手段已在胡麻[24]、酒用糯高粱[25]、谷子[26]、棉花[27]等作物抗旱性鑒定中廣泛運用。本研究利用主成分分析法將9個單項指標(biāo)轉(zhuǎn)化成2個主成分，選取其中特征向量較大的8個指標(biāo)，進一步進行因子分析，選擇在2個公因子上有較大載荷的6個相關(guān)指標(biāo)作為抗旱鑒定指標(biāo)。由于各指標(biāo)之間所用單位不同，因此結(jié)合加權(quán)隸屬函數(shù)法消除不同指標(biāo)間單位的差異，最后根據(jù)綜合隸屬函數(shù)值得出供試5個丹參材料的抗旱性強弱順序，篩選出抗旱性較強的種質(zhì)E。張樹林等[28]認(rèn)為萌發(fā)期抗旱性鑒定的關(guān)鍵指標(biāo)分別是芽長、發(fā)芽勢和根鮮重。張立坤等[29]運用主成分分析法結(jié)合綜合隸屬函數(shù)法評價了燕麥的抗旱性，篩選出萌發(fā)指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、鮮重、胚芽長、胚根長和發(fā)芽勢等抗旱鑒定指標(biāo)。不同試驗篩選出的抗旱鑒定指標(biāo)不同可能是因為研究材料不同。因此，依據(jù)生產(chǎn)實際需求，針對不同藥用植物開展種子萌發(fā)期干旱脅迫的耐旱試驗，篩選耐旱材料，對指導(dǎo)中藥材生產(chǎn)和選育耐旱品種意義重大。

4 結(jié) 論

本試驗采用隸屬函數(shù)法結(jié)合主成分分析法的抗旱性綜合評價方法對5個丹參栽培類型萌發(fā)期的抗旱性進行了綜合性評價。確定了9% PEG-6000為丹參種子萌發(fā)期抗旱性評價的適宜濃度，以綜合隸屬函數(shù)值為評價指標(biāo)得出5個丹參栽培類型的抗旱性為：豫丹參VE>豫丹參VC>豫丹參VB>豫丹參VD>豫丹參VA，其中豫丹參VE和豫丹參VC萌發(fā)期抗旱能力較強，可作為丹參抗旱育種和抗旱機理研究的優(yōu)異種質(zhì)。通過主成分分析和相關(guān)性分析篩選出了子葉長、子葉寬、十芽重、發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)作為丹參萌發(fā)期抗旱快速鑒定指標(biāo)。