基于Wnt/β-catenin信號通路探討枸杞多糖對壓瘡大鼠創(chuàng)面愈合的影響

馬亮亮 張俊飛 田 芳 韓鳳玉

壓瘡(pressure ulcer，PU)是由于局部組織長期受壓，繼而發(fā)生持續(xù)性缺血、缺氧及營養(yǎng)不良，從而導致組織發(fā)生了潰爛和壞死的疾病[1]。歐美等國家研究指出PU已經是繼癌癥和心血管疾病之后醫(yī)療花費最高的疾病[2,3]。目前關于PU的治療主要包括藥物療法、手術、電刺激、封閉負壓引流療法和紅外線光療等方法[4,5]。比較手術等西醫(yī)治療方案，中醫(yī)藥外用膏劑、散劑、煎劑、艾灸、針灸和內服藥物等方法在治療PU方面也取得了很好的效果，并且患者治療費用和接受度更高[6]。

產自寧夏回族自治區(qū)的枸杞是我國傳統(tǒng)名貴中藥之一，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，從枸杞中提取的多種天然化合物具有多種藥理活性，其中枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBP)因具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤及免疫調節(jié)等多種藥理作用備受關注[7,8]。同時研究發(fā)現(xiàn)，LBP在治療皮膚損傷和潰瘍中都表現(xiàn)出良好的化學活性[9]。此外，LBP已經被證明可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路減輕高血糖加重腦的缺血再灌注損傷和增加骨髓間充質干細胞的活化治療骨質疏松[10,11]。但是LBP是否可以通過調控Wnt/β-catenin信號通路促進PU創(chuàng)面的愈合尚不清楚，因此，本研究擬通過構建PU大鼠模型，探討LBP是否通過Wnt/β-catenin信號通路促進創(chuàng)面愈合，從而為LBP臨床治療PU提供理論依據。

材料與方法

1.主要儀器與試劑：枸杞多糖(批號：MCA2016157)、水合氯醛(批號：P11259)、IL-6(批號：P1042)、IL-1β(批號：P1037)、TNF-α(批號：P1003)、SOD(批號：P1042)、MDA(批號：P 1040)和VEGF(批號：P1012)酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay， ELISA)試劑盒購自上海善然生物科技有限公司；Wnt1、β-catenin、GSK-3β和β-actin引物由上海英杰生物科技有限公司設計合成。RT-PCR試劑盒(批號：D7277S)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0009)、Wnt1(批號：AF8349)、β-catenin(批號：AC106)、GSK-3β(批號：AF1531)和GAPDH(批號：AF1186)購自上海碧云天生物技術有限公司。實時定量Agilent PCR 儀購自美國安捷倫科技公司。

2.實驗動物：SPF級雄性SD大鼠[許可證號：SCXK(寧)2015-0001]18只，6～8周齡。適應性飼養(yǎng)后嚴格按照動物實驗倫理相關規(guī)定開展實驗，本研究通過寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(倫理審批號：2020-096)。

3.動物模型制備：10%水合氯醛(0.3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將其背部皮膚剃毛至表面無毛發(fā)，備皮區(qū)域面積約為10cm×5cm。將其背部皮膚提起后對稱性扣上強力磁鐵，靠磁鐵的強大磁力作用對其進行壓力損傷，造成壓迫缺血，采用夾(缺血)12h再松(灌注)12h連續(xù)3個循環(huán)的造模方法對大鼠的皮膚造成損傷制備PU模型[4]。

4.分組和給藥：將大鼠隨機分為3組，每組6只大鼠，既對照組、模型組和LBP組。LBP組將LBP粉末溶于0.9%氯化鈉溶液配制成LBP溶液，按照100mg/(kg·d)連續(xù)灌胃干預2周。對照組和模型組采用同等體積0.9%氯化鈉溶液給予連續(xù)灌胃2周。實驗執(zhí)行期間所有實驗動物均正常飲水飲食。給藥后12h 10%水合氯醛(0.3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后進行組織取材。

5.創(chuàng)面愈合率的測定：參考高翔等[12]研究方法在治療后第1天、3天、7天和14天進行大鼠PU創(chuàng)面愈合率計算[愈合率(%)=(造模后PU面積-治療后PU面積)/造模后PU面積×100%]。通過ImageJ軟件進行輔助計算。

6.HE染色：實驗結束后對各組大鼠PU創(chuàng)面進行組織取材，組織進行4%多聚甲醛保存，按照組織病理學檢測要求對組織進行石蠟包埋處理后，按照HE染色試劑盒相關說明書對組織進行HE病理染色檢測，顯微鏡下觀察并拍照。

7.ELISA法檢測：大鼠麻醉后通過心尖采血，按照操作要求離心保存血清后參照腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的ELISA試劑盒說明書分別進行檢測。

8.反轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測：對各組大鼠PU創(chuàng)面組織進行取材后，參考于澤洋等[13]研究方法進行，主要包括提取組織中總RNA后按照相關操作試劑盒進行cDNA合成，最后采用熒光定量PCR試劑盒在反應條件下進行PCR檢測。相對表達水平采用2-ΔΔCt分析方法測定。各基因引物序列詳見表1。

表1 基因引物方向(5′→3′)

9.Western blot法檢測PU組織中相關蛋白表達情況：對各組大鼠PU創(chuàng)面組織蛋白進行提取后，參考于澤洋等[13]研究方法對Wnt1(抗體1∶1000)、β-catenin(抗體1∶1000)、GSK-3β(抗體1∶1000)和GAPDH(抗體1∶1000)蛋白表達情況進行檢測，收集蛋白帶后用凝膠成像分析系統(tǒng)分析相對光密度，用靶蛋白積分光密度(IOD)值/GAPDH(IOD)值顯示靶蛋白相對水平[13]。

結 果

1.LBP對PU大鼠創(chuàng)面愈合的影響： 大鼠PU模型制備成功后給予LBP治療，在第1天、3天、7天和14天時分別測量創(chuàng)面愈合情況，結果表明LBP組大鼠創(chuàng)面在3天、7天和14天時治愈率明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見圖1和圖2。

圖1 LBP治療后不同時間點大鼠PU創(chuàng)面治愈率*P<0.05

圖2 LBP治療后不同時間點大鼠PU創(chuàng)面情況

2.LBP對PU大鼠創(chuàng)面組織學改變：PU大鼠創(chuàng)面組織損傷嚴重，產生了大量的炎性細胞浸潤，成纖維細胞和毛細血管數(shù)目明顯減少，給予LBP治療后PU大鼠創(chuàng)面組織損傷得到了有效的修復，減輕了表皮炎性浸潤增加了毛細血管數(shù)量，詳見圖3。

圖3 各組大鼠皮膚HE染色病理結果(×400)A.空白組；B.模型組；C.LBP組

3.LBP對PU大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平的影響：PU大鼠血清中炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平明顯升高，給予LBP治療后可以有效降低血清中炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖4。

圖4 LBP對PU大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平的影響A.TNF-α;B.IL-6;C.IL-1β。*P<0.05

4.LBP對PU大鼠血清SOD、MDA和VEGF表達水平的影響：與模型組比較，LBP對PU大鼠治療后可以明顯提高血清SOD表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同時LBP可以降低PU大鼠血清MDA表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。LBP治療后與模型組比較，可以明顯提高PU大鼠血清中VEGF表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖5。

圖5 LBP對PU大鼠血清SOD、MDA和VEGF表達水平的影響A.SOD;B.MDA;C.VEGF。*P<0.05

5.LBP對PU大鼠組織中相關基因mRNA表達的影響：與模型組比較，LBP治療后PU大鼠創(chuàng)面組織中Wnt1 mRNA和β-catenin mRNA表達明顯升高，而GSK-3β mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖6。

圖6 LBP對PU大鼠組織中相關基因mRNA表達水平的影響A.Wnt1 mRNA;B.β-catenin mRNA;C.GSK-3β mRNA。*P<0.05

6.LBP對PU大鼠組織中相關蛋白表達的影響：Western blot法結果表明，與模型組比較，LBP治療后可以明顯提高PU大鼠創(chuàng)面組織中Wnt1和β-catenin蛋白表達水平，降低GSK-3β蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖7。

圖7 LBP對PU大鼠組織中相關蛋白表達水平的影響A.Western blot法檢測結果；B.Wnt1/GAPDH;C.β-catenin/GAPDH;D.GSK-3β/GAPDH。*P<0.05

討 論

PU又稱為壓力性潰瘍，目前對其定義中明確提出了“三力學說”，即壓力、剪切力和摩擦力，各因素可單獨或復合存在作用。雖然PU的具體發(fā)病機制依然不清，但是目前主要認為其與皮膚缺血損傷、缺血再灌注損傷、代謝障礙和細胞變形等機制相關[2,14]。其中缺血再灌注損傷在PU的發(fā)生機制中得到了越來越多的關注，筆者前期研究與其他人研究都采用了缺血再灌注損傷方法進行模型制備，病理結果顯示模型穩(wěn)定可靠，為后續(xù)研究提供了保障[4,12, 13]。對于PU創(chuàng)面治療中，損傷皮膚組織的治愈率是判斷藥物治療成功的主要指標之一[12,13]。

本研究表明，給予LBP治療后大鼠PU創(chuàng)面治愈率明顯高于模型組。同時組織病理檢測也表明，給予LBP治療后創(chuàng)面得到了有效修復，減輕了表皮炎性浸潤增加了毛細血管數(shù)量促進了創(chuàng)面的愈合。有研究表明，在PU形成過程中會產生大量炎性細胞因子，這些炎性細胞因子會破壞酶的活性降解細胞的基質和纖維連接蛋白，從而導致了創(chuàng)面的難愈合[15]。本研究表明，給予LBP治療后可以有效降低血清中炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達水平，通過降低機體炎性細胞因子水平從而促進了創(chuàng)面的愈合，研究與鄭焱江等[16]研究結果相一致。有研究認為VEGF表示增高可以誘導微血管通透性增強，導致血漿蛋白廣泛滲漏，直接或間接地改變細胞外主要成分，形成臨時的新基質來支持內皮細胞和成纖維細胞的遷移，從而促進傷口愈合[17]。本研究給予LBP治療后PU大鼠血清中VEGF表達水平明顯增加，組織病理也表明更多的毛細管生成促進了創(chuàng)面的愈合。此外，在PU損傷中也會導致MDA表達水平升高和SOD表達降低，引起氧化應激損傷加重了皮膚組織損傷[18]。筆者研究表明，LBP治療后可以有效提高血清中SOD表達水平，而降低MDA表達水平，表明LBP可以通過抑制氧化應激損傷達到治療PU的作用，結果與肖洪玲等[19]研究結果相近。

在創(chuàng)面愈合中涉及多種調控因素和細胞信號通路，其中Wnt信號通路與創(chuàng)面修復密切相關[20]。研究表明，在皮膚發(fā)育過程中，Wnt信號通路是出現(xiàn)最早，也是皮膚損傷修復中最重要的信號通路。在毛發(fā)生長調節(jié)中Wnt信號通路也是必不可少，它可以促進毛裹生長，其中Wnt1是激活調控Wnt信號通路的關鍵蛋白[21]。此外，β-catenin也是Wnt信號通路中的關鍵蛋白，它可以進入細胞核內，從而導致靶基因CDK4等的表達，改變細胞周期[22]。而在皮膚損傷時，周圍細胞釋放的Wnt信號啟動了β-catenin核轉位，使其與Lef1/TCF等DNA結合蛋白形成轉錄復合物，啟動Wnt靶基因轉錄和細胞的増殖分化過程，促進皮膚修復，而β-catenin蛋白表達降低會提高下游GSK-3β蛋白表達的增加使得皮膚自行修復能力下降，不利于創(chuàng)面的愈合[23]。

有研究表明，在PU的組織創(chuàng)面中，會出現(xiàn)β-catenin表達降低，而GSK-3β蛋白表達增加[24]。仇蓮胤等[25]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪提取液可以有效增加Wnt1和β-catenin表達，降低GSK-3β表達水平從而達到治療糖尿病大鼠皮膚潰瘍的作用。雷霆等[26]研究發(fā)現(xiàn)，三七/白芨膠海綿可以通過Wnt/β-catenin通路調控達到治療皮膚潰瘍的作用。此外，于澤洋等[13]研究也發(fā)現(xiàn)金雞毛草提取物可以通過Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠Ⅲ期壓瘡潰瘍的愈合。本研究發(fā)現(xiàn)，LBP治療后可以有效促進PU大鼠創(chuàng)面的愈合，通過增加Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵調控蛋白Wnt1和β-catenin的表達水平，同時降低GSK-3β的表達水平，表明LBP可能是通過調控Wnt/β-catenin信號通路達從而到治療PU大鼠創(chuàng)面的作用。