1例新型FGA基因純合突變導(dǎo)致的遺傳性纖維蛋白缺陷癥家系分析*

楊 敏，鐘碩賢，林榮萬(wàn)，蒙火鳳，譚會(huì)柳，譚碧玉，陳淑琴，劉煥亮，3，鄭 麗△

1.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，廣東廣州 510655；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院婦科，廣東廣州 510655；3.廣東省胃腸病學(xué)研究所，廣東廣州 510655

纖維蛋白原(FIB)是一個(gè)由Aα鏈，Bβ鏈和γ鏈3對(duì)多肽鏈組成的，由29個(gè)鏈間二硫鍵連接而成的相對(duì)分子質(zhì)量為340×103的糖蛋白。3條肽鏈分別由FIB α鏈(FGA)、FIBβ鏈(FGB)和FIBγ鏈(FGG)3個(gè)同源基因編碼[1]。遺傳性FIB缺陷癥(CFD)主要分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種類型，Ⅰ型為FIB數(shù)量減少，包括低纖維蛋白血癥和無(wú)纖維蛋白血癥；Ⅱ型則為患者血漿中FIB數(shù)量正?；驕p少，但活性水平不成比例的顯著降低，包括異常纖維蛋白血癥和低-異常纖維蛋白血癥[2]。CFD是一種罕見的染色體隱性遺傳疾病，主要是由于FIB基因突變導(dǎo)致FIB數(shù)量或結(jié)構(gòu)異常造成的。臨床癥狀呈現(xiàn)多樣性，包括無(wú)癥狀、出血、血栓形成，或出血表現(xiàn)和血栓形成同時(shí)存在。本研究發(fā)現(xiàn)了1例CFD，經(jīng)患者及其家屬之情同意后，對(duì)此患者及其家屬的表型和基因型進(jìn)行了家系研究，初步探討其發(fā)病機(jī)制，為該病的研究提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1家系資料 先證者，女，45歲，15年前剖宮產(chǎn)曾出現(xiàn)大出血，進(jìn)行輸血治療，此次因“宮腔腫物”需行宮腔鏡手術(shù)，術(shù)前查凝血功能，發(fā)現(xiàn)凝血功能異常。自述無(wú)自發(fā)性出血、鼻衄等癥狀，否認(rèn)高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等慢性疾病史。該家系共3代5人，遺傳家系圖譜見圖1。

圖1 先證者的家系圖

1.2試劑與儀器 日本希森美康XN-2000全自動(dòng)血液分析儀(血常規(guī)試劑為原廠配套試劑)，美國(guó)沃芬ACL TOP血凝分析儀(凝血相關(guān)項(xiàng)目試劑為原廠配套試劑)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特AU5800全自動(dòng)生化分析儀(肝功能檢測(cè)試劑為原廠配套試劑)，基因組DNA提取試劑盒(Qiagen，德國(guó))，Illumina Novaseq 6000 測(cè)序儀(Illumina，美國(guó))。

1.3方法

1.3.1血常規(guī)檢測(cè)及肝功能檢測(cè) 用希森美康XN-2000全自動(dòng)血液分析儀及其配套試劑對(duì)乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝靜脈血標(biāo)本進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，用貝克曼庫(kù)爾特AU5800全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑進(jìn)行肝功能檢測(cè)。

1.3.2血栓與止血實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 將枸櫞酸鈉抗凝血標(biāo)本進(jìn)行離心(3 000 r/min，10 min)，然后取上層血漿，用沃芬ACL TOP血凝分析儀及其配套試劑進(jìn)行凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、FIB(Clauss法)和D-二聚體(D-D)檢測(cè)。同時(shí)，將枸櫞酸鈉抗凝血標(biāo)本進(jìn)行血栓彈力圖檢測(cè)。

1.3.3基因檢測(cè) 使用DNA提取試劑盒提取先證者及其家屬的外周血白細(xì)胞基因組DNA，然后通過超聲破碎并純化以產(chǎn)生200～300 bp的DNA片段，末端標(biāo)記雙脫氧法在Illumina Novaseq 6000 測(cè)序儀上進(jìn)行正向和反向測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1血液系列檢查結(jié)果 先證者與家系成員血常規(guī)和肝功能檢測(cè)均未見異常，故排除因肝臟疾病等引起的FIB缺陷。先證者PT、TT均明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)IB水平顯著降低，其父親、母親和女兒TT均輕度延長(zhǎng)，F(xiàn)IB輕微降低，其他均在正常范圍(表1)。先證者血栓彈力圖檢測(cè)中FIB功能參數(shù)K值和Angel角結(jié)果正常，說明FIB活性正常。

表1 先證者及其家屬的凝血指標(biāo)、血常規(guī)和肝功能結(jié)果

2.2基因檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)FGA、FGB和FGG基因外顯子和毗鄰內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，先證者的FGA基因第5號(hào)外顯子的c.1390A存在堿基重復(fù)突變，且為純合變異，其父母和女兒則攜帶該位點(diǎn)雜合變異(圖2)。通過gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行查詢，未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變的數(shù)據(jù)，排除基因多態(tài)性可能。

注：A為先證者的FGA基因序列；B為先證者母親的FGA基因序列；箭頭表示c.1390Adup突變。圖2 測(cè)序峰圖

3 討 論

位于4號(hào)染色體上的FGA、FGB和FGG基因，分別編碼Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈3條肽鏈，然后形成Aα-Bβ-γ多肽鏈，兩條多肽鏈通過二硫鍵結(jié)合形成一個(gè)對(duì)稱型六聚體復(fù)合物，其外部包含兩個(gè)D結(jié)構(gòu)域和一個(gè)中央的E結(jié)構(gòu)域，即為FIB[3]。FIB由肝細(xì)胞分泌釋放進(jìn)入血液，主要通過兩種方式在外周血中發(fā)揮凝血和止血功能。首先，F(xiàn)IB與血小板表面的膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體結(jié)合，從而促進(jìn)血小板的活化與聚集[4]。其次，F(xiàn)IB還在凝血酶的作用下，裂解出纖維蛋白多肽，轉(zhuǎn)變成纖維蛋白單體，然后在凝血因子a和Ca2+的作用下，通過共價(jià)鍵形成穩(wěn)定的纖維蛋白多聚體，從而發(fā)揮止血功能[5]。由于編碼基因的突變導(dǎo)致FIB分子結(jié)構(gòu)和(或)功能異常，從而引起FIB釋放異常，F(xiàn)IB單體聚合異常，F(xiàn)IB單體交聯(lián)異常和纖維蛋白凝塊纖溶異常等，因此引發(fā)CFD。

本家系中，先證者APTT、D-D和血栓彈力圖檢測(cè)均正常，PT和TT明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)IB顯著降低，初步診斷為CFD，其父母及女兒的TT輕度延長(zhǎng)，F(xiàn)IB輕微降低。家系成員基因測(cè)序是診斷CFD的金標(biāo)準(zhǔn)，因此對(duì)先證者及其父母和女兒進(jìn)行了基因測(cè)序。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)先證者存在FGA基因第5號(hào)外顯子的c.1390Adup的純合突變，從而導(dǎo)致該基因編碼的第464位氨基酸發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致蘇氨酸(Thr)變?yōu)樘於彼?Asp)，在移碼突變3個(gè)氨基酸后，翻譯隨即中止。其父母和女兒則攜帶該位點(diǎn)雜合變異，其父母為非近親結(jié)婚，均符合孟德爾遺傳定律。由于本研究目的為確定是否為CFD，故未做FIB抗原檢測(cè)，未對(duì)先證者進(jìn)行CFD的進(jìn)一步分型。1958年發(fā)現(xiàn)第1例CFD患者和1968年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)突變位點(diǎn)，之后陸續(xù)有大量的研究報(bào)道了不同的致病突變位點(diǎn)，不僅涉及FGA、FGB和FGG3個(gè)基因的外顯子，還涉及其旁側(cè)的內(nèi)含子區(qū)域，通過影響轉(zhuǎn)錄、mRNA剪切、翻譯、肽鏈折疊和組裝等一系列過程導(dǎo)致FIB出現(xiàn)分子結(jié)構(gòu)和(或)功能異常，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生[6]。ASSELTA等[7]報(bào)道，一些突變雖然使轉(zhuǎn)錄提前終止，產(chǎn)生了嚴(yán)重截短的α鏈，從而逃脫了無(wú)義突變介導(dǎo)的mRNA降解，但是卻最終導(dǎo)致了FIB六聚體分子分泌障礙。ATTANASIO等[8]發(fā)現(xiàn)IVS3+1_+4delGTAA能夠?qū)е?號(hào)外顯子跳躍，最終破壞編碼框，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止。本研究先證者因一個(gè)堿基對(duì)的重復(fù)，產(chǎn)生移碼突變，從而導(dǎo)致框外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和終止密碼子提前，該變異可能會(huì)引起蛋白質(zhì)截?cái)嗷蛘呒せ顭o(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解，從而導(dǎo)致FGA基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物功能喪失。查閱文獻(xiàn)顯示，該突變類型為國(guó)際尚未報(bào)道的新突變，未在文獻(xiàn)中報(bào)道，但是有研究表明該變異的下游截?cái)嘧儺悶橹虏⌒宰儺怺9]。

研究發(fā)現(xiàn)約55%的CFD患者無(wú)任何臨床癥狀，約25%的CFD患者主要臨床表現(xiàn)為出血，包括臍帶出血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、肌肉血腫、關(guān)節(jié)出血、牙齦出血、鼻衄等，約20%的CFD患者有血栓傾向且主要為靜脈血栓[10]。本研究中的先證者自述無(wú)自發(fā)性出血、鼻衄等癥狀，曾因剖宮產(chǎn)引發(fā)大出血。其父母均無(wú)癥狀，女兒自12歲首次月經(jīng)開始至今存在月經(jīng)量大、經(jīng)期過長(zhǎng)的癥狀。由于該疾病較為少見，且因檢測(cè)手段有限，極易被漏診，誤診，而這類患者隨著病程進(jìn)展或經(jīng)歷外傷、手術(shù)分娩等，有嚴(yán)重出血或血栓形成甚至危及生命。因此臨床醫(yī)生應(yīng)通過臨床表現(xiàn)、凝血相關(guān)檢查及基因遺傳學(xué)檢查綜合診斷。

通過以上分析可以推斷，c.1390Adup的純合突變是導(dǎo)致先證者患CFD的原因，且其父母及女兒均為該位點(diǎn)的雜合突變，故表現(xiàn)為TT輕度延長(zhǎng)，F(xiàn)IB輕微降低。因此筆者認(rèn)為，通過凝血相關(guān)檢查結(jié)合基因測(cè)序能夠?qū)FD進(jìn)行確診。希望隨著分子遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，同時(shí)通過更多病例及其突變位點(diǎn)的報(bào)道和收集，更好地揭示基因型和表型的關(guān)系，對(duì)CFD的致病分子機(jī)制了解越來(lái)越深入。