蓬子菜中香葉木苷對(duì)華法林在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)影響的研究

崔明宇，隋 玥，胡啟萌，朱鳳梅，尹義鳳，于 超，閻雪瑩，蘇 慧

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

華法林是目前臨床上最為常用的口服香豆素類抗凝血藥物，在肺栓塞、心臟金屬瓣膜置換術(shù)后、房顫及下肢深靜脈血栓等血栓性疾病的抗凝預(yù)防與治療中占有重要地位[1]。由于華法林治療窗較窄，其抗凝效果需要通過國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，當(dāng)INR值高于或低于正常范圍，患者會(huì)出現(xiàn)出血或抗凝效果降低的不良反應(yīng)[2]。此外，華法林通過CYP2C9、CYP1A2、CYP3A4代謝[3]，當(dāng)與其他藥物聯(lián)合用藥時(shí)，可能存在藥物相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致抗凝效果發(fā)生明顯變化。隨著中西藥在抗凝治療中的聯(lián)用，中藥及天然藥物與華法林的相互作用越來越引起重視。香葉木苷為從蓬子菜中分離得到的一種黃酮苷[4]，其在薄荷[5]、檸檬[6]、佛手[7]、豆類、橄欖葉[8]等多種植物與食物中均有分布。臨床應(yīng)用香葉木苷及相關(guān)制劑進(jìn)行血栓性疾病的治療，能促進(jìn)下肢深靜脈血栓形成后的靜脈再通，減輕炎癥反應(yīng)，改善淋巴循環(huán)、毛細(xì)血管通透性和組織缺氧[9-10]，臨床可與華法林聯(lián)合治療下肢深靜脈血栓[11-12]，可提高溶栓有效率，改善下肢周徑[13]。但也有臨床報(bào)道，香葉木苷制劑與華法林聯(lián)用可引起腦室內(nèi)出血[14]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮對(duì)華法林在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)與藥效學(xué)具有影響，提示臨床應(yīng)用應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)并調(diào)整劑量[15]，但尚未有香葉木苷與華法林聯(lián)用的相互作用研究報(bào)道。有文獻(xiàn)研究表明，香葉木苷可抑制人體CYP2C9[16-17]和CYP3A4[18]的活性，推測(cè)其與華法林聯(lián)合應(yīng)用時(shí)會(huì)對(duì)華法林的體內(nèi)代謝過程產(chǎn)生影響，從而影響華法林抗凝療效和用藥安全。本研究考察了蓬子菜中黃酮類化合物香葉木苷對(duì)華法林在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)的影響，旨在為臨床香葉木苷與華法林的聯(lián)合用藥、個(gè)體化給藥方案及聯(lián)合應(yīng)用機(jī)制的深入研究提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為香葉木苷、蓬子菜制劑及其他含香葉木苷的中草藥與食物同華法林聯(lián)合應(yīng)用的有效性與安全性研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1儀器 LC-2010A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；XW-80A型渦旋混合器(上海醫(yī)用儀器廠)；SK8200H型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；LDZ4-2型自動(dòng)平衡離心機(jī)(常州市國立試驗(yàn)設(shè)備研究所)；BT25S型分析天平(德國Sartorius公司)；ZGDCY-12S型氮吹儀(上海梓桂儀器有限公司)。

1.2藥品與試劑 華法林鈉片(上海信誼藥廠有限公司，批號(hào)：18161201B，規(guī)格：2.5 mg/片)；香葉木苷(本實(shí)驗(yàn)室自提，純度>98%)；華法林對(duì)照品(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：J0206AS)；萘普生鈉對(duì)照品(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：J1010AS)；凝血酶原時(shí)間(PT)試劑(上海太陽生物技術(shù)有限公司，批號(hào)105446)；色譜甲純(dikma公司)，其他試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，體重(200±20)g，購于青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(魯)20200010。大鼠飼養(yǎng)于溫度(24±2)℃、濕度(50±5)%、12 h光照、12 h黑暗循環(huán)的動(dòng)物房。本研究嚴(yán)格遵守國家醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的相關(guān)規(guī)定，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4分組及給藥 將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。單劑量華法林組給予0.5%CMC-Na液灌胃，單劑量華法林+香葉木苷組給予香葉木苷藥液80.00 mg/kg(按人臨床常用劑量換算所得)灌胃，均每日1次，連續(xù)7 d；第8天，2組在上述干預(yù)基礎(chǔ)上再分別給予華法林藥液0.25 mg/kg(按人臨床常用劑量換算所得)灌胃1次。華法林穩(wěn)態(tài)組、華法林穩(wěn)態(tài)+香葉木苷組每天給予華法林藥液0.25 mg/kg灌胃，每日1次,連續(xù)8 d；第5天起，華法林穩(wěn)態(tài)組同時(shí)給予0.5%CMC-Na液灌胃，華法林穩(wěn)態(tài)+香葉木苷組同時(shí)給予香葉木苷藥液80.00 mg/kg灌胃，均每日1次。

1.5藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1色譜條件 色譜柱：TopsilC18(250 mm×4.6 nm)；流動(dòng)相∶甲醇-0.2%乙酸水(65∶35)；流速：1 mL/min；紫外檢測(cè)波長：284 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.5.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取華法林對(duì)照品10.00 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的華法林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。另精密稱取萘普生鈉對(duì)照品10.00 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的萘普生鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，進(jìn)一步稀釋得4 μg/mL的萘普生鈉內(nèi)標(biāo)液。

1.5.3血漿樣品的處理 精密吸取100 μL血漿置于離心管中，加入50 μL 4 μg/mL萘普生鈉內(nèi)標(biāo)液，加入2 mL甲醇，渦旋混合均勻，3 500 r/min離心10 min。精密移取上層有機(jī)相1.5 mL，40 ℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶。以0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣分析。

1.5.4方法學(xué)考察

1.5.4.1專屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿+華法林標(biāo)準(zhǔn)溶液+萘普生鈉內(nèi)標(biāo)液及給藥2 h后血漿樣品+萘普生鈉內(nèi)標(biāo)液，按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理后，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。華法林和萘普生鈉的保留時(shí)間分別為13.9 min和12.3 min，供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間一致，峰形良好，分離度符合要求，專屬性強(qiáng)。

A為空白血漿；B為空白血漿+華法林+萘普生鈉；C為含藥血漿+萘普生鈉；1為華法林；2為萘普生鈉圖1 高效液相色譜圖

1.5.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取華法林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，分別配制成濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 μg/mL的華法林標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取100 μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，40 ℃氮?dú)饬飨麓蹈?，分別加入空白血漿100 μL。余下按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理，記錄色譜圖。以華法林與萘普生鈉峰面積比(y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.310 2x+0.227 9(r=0.997 1)。線性范圍為0.5～3.5 μg/mL，其定量下限為0.5 μg/mL。

1.5.4.3準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 精密吸取華法林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，分別配制成濃度為1.0，2.0，3.0 μg/mL的華法林標(biāo)準(zhǔn)溶液各5份，分別吸取100 μL溶液，40 ℃氮?dú)饬飨麓蹈?，加入空白血漿100 μL。余下按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理，于同一天內(nèi)不同時(shí)間測(cè)定5次，連續(xù)3 d，記錄色譜圖，計(jì)算準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度、日間精密度。低、中、高濃度準(zhǔn)確度RE分別為92.06%，98.87%，102.07%，日內(nèi)精密度RSD分別為6.23%，2.69%，2.31%，日間精密度RSD分別為7.74%，2.98%，2.29%，符合生物樣品測(cè)定要求。

1.5.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取華法林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，分別配制成濃度為1.0，2.0，3.0 μg/mL的華法林標(biāo)準(zhǔn)溶液各5份，分別吸取100 μL溶液，40 ℃氮?dú)饬飨麓蹈?，加入空白血漿100 μL。余下按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理，于室內(nèi)放置24 h、-20 ℃保存15 d、3次凍融循環(huán)，記錄色譜圖，計(jì)算穩(wěn)定性。低、中、高濃度室內(nèi)放置24 h的RSD分別為3.44%，3.69%，3.69%，-20 ℃放置15 d的RSD分別為5.26%，2.31%，3.32%，3次凍融循環(huán)的RSD分別為7.69%，3.75%，2.79%，符合生物樣品測(cè)定要求。

1.5.5血漿樣品的采集與數(shù)據(jù)處理 單劑量華法林組、單劑量華法林+香葉木苷組灌胃華法林后開始計(jì)時(shí)，分別于第0.5，1，2，4，8，12，24，48，72，96，120，144 h采集眼內(nèi)眥靜脈血0.4 mL于肝素化離心管中，3 500 r/min離心10 min，分離血漿，于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。華法林穩(wěn)態(tài)組、華法林穩(wěn)態(tài)+香葉木苷組灌胃華法林后開始計(jì)時(shí)，分別于第1，2，3，4，5，6，7，8 天采集眼內(nèi)眥靜脈血0.4 mL于肝素化離心管中，3 500 r/min離心10 min，分離血漿，于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。各組均按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理，記錄華法林與內(nèi)標(biāo)物峰面積。應(yīng)用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件，求算各組華法林的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1血漿樣品的采集 單劑量華法林組、單劑量華法林+香葉木苷組灌胃華法林后開始計(jì)時(shí)，分別于第0，1，2，4，8，12，24，36，48，72 h采集眼內(nèi)眥靜脈血0.4 mL于枸櫞酸鈉管中，3 500 r/min離心10 min，分離血漿，于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。華法林穩(wěn)態(tài)組、華法林穩(wěn)態(tài)+香葉木苷組灌胃華法林后開始計(jì)時(shí)，分別于第1，2，3，4，5，6，7，8天采集眼內(nèi)眥靜脈血0.4 mL于枸櫞酸鈉管中，3 500 r/min離心10 min，分離血漿，于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.6.2PT的測(cè)定 冷凍的血漿樣品解凍后，取血漿樣品100 μL，37 ℃水浴3 min，迅速加入已預(yù)熱至37 ℃的PT試劑200 μL，混勻，立即計(jì)時(shí)，記錄凝血絮狀物出現(xiàn)的時(shí)間，即為PT。國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)的計(jì)算：INR=(PTexp/PTnor)ISI，其中ISI為國際敏感指數(shù)(ISI=1.24)，華法林單用0 h測(cè)定的PT為正常值(PTnor)，香葉木苷與華法林聯(lián)用測(cè)定的PT為實(shí)驗(yàn)值(PTexp)。

2 結(jié) 果

2.1藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 單劑量華法林+香葉木苷組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax，t1/2，AUC(0-t)，AUC(0-∞)和血藥濃度均較單劑量華法林組有所升高，但2組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；華法林穩(wěn)態(tài)+香葉木苷組聯(lián)合用藥后第1,2,3天華法林的血藥濃度均較華法林穩(wěn)態(tài)組有所升高，但2組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1和圖2、圖3。

表1 單劑量華法林組和單劑量華法林+香葉木苷組大鼠體內(nèi)華法林藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

圖2 單劑量華法林組和單劑量華法林+香葉木苷組大鼠華法林血藥濃度-時(shí)間曲線

圖3 華法林穩(wěn)態(tài)組和華法林穩(wěn)態(tài)+香葉木苷組大鼠華法林血藥濃度-時(shí)間曲線

2.2藥效學(xué)結(jié)果 單劑量華法林+香葉木苷組PT明顯長于單劑量華法林組(P<0.05)，INR明顯高于單劑量華法林組(P<0.05)；華法林穩(wěn)態(tài)+香葉木苷組PT明顯長于華法林穩(wěn)態(tài)組(P<0.05)，INR明顯高于華法林穩(wěn)態(tài)組(P<0.05)。見圖4及圖5。

圖5 華法林穩(wěn)態(tài)組和華法林穩(wěn)態(tài)+香葉木苷組大鼠PT和INR比較

圖4 單劑量華法林組和單劑量華法林+香葉木苷組大鼠PT和INR比較

3 討 論

華法林是最常用的抗凝劑，包括S與R型兩種光學(xué)異構(gòu)體，在人類和大鼠體內(nèi)，S-對(duì)映體比R-對(duì)映體更有效。華法林通過CYP450催化的代謝具有立體選擇性，其中R型由CYP1A2和CYP3A4代謝，S型主要由CYP2C9代謝[3]，所以對(duì)CYP2C9活性的影響與抗凝作用的變化相關(guān)性更強(qiáng)。本研究藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明，與單用華法林相比，香葉木苷與華法林聯(lián)用后華法林在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均有所增加，但不明顯。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮對(duì)大鼠CYP1A2活性有誘導(dǎo)作用，對(duì)大鼠CYP2C11活性的影響存在劑量差異，中低劑量對(duì)CYP2C11無明顯影響，高劑量抑制CYP2C11[15]，但其提取物香葉木苷對(duì)大鼠CYP2C11(與人體CYP2C9同源)具有一定的誘導(dǎo)作用，可能加快華法林的消除。另有文獻(xiàn)報(bào)道華法林由肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)入膽汁需由P-糖蛋白介導(dǎo)[19]，而香葉木苷可以抑制P-糖蛋白[20]，可能使華法林的轉(zhuǎn)運(yùn)、清除減少。因此推測(cè)蓬子菜中的香葉木苷對(duì)華法林在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響可能是對(duì)P-糖蛋白的抑制作用與對(duì)CYP2C11誘導(dǎo)作用的綜合結(jié)果，導(dǎo)致其與華法林聯(lián)用后華法林的血藥濃度有所增加，但藥動(dòng)學(xué)參數(shù)變化并不顯著。但有研究報(bào)道，香葉木苷在人體內(nèi)對(duì)CYP2C9[16-17]和CYP3A4[18]活性產(chǎn)生抑制作用，這與本研究結(jié)果恰恰相反，因此推測(cè)香葉木苷對(duì)CYP2C9活性的影響可能存在種屬間的差異性。

在藥效學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，與單用華法林相比，華法林香葉木苷與華法林聯(lián)用后PT延長，INR升高，說明香葉木苷能增強(qiáng)單劑量及穩(wěn)態(tài)華法林的抗凝作用。既往研究證實(shí)，香葉木苷可抑制內(nèi)源性和外源性凝血途徑，在外源性凝血途徑中，香葉木苷可使組織因子釋放減少，進(jìn)而減少其與凝血因子Ⅶ形成具有促酶活性的復(fù)合物，還能產(chǎn)生蛋白C系統(tǒng)，其與因子蛋白S一起滅活凝血因子Va與Ⅷa，共同產(chǎn)生抗凝血的作用[21]。華法林能抑制凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的活化，從而達(dá)到抗凝作用[22]。依此進(jìn)一步推測(cè)，香葉木苷與華法林聯(lián)用后抗凝作用的增強(qiáng)可能主要通過抑制外源性凝血途徑而實(shí)現(xiàn)，其綜合作用機(jī)制見圖6。

圖6 香葉木苷影響華法林抗凝作用的機(jī)制

綜上，香葉木苷與華法林聯(lián)用時(shí)，雖然華法林的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)變化不顯著，但抗凝作用的增強(qiáng)使得INR明顯增加，由于華法林的治療窗較窄，INR超出正常范圍易導(dǎo)致出血，故建議香葉木苷與華法林聯(lián)用時(shí)，在監(jiān)測(cè)血藥濃度的同時(shí)，應(yīng)增加INR監(jiān)測(cè)次數(shù)并警惕可能的出血風(fēng)險(xiǎn)，必要時(shí)調(diào)整用藥劑量避免出血的不良反應(yīng)。另外，香葉木苷除在蓬子菜中具有較高的含量，還存在于其他多種植物及水果中，其對(duì)CYP2C9和CYP3A4活性影響可能存在種屬之間的差異性，尤應(yīng)加以關(guān)注并展開深入的研究，這一發(fā)現(xiàn)將為含香葉木苷的中藥制劑、食物與華法林及其他藥物的相互作用研究，及臨床的安全合理用藥提供重要科學(xué)依據(jù)。因此，廣泛開展藥物相互作用研究可使中西醫(yī)結(jié)合治療更客觀、更科學(xué)，有效促進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合治療獨(dú)特方法理論體系的發(fā)展。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。