血清lncRNA-GAS5及miR-451在重癥肺炎患兒中的表達(dá)水平及臨床意義*

李 娜,王維娟,曾靜霞

1.西北婦女兒童醫(yī)院兒科急診與PICU，陜西西安 710061;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇南京 210008

肺炎是兒童時期最為常見的呼吸道感染性疾病，是兒童死亡的重要原因。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，每年5歲以下發(fā)生肺炎的兒童約為5億，其中有將近10%會發(fā)展成為重癥肺炎[1-2]。在我國，每年患肺炎的兒童人數(shù)在2 000萬以上，占住院總患兒數(shù)量的30%。兒童重癥肺炎具有起病急、變化快、并發(fā)癥多等特點，如果搶救不及時或診治不當(dāng)會使病情惡化，甚至造成患兒死亡。因此，對重癥肺炎患兒的及時和正確的診療一直是兒科的重點關(guān)注方向。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度達(dá)200 nt的非編碼RNA，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，其在細(xì)胞生長、代謝及包括肺炎在內(nèi)的多種人類疾病中起重要作用。lncRNA生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(lncRNA-GAS5)最初是從NIH3T3細(xì)胞中分離出來的，該基因已被發(fā)現(xiàn)可編碼一種與淋巴瘤相關(guān)的染色體位點。已有研究證明，lncRNA-GAS5通過miR-455-5p/SOCS3途徑促進(jìn)肺炎患兒M1型巨噬細(xì)胞極化[3]。miR-451位于人類第11號染色體，是成熟紅細(xì)胞中表達(dá)量最高的miRNA，其表達(dá)量會隨紅細(xì)胞的分化而增加[4]。已有研究表明，miR-451缺乏會導(dǎo)致紅細(xì)胞發(fā)育障礙。另有證據(jù)顯示，miR-451在肺的炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，其異常表達(dá)可能成為診斷疾病的生物學(xué)標(biāo)志物[5]?；诖?，本研究擬探討lncRNA-GAS5與miR-451在重癥肺炎患兒中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年1月西北婦女兒童醫(yī)院收治的89例重癥肺炎患兒為研究組，其中男42例、女47例，平均年齡(4.13±1.34)歲。另選取同期在該院進(jìn)行體檢的健康兒童92例作為對照組，其中男43例、女49例，平均年齡(4.37±1.46)歲。兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合重癥肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)患兒臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有先天性心臟病、支氣管肺發(fā)育不良等先天疾病的患兒；(2)有家族性遺傳病的患兒；(3)既往有窒息病史的患兒；(4)合并有敗血癥等感染性疾病的患兒；(5)有意識障礙的患兒。本研究經(jīng)西北婦女兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 所有受試者均于清晨空腹采集靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心15 min，分離血清進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢查或置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.2.2血清lncRNA-GAS5及miR-451水平的檢測 通過Trizol 試劑(Invitrogen，日本)提取血清中的總RNA，并用分光光度計(Thermo Fisher Science，美國)測定RNA的濃度。根據(jù)制造商說明書，用PrimeScript RT Master Mix試劑盒(Takara，日本)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Takara SYBR Green PCR試劑盒(Takara，日本)進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。反應(yīng)體系(20.0 μL)：SYBR Green Master Mix 10.0 μL，cDNA模板(20 ng/μL)2.0 μL，上下游引物各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。本研究以U6為對照，采用2-ΔΔCt計算lncRNA-GAS5及miR-451的相對表達(dá)水平。試驗所用引物序列如表1所示。

表1 試驗所用引物序列

1.2.3血清載脂蛋白E(ApoE)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)及血清降鈣素原(PCT)水平的檢測 采用博科BK-400及其配套試劑(山東濟(jì)南博科集團(tuán)-博科生物有限公司)通過免疫比濁法檢測血清ApoE及CRP的水平；采用免疫分析儀及其配套試劑(法國生物梅里埃公司)通過化學(xué)發(fā)光法檢測血清PCT的水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組受試者血清lncRNA-GAS5及miR-451的表達(dá)水平 與對照組相比，研究組血清lncRNA-GAS5的表達(dá)水平明顯降低，miR-451的表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組受試者血清lncRNA-GAS5及miR-451的表達(dá)水平

2.2兩組受試者血清ApoE、CRP及PCT水平 與對照組相比，研究組血清ApoE、CRP及PCT的水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組受試者血清ApoE、CRP及PCT水平

2.3研究組患兒血清lncRNA-GAS5、miR-451與ApoE、CRP、PCT的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清lncRNA-GAS5表達(dá)水平與ApoE、CRP、PCT水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.493、-0.526、-0.477，P<0.05)；血清miR-451表達(dá)水平與ApoE、CRP、PCT水平呈正相關(guān)(r=0.547、0.446、0.454，P<0.05)。

2.4血清lncRNA-GAS5與miR-451對重癥肺炎的診斷價值 通過ROC曲線分析血清lncRNA-GAS5、miR-451及二者聯(lián)合診斷重癥肺炎的效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA-GAS5、miR-451及二者聯(lián)合檢測診斷重癥肺炎的曲線下面積(AUC)分別為0.869(95%CI：0.813～0.924)、0.966(95%CI：0.943～0.989)及0.979(95%CI：0.963～0.995)，聯(lián)合檢測的AUC大于單項檢測。見表4和圖1。

表4 血清lncRNA-GAS5及miR-451對重癥肺炎患兒的診斷價值

圖1 血清lncRNA-GAS5及miR-451診斷重癥肺炎的ROC曲線

3 討 論

肺炎雖然是一種在臨床上較為常見的疾病，但其卻具有潛在的危險性，若不能及時干預(yù)，有發(fā)展成重癥肺炎的風(fēng)險，嚴(yán)重時會引起全身炎癥反應(yīng)、多器官功能障礙、膿毒性休克，甚至威脅患者的生命安全。據(jù)統(tǒng)計，重癥肺炎患者病死率高于30%，若抗感染治療不及時，病死率將增加至60%[7]。因此，如何及時確診并降低該病的病死率，是目前研究的重點。

已有研究證明，lncRNA在生物體生長、發(fā)育過程中扮演重要角色，其可通過轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及表觀遺傳學(xué)水平對靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。近年來，lncRNA已成為多種疾病的重要診斷標(biāo)志物。在肺炎方面，已有多項研究證明lncRNA可能是其關(guān)鍵的調(diào)控因子。CUI等[8]發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1可通過吸附miR-146b調(diào)節(jié)嬰兒肺炎。CHEN等[9]則證明，lncRNA NNT-AS1、CRP和PCT在肺炎患者中均高表達(dá)，且lncRNA NNT-AS1與CRP、PCT的表達(dá)呈正相關(guān)，共同促進(jìn)肺炎的發(fā)生。lncRNA-GAS5已被證明在多發(fā)性骨髓瘤、宮頸癌等癌癥組織或血清中表達(dá)下調(diào)，并與患者預(yù)后相關(guān)[10-11]。WANG等[12]的研究證明，與健康人群相比，lncRNA-GAS5在肺炎患者血清中表達(dá)下調(diào)，其通過下調(diào)miR-155抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞凋亡。在本研究中，與健康兒童相比，重癥肺炎患兒血清中l(wèi)ncRNA-GAS5表達(dá)明顯降低，這與WANG等[12]的研究結(jié)果一致。另外，本研究通過相關(guān)性分析還發(fā)現(xiàn)lncRNA-GAS5與ApoE、CRP、PCT的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

miRNA作為長度約為22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，也在生物體中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。FEI等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，在肺炎患兒中，miR-3941表達(dá)下調(diào)，其可通過靶向IGF2調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路的激活，促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞損傷。孫旦等[14]研究顯示，miR-492在支原體肺炎患兒血清中的水平較健康兒童明顯升高，這說明其可能參與支原體肺炎的炎癥反應(yīng)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-451可參與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展[15-17]。有研究證明，miR-451 可能通過抑制Toll樣受體4(TLR4)/核因子-κB通路減緩哮喘氣道炎癥[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康兒童相比，重癥肺炎患兒血清中miR-451的表達(dá)明顯上調(diào)，且其與ApoE、PCT、CRP的表達(dá)呈正相關(guān)。

另外，本研究通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA-GAS5診斷重癥肺炎的靈敏度、特異度分別為84.3%、87.9%，AUC為0.869；miR-451診斷重癥肺炎的靈敏度、特異度分別為93.3%、91.2%，AUC為0.966。這一結(jié)果說明單項檢測時miR-451對于重癥肺炎的診斷效能高于lncRNA-GAS5。對lncRNA-GAS5和miR-451進(jìn)行聯(lián)合檢測，其靈敏度、特異度分別為86.1%、92.1%，AUC為0.979。這一結(jié)果說明二者聯(lián)合檢測診斷重癥肺炎時的診斷效能高于lncRNA-GAS5、miR-451單項檢測。

綜上所述，lncRNA-GAS5和miR-451均有可能成為重癥肺炎的早期診斷標(biāo)志物，且二者聯(lián)合檢測的診斷效能高于單項檢測。但本研究是單中心、小樣本量研究，結(jié)果具有一定的局限性，因此還需要更大樣本量的研究來驗證上述結(jié)果。