嗜黏蛋白阿克曼菌對(duì)腺嘌呤誘導(dǎo)慢性腎病大鼠作用的研究

高增輝 秦珍珍 栗鳳霞

慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)是威脅人類健康的全球性重要公共衛(wèi)生問題，在全球不同地區(qū)其發(fā)生率高達(dá)6%～10%，目前尚無根治方法，最終進(jìn)展至終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)[1]。近年來研究顯示，CKD患者本身腸道微生態(tài)失調(diào)及其腸道屏障功能受損，進(jìn)一步加重了慢性腎臟病的進(jìn)展[2]。

腸道微生態(tài)與人體的生理病理過程密切相關(guān)，具有營養(yǎng)腸上皮細(xì)胞、維護(hù)腸道屏障、免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。既往有研究表明，腸道微生態(tài)失調(diào)與人體消化、心血管、內(nèi)分泌及神經(jīng)等系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[4]。有研究者發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)失調(diào)會(huì)造成腸道屏障破壞及通透性增加，導(dǎo)致病原體或其毒性代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而加重疾病進(jìn)展[5,6]。而筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，CKD患者和健康對(duì)照者腸道微生態(tài)在多樣性和菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異，CKD患者中阿克曼菌的豐度較健康對(duì)照組顯著降低[7]。本研究旨在探討阿克曼菌對(duì)CKD大鼠腎功能的影響作用及其可能機(jī)制，為CKD的預(yù)防及治療提供新的思路。

材料與方法

1.一般材料：健康6周齡SPF級(jí)SD大鼠26只，平均體質(zhì)量約200g，購自山西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(晉)2019-0001。免疫印跡、免疫組化及病理染色等相關(guān)試劑購自賽文創(chuàng)新(北京)生物科技有限公司。ZO-1抗體(批號(hào)UH289284)及Claudin-1抗體(批號(hào)UB280983)購自美國賽默飛世爾科技公司公司，Occludin抗體(批號(hào)EPR20992)購自英國Abcam公司，β-actin抗體、羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗購自美國Immunoway Biotechnology公司(批號(hào)YM3028)。

2.A.muciniphila株的培養(yǎng)：A.muciniphila株培養(yǎng)物購自德國微生物菌種保藏中心。培養(yǎng)條件37℃，厭氧袋內(nèi)，在哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48～72h。

3.動(dòng)物分組及干預(yù)措施：26只SD大鼠隨機(jī)分為正常組8只、模型組8只、治療組10只，普通飼料喂養(yǎng)。正常組：予以灌胃0.9%氯化鈉溶液 1ml/d，4周；模型組：予以灌胃腺嘌呤200mg/(kg·d)，4周；實(shí)驗(yàn)組：同時(shí)予以灌胃腺嘌呤200mg/(kg·d)和阿克曼菌1.5×109菌落形成單位/天(CFU/d)，4周。實(shí)驗(yàn)期間觀察精神狀態(tài)、每周測(cè)量體質(zhì)量。4周后使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟穿刺采取大鼠血清，以下腹部正中切口入腹，切除左側(cè)腎組織稱重、同一節(jié)段結(jié)腸組織，-80℃凍存待檢。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)山西省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：2021省醫(yī)科倫審字第29號(hào))。

4.血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)指標(biāo)，根據(jù)說明書處理樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。

5.Masson染色和過碘酸希夫(PAS)染色檢查腎臟及結(jié)腸組織病理學(xué)：Masson染色：常規(guī)脫蠟水化，用Regaud蘇木精染色，麗春紅酸性復(fù)紅液10min，冰醋酸水溶液浸洗，鉬酸水溶液分化，不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染，以冰醋酸水溶液浸洗片刻，封片及鏡檢。以損傷的腎間質(zhì)膠原沉積面積與腎間質(zhì)總面積的比值表示，0分為無病變；1分為局灶性(≤總面積25%)，2分為多灶狀(25%～50%)，3分為大片狀(50%～75%)，4分為彌漫性(>75%)，隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行評(píng)分。PAS染色：石蠟組織切片常規(guī)脫蠟水化，過碘酸溶液中10min，希夫染液中18min，蘇木精染液10s，分化液5s，進(jìn)行脫水、透明、封片及鏡檢。

6. Western blot法檢測(cè)大鼠結(jié)腸ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達(dá)：取適量結(jié)腸組織加RIPA裂解液，快速低溫勻漿，BCA法檢測(cè)濃度，取50μg總蛋白，行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉液封閉，加入一抗(ZO-1稀釋比1∶250、Occludin稀釋比1∶1000、Claudin-1稀釋比1∶125)4℃孵育過夜。次日，加入二抗(羊抗兔吸稀釋比1∶10000、羊抗鼠稀釋比1∶10000)室溫孵育1.5h。超敏增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色影，用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析。結(jié)果以與β-肌動(dòng)蛋白(β-actin稀釋比1∶10000)的灰度比值表示。

7.免疫組化檢測(cè)結(jié)腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達(dá)：石蠟組織切片脫蠟水化，3%H2O210min。Tris/EDTA緩沖液，高壓修復(fù)。一抗(ZO-1稀釋比1∶62.5、Occludin稀釋比1∶200、Claudin-1稀釋比1∶100)孵育，4℃過夜。HRP標(biāo)記二抗(羊抗兔稀釋比1∶1000)。DAB顯色，蘇木精10s，常規(guī)透明，封片。德國萊卡光學(xué)顯微鏡下雙盲法觀察切片中表達(dá)棕黃色顆粒的陽性細(xì)胞數(shù)情況，隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野。根據(jù)文獻(xiàn)[7]染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：分別計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比(A)及陽性著色程度(B)。A：無陽性細(xì)胞記為0，陽性細(xì)胞比例0～1%記為1，陽性細(xì)胞比例2%～10%記為2，陽性細(xì)胞比例11%～30%記為3，陽性細(xì)胞比例31%～70%記為4，陽性細(xì)胞比例71%～100%記為5。B：陰性著色記為0，弱陽性染色記為1，中等強(qiáng)度染色記為2，強(qiáng)陽性染色記為3，總評(píng)分=陽性細(xì)胞比例評(píng)分+陽性染色強(qiáng)度評(píng)分。

結(jié) 果

1.大鼠Scr和BUN水平變化：模型組Scr、BUN水平明顯高于正常組(P<0.01)。與模型組比較，經(jīng)阿克曼菌干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組Scr、BUN下降(P<0.01，表1)。

表1 3組大鼠Scr和BUN的比較

2.大鼠腎組織病變情況：PAS及Masson染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組腎小管有不同程度的擴(kuò)張，腎小管基膜增厚、屈曲，上皮細(xì)胞體積縮小，腎間質(zhì)彌漫性纖維組織增生以及部分炎性細(xì)胞浸潤(P<0.01)；與模型組比較，經(jīng)阿克曼菌干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組腎臟組織腎小管擴(kuò)張減少，腎小管基膜變薄，腎間質(zhì)纖維化程度減輕(P<0.05，圖1)。

圖1 3組大鼠PAS及Masson染色結(jié)果(×400)*P<0.05，**P<0.01

3.Western blot法驗(yàn)證A.muciniphila對(duì)腸道屏障的保護(hù)功能：結(jié)腸緊密連接位于上皮細(xì)胞頂部，參與維持腸道屏障，其中ZO-1、Occludin、Claudin-1是反映細(xì)胞間緊密連接完整性的敏感指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組結(jié)腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表達(dá)增多(P<0.05，圖2及表2)。

表2 3組大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白表達(dá)

圖2 大鼠腸道緊密連接蛋白表達(dá)

4.大鼠結(jié)腸組織中ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達(dá)情況：免疫組化結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組結(jié)腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表達(dá)明顯減少(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組大鼠結(jié)腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表達(dá)增多(P<0.05，圖3)。

圖3 3組大鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白免疫組化染色及統(tǒng)計(jì)結(jié)果(×400)*P<0.05

5.A.muciniphila對(duì)大鼠結(jié)腸組織黏液層厚度及杯狀細(xì)胞的改善：與正常組比較，模型組結(jié)腸腺體萎縮、變形，黏液層厚度明顯減低，杯狀細(xì)胞密度降低(P<0.01)；與模型組比較，阿克曼菌干預(yù)的大鼠結(jié)腸組織黏液層厚度增加(P<0.05)，杯狀細(xì)胞密度升高(P<0.01，圖4)。

圖4 3組大鼠結(jié)腸組織PAS染色(×400)及統(tǒng)計(jì)圖A.3組大鼠結(jié)腸組織PAS染色結(jié)果；B.結(jié)腸組織黏液層厚度統(tǒng)計(jì)圖；C.結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞密度*P<0.05，**P<0.01

討 論

目前，慢性腎臟病已經(jīng)成為一項(xiàng)日益嚴(yán)重的全球性公共健康問題，我國慢性腎臟病患病率約為10%，且仍有逐年上升趨勢(shì)，已成為我國目前不容忽視的慢性疾病之一[8]。CKD患者由于飲食和腸腔環(huán)境有毒物質(zhì)、pH值、抗生素應(yīng)用、鐵吸收等的長期作用會(huì)出現(xiàn)腸道黏膜局部水腫糜爛，腸道微生態(tài)的多樣性紊亂，同時(shí)損傷腸道上皮細(xì)胞以及細(xì)胞之間的緊密連接，使腸道的滲透性增高，導(dǎo)致腸腔內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素滲透入血循環(huán)中，加重疾病的進(jìn)展[9,10]。

人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)由腸道及龐大的微生物群落組成，它包含有300～500個(gè)細(xì)菌物種，是人體微生態(tài)系統(tǒng)最重要的組成部分。已有研究證明，腸道微生物可通過維持腸道屏障完整性，調(diào)節(jié)腸道局部免疫力，逆轉(zhuǎn)腸道微生態(tài)失調(diào)，抑制病原體的繁殖等機(jī)制，發(fā)揮著保護(hù)機(jī)體的重要作用[10]。研究研究發(fā)現(xiàn)膳食纖維、木炭吸附劑AST-120可通過調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白表達(dá)改善腸道的通透性，進(jìn)而延緩慢性腎臟病的進(jìn)展[11,12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過果糖誘導(dǎo)的代謝綜合征可致菌群紊亂、腸道屏障破壞，進(jìn)而加重腎臟病的進(jìn)展[13]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus菌可通過調(diào)節(jié)腸道環(huán)境，促進(jìn)腸道緊密連接蛋白和TLR2的表達(dá)，降低腸道通透性，從而延緩CKD大鼠的腎損害[14]。

前期筆者通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)56例CKD患者和38例健康對(duì)照者的糞便進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)CKD患者的腸道微生態(tài)的多樣性和菌群結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化。與健康對(duì)照者比較，CKD患者中阿克曼菌的豐度較健康對(duì)照組顯著降低(3.08% vs 0.67%)[15]。阿克曼菌是從人糞便中分離出的嚴(yán)格厭氧的腸道益生菌，它可以編碼一種特別廣泛的黏蛋白降解酶，降解黏液中的黏蛋白，產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFA)，而短鏈脂肪酸具有減輕腸道炎癥、增強(qiáng)免疫以及抗腫瘤的作用[16,17]。

研究表明，阿克曼菌可以通過改變腸道微生態(tài)的多樣性和豐富度，逆轉(zhuǎn)腸道微生態(tài)，改善肝臟疾病的進(jìn)展[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)明顯低于正常組，而阿克曼菌使得CKD大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白中的胞內(nèi)蛋白ZO-1、跨膜蛋白Occludin、Claudin-1表達(dá)增加，提示阿克曼菌干預(yù)可改善結(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接完整性，改善腸道屏障功能。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在乙醇誘導(dǎo)的酒精性肝病大鼠中，予以阿克曼菌干預(yù)可減少肝功能損害及炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)，降低腸道滲透性，治療酒精引起的肝損害[19,20]。而本研究結(jié)果示，在阿克曼菌干預(yù)下，大鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞密度及黏液層厚度較模型組顯著增加，說明阿克曼菌可通過增加結(jié)腸上皮表面黏液生成，促進(jìn)腸道屏障功能的恢復(fù)，減少有毒物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，從而改善CKD大鼠的腎損害。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)阿克曼菌可改善慢性腎臟病大鼠的腎功能以及腎間質(zhì)纖維化，其作用機(jī)制可能與阿克曼菌改善腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性、增加腸道上皮細(xì)胞分泌黏液進(jìn)而保護(hù)腸道黏膜屏障功能有關(guān)。應(yīng)用阿克曼菌保護(hù)慢性腎臟病患者的腸道屏障功能，可以為通過調(diào)節(jié)腸道益生菌分布延緩慢性腎臟病進(jìn)展及改善預(yù)后等方面的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。