不同提取方法對檢測奶酪樣品二噁英的結果差異分析

◎孫 炎

（中檢科（北京）測試技術有限公司，北京 100176）

1 不同前處理方法測定粗脂肪及凈化檢測

1.1 實驗儀器與材料

將人使用攪碎機研磨成細末，并混合均勻，置于5 ℃條件冷藏保存。主要試劑：正己烷、二氯甲烷、丙酮、甲苯、乙酸乙酯、正壬烷、濃硫酸、無水硫酸鈉、細顆粒硅膠、硅藻土。所需試劑均需進行空白實驗，試劑濃縮至500 倍后不得檢出二噁英類物質。標準溶液均為加拿大威靈頓成品標準溶液EPA-1613ISS、EPA-1613LCS、PCB-LCS-A100、PCB-IS-B100、校 正溶液（CS1-5）。

前處理所需儀器主要包括分析天平（梅特勒有限公司ME204E）；快速溶劑萃?。绹惸wASE350）；二噁英凈化系統（美國FMS 公司）；冷凍干燥機（美國Virtis 公司adVantage Plus）；旋轉蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社NVC-2000）；氮吹濃縮儀（美國Organomation）。

1.2 實驗方法

測定脂肪時，當提取脂肪質量＞3 g 時，所計算的脂肪含量較為精確。新鮮奶酪的脂肪含量可以達到12%以上，而成熟奶酪通常含有20%～30%的脂肪[1]。在稱取奶酪樣品時，稱取15 g 左右樣品保證脂肪提取量。為比較水分對測定結果的影響，對樣品不進行任何處理即進行冷凍干燥，比較水分對檢測的影響。

1.2.1 加速溶劑萃取法

稱取適量奶酪樣品，轉入研缽中，進行冷凍干燥。調節(jié)冷凍干燥機隔板溫度20 ℃，冷阱溫度-80 ℃，真空度350 mbar，冷凍干燥24 h。取出觀察樣品，在完全脫水后進行后續(xù)操作。將冷凍干燥后的樣品加入適量硅藻土，并充分研磨混合，打開清洗過的快速溶劑萃取儀配套萃取池，將研磨好的樣品轉入萃取池中；稱取適量未經干燥的奶酪樣品，加入適量硅藻土中充分研磨，保證樣品與硅藻土混合成粉末不結塊，將混合物轉入萃取池中，向上述萃取池中加入PCDDs/Fs 提取內標EPA-1613-LCS，PCBs 提取內標PCB-LCS-A100 各5 μL，旋緊提取池蓋密封等待提取。

設置快速溶劑萃取儀，并設置萃取池溫度為150 ℃，保持壓力1 500 psi，釋放壓力1 700 psi，循環(huán)時間8 min，循環(huán)次數3 次，提取試劑是正己烷與二氯甲烷，其比例為1 ∶1。檢查氮氣壓力，啟動儀器進行預熱。將已經密封好的樣品池放入萃取池托盤中，將提取瓶放入與提取池所對應編號的提取池托盤中，啟動儀器進行萃取。

1.2.2 索氏提取法樣品制備

同樣稱取上述奶酪樣品。在冷凍干燥的樣品中加入適量無水硫酸鈉充分研磨；在未干燥的樣品中加入適量無水硫酸鈉研末至干燥可自由流動的粉末，將上述研磨好樣品小心轉入玻璃纖維套筒中，將盛有樣品的玻璃纖維套筒放入索氏提取器中，在玻璃纖維套筒中小心加入PCDDs/Fs 及PCBs 提取內標各5 μL，等待提取。將索氏提取器連接好，打開水冷先使提取器中的冷卻液降到適宜溫度。再使用提取試劑（正己烷∶二氯甲烷為1 ∶1）進行提取，在燒瓶中加入200 mL溶劑，設置電熱套溫度，保證每小時回流3～5 次，觀察虹吸是否正常，提取24 h，同時測定后續(xù)樣品。

1.3 脂肪測定

濃縮前準確稱取圓底燒瓶質量并記錄，將提取液轉入已稱重的圓底燒瓶中，使用旋轉蒸發(fā)儀進行樣品濃縮，將提取液中的試劑蒸干后稱量圓底燒瓶質量并記錄，將圓底燒瓶放在通風處晾干，直至質量不再變化，再計算脂肪含量。

脂肪測定公式：

式中：X為脂肪含量，%；m1為試樣的脂肪量，g；m2為試樣的質量，g，計算結果表示到小數點后兩位。

1.4 樣品的凈化分離

在測定脂肪后的樣品中加入150 mL 正己烷，使用超聲波振蕩將油脂完全溶解，分次加入33%的酸化硅膠振蕩，硅膠以上的溶液為澄清液。通過無水硫酸鈉去除上層清液溶劑中的水分，所分離濾液通過旋轉蒸發(fā)儀濃縮至1～2 mL。

使用全自動樣品凈化系統對濃縮后的樣品進行凈化分離，使用電腦自動控制有機溶液的用量、流速以及流動方向，并收集PCDDs/Fs 及PCBs 組分洗脫液。

使用旋轉蒸發(fā)儀將洗脫液蒸至近干，然后將濃縮液轉移至進樣瓶中，重復潤洗2次。用氮吹儀進行濃縮，并反復用正己烷沖洗樣品瓶內壁，將洗液一并轉移至進樣瓶中，直至將液體濃縮 至10 μL 左右。

向PCDDs/Fs 組分小瓶中加入5 μL 進樣內標EPA-1613ISS，渦旋混勻后進行分析。因活性炭柱可將PCDDs/Fs 與非鄰位取代的PCBs 組分同時吸附，所以待PCDDs/Fs 組分分析完成后，將PCBs 組分按照上述方法濃縮至PCDDs/Fs 組分小瓶中。加入5 μL 進樣內標PCB-IS-B1OO 渦旋混勻后再進行分析。

1.5 氣相色譜分析條件及結果計算

進樣方式：不分流進樣1 μL；進樣口溫度：270 ℃；載氣流量：1.0 mL/min；傳輸線溫度：290 ℃；色譜柱：固定相5%苯基，95%聚甲基硅氧烷，柱長60 m，內徑0.25 mm，膜厚0.25 μm。PCDDs/Fs 升溫程序：初始溫度140 ℃，保持1 min；以20 ℃/min 升溫至200 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 升溫至220 ℃，保持16 min；以5 ℃/min 升溫至230 ℃，保持7 min；以 5 ℃/min 升溫至330 ℃，保持10 min。PCBs 升溫程序：初始溫度100 ℃，保持3 min；以30 ℃/min 升溫至210 ℃，保持1 min；以2 ℃/min 升溫至270 ℃后，以30 ℃/min 升溫至330 ℃，保持3 min。

高分辨質譜分析條件：電子轟擊離子源，電子加速電壓可在25～70 V 調節(jié)；具有選擇離子檢測功能，并使用鎖定質量模式進行質量校正；動態(tài)分辨率＞1 萬并至少可穩(wěn)定24 h 以上。當使用的內標包含13C-OCDF 時，動態(tài)分辨率應＞1.2 萬。高分辨狀態(tài)下能夠在1 s 內重復監(jiān)測12 個選擇離子[2]。結果計算：使用同位素內標稀釋法定量測定試樣中各目標化合物含量；采用內標法計算同位素內標化合物的回收率[3]。

2 結果與分析

2.1 脂肪測定比較

在奶和奶制品中，二噁英的限量標準以脂肪含量表示，使用同批樣品測定6 次，計算平均脂肪含量，同時使用GB5413.3-2010 中第一法哥特里-羅紫法測定脂肪含量。干樣索氏提取法19.87%，干樣加速萃取法23.94%，干樣哥特里-羅紫法24.91%，鮮樣索氏提取法18.02%，鮮樣加速萃取法23.33%，鮮樣哥特里-羅紫法25.04%。

哥特里-羅紫法是利用氨溶液使乳中酪蛋白的鈣鹽成為可溶性鈣鹽，使結合的脂肪游離[4]，測定結果較準確。使用加速萃取法測定脂肪含量最接近哥特里-羅紫法差，測定值距較小，在使用干燥后樣品進行提取時測定脂肪含量，更接近哥特里-羅紫法測定值，數據也更加穩(wěn)定。

2.2 檢測PCDDs/Fs 與PCBs 的結果比較

使用干燥后的樣品進行提取，加速溶劑萃取法的全重計算結果略高于索氏提取法的全重計算結果。因使用快速溶劑萃取儀進行提取時需要加溫至150 ℃，加壓至1 700 psi，可以改變奶酪中的酪氨酸鈣鹽的性質，可以使溶劑將樣品中的PCDDs/Fsy 充分提取出來。索氏提取是直接利用溶劑不斷沖洗樣品，將樣品中的脂肪及PCDDs/Fs 等物質洗脫下來，樣品不易被完全提取。

計算加速溶劑萃取法與索氏提取法檢測奶酪中PCBs 的TEQ 值，是用12 種具有二噁英毒性的化合物，以TEQ-WHO1998 進行折算。用以上幾種前處理方法所檢測的PCBs 結果，與檢測PCDDs/Fs 的結果相似。使用索氏提取法的樣品結果均低于加速溶劑萃取法的結果，見表1。

表1 不同方法測定奶酪樣品PCDDs/Fs 及PCBs 的結果表（WHO1998-TEQ pg/g）

2.3 脂肪折算結果分析

根據結果分析顯示，以鮮重計二噁英類化合物的值低于冷凍干燥后樣品值，說明在奶酪樣品檢測二噁英類化合物的過程中，樣品的含水率影響最終的檢測結果。

使用索氏提取法比使用快速溶劑萃取法檢測二噁英類化合物的值偏低，是因為考慮到索氏提取法是依靠溶劑不斷沖洗樣品，將樣品中的二噁英類物質洗脫出，在實際操作中亦受到樣品裝填密度、回流次數的變化等影響，沒有快速溶劑萃取儀萃取的加壓加溫的條件使樣品提取不完全[5]，脂肪折算數據見表2。

表2 不同方法測定奶酪樣品使用脂肪含量折算PCDDs/Fs 的結果表（WHO1998-TEQ pg/g）

3 結論與展望

在不同的前處理方法中，奶酪樣品進行冷凍干燥后，再使用加速溶劑萃取法進行提取，在后續(xù)進行樣品的凈化與分離時都比較順利，不會出現脂肪提取不完全、計算數值偏小的情況，在凈化過程中，提取物的狀態(tài)也利于樣品的凈化。使用其他方法時，會出現樣品在提取液中析出、凈化出現問題、脂肪測定不準確的問題。根據本實驗得出的數據，在檢測奶酪樣品的二噁英類化合物時，推薦先將樣品凍干后再使用快速溶劑萃取法進行提取，有利于后續(xù)步驟的進行，可以較為準確地測定樣品中二噁英類化合物的濃度。