基于RANKL/RANK/OPG信號通路探討土貝母苷甲對糖尿病性骨質(zhì)疏松大鼠骨質(zhì)流失的影響

楊曉凈 鄧向群 肖婷 楊梅

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是較常見的代謝性骨疾病，以骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨量降低為特征，可增加骨脆性與骨折風險，影響患者健康并增加經(jīng)濟負擔[1]。繼發(fā)性O(shè)P常由代謝類疾病引起，糖尿病是導致OP的主要原因之一，隨著糖尿病進展，胰島素抵抗與內(nèi)環(huán)境紊亂均可引起骨代謝異常，增加OP風險[2]。糖尿病性O(shè)P治療包括生活方式干預、控糖，但收效甚微，因此急需發(fā)現(xiàn)安全有效的糖尿病性O(shè)P治療藥物。土貝母苷甲是五環(huán)三萜皂苷家族的成員，從中草藥土貝母中提取，傳統(tǒng)用于治療蛇毒與炎癥；且土貝母苷甲具有廣泛的抗癌特性[3]。此外，研究顯示土貝母苷甲可抑制NF-κB保護小鼠急性肺損傷[4]。而NF-κB通路對于破骨細胞的形成和分化是必不可少，NF-κB是RANKL誘導破骨細胞分化的重要下游信號[5]，然而土貝母苷甲對OP的直接影響筆者發(fā)現(xiàn)尚未被研究。因此，本研究筆者所見通過破骨細胞分化的常用通路RANKL/RANK/OPG探討土貝母苷甲對糖尿病性O(shè)P的影響，為糖尿病性O(shè)P的臨床治療提供理論參考。報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 2個月齡Wistar大鼠60只(雄性)，許可證號：SCXK(湘)2019-0015，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司。自然晝夜節(jié)律光照(12 h，12 h)，自由飲食飲水，環(huán)境濕度為40%～70%。

1.2 試劑 土貝母苷甲(S27647，純度≥95%，溶于二甲基亞砜中)；OPG(SRP3132)購自默克生命科學官網(wǎng)；SuperScriptTMIV第一鏈合成系統(tǒng)(18091050)、EXPRESS One Step SuperscriptTMqRT-PCR試劑盒(11781200)購自賽默飛世爾科技公司；兔抗RANK、RANKL、OPG、GAPDH一抗(GTX133795、GTX108515、GTX127948、GTX627408)購自GeneTex，山羊抗兔二抗(ab6702)購自美國Abcam公司；大鼠核心結(jié)合因子α1(CBF-α1)(GT04504B)ELISA檢測試劑盒購自上海晶風生物科技有限公司；Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)(ml038224)、骨鈣素(OC)(ml002883)ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)(HR0561)購自北京百奧萊博科技有限公司；HE染色試劑(G1120)、BCA試劑盒(PC0020)均購自北京索萊寶。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備：Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)2周后，隨機抽取10只作為對照組，其他大鼠均構(gòu)建糖尿病性O(shè)P模型[6]，即大鼠以高糖高脂飲食喂養(yǎng)(常規(guī)飼料+20%蔗糖+15%熟豬油、2.5%膽固醇)，禁食12 h后，腹腔注射鏈脲佐菌素(0.2%，25 mg/kg，以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為稀釋液)，連續(xù)注射5 d。造模后第7天清晨尾靜脈取血測定血糖，血糖值>16.7 mmol/L為糖尿病大鼠造模成功。對照組常規(guī)飲食，以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液代替。5周后通過全自動雙能X線骨密度測量儀檢測所有Wistar大鼠骨密度(BMD)，模型組以BMD<對照組平均BMD 2.5個標準差為糖尿病性O(shè)P大鼠造模成功。

1.3.2 分組：將符合條件的模型大鼠隨機分為模型組、土貝母苷甲低劑量組、土貝母苷甲高劑量組、OPG組、土貝母苷甲高劑量+OPG組，每組10只。土貝母苷甲低劑量組、土貝母苷甲高劑量組分別每日腹腔注射1 μmol/L、5 μmol/L土貝母苷甲[7]；OPG組尾靜脈注射3 mg/kg的OPG[8]；土貝母苷甲高劑量+OPG組腹腔注射5 μm土貝母苷甲，尾靜脈注射3 mg/kg的OPG；模型組以二甲基亞砜代替。

1.3.3 ELISA法檢測大鼠骨代謝指標(血清CBF-α1、PINP、OC)水平：末次給藥后，戊巴比妥鈉對大鼠實施麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，分離得血清，ELISA法測定大鼠血清CBF-α1、PINP、OC水平，均嚴格參照ELISA試劑盒操作說明書。

1.3.4 Micro-CT測定骨密度及骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)：隨機抽取5只大鼠，分離大鼠右側(cè)股骨，將股骨標本固定，使用Micro-CT對股骨遠端干骺端進行掃描，掃描完成后，對測量區(qū)域進行重組獲得3D圖像，利用ABA2.0對數(shù)據(jù)進行定量分析，得到BMD、骨體積分數(shù)(BV/TV，感興趣區(qū)內(nèi)骨組織體積除以總體積)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)，均由同一組熟練研究人員完成。

1.3.5 三點彎曲試驗檢測大鼠股骨機械強度：將大鼠中段股骨放置到OTS-15型分析儀上，對其進行三點彎曲試驗，記錄載荷-變形曲線，并計算最大載荷和斷裂撓度。

1.3.6 TRAP染色：剝離1.3.4中大鼠左側(cè)股骨，按照TRAP染色試劑盒說明制備染色溶液。將石蠟包埋的切片進行脫蠟并水化，將其浸泡在37℃的預熱的染料液浸染1 h，用蒸餾水洗滌，再次染色1 min。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片。細胞核被染成藍色，TRAP的陽性表達表現(xiàn)為在細胞質(zhì)中出現(xiàn)亮紅色或深紅色顆粒。具有≥3個核的TRAP陽性多核細胞被認為是破骨細胞，觀察并計算大鼠破骨細胞數(shù)量(N.Oc/BS)。

1.3.7 HE染色觀測大鼠骨組織病理學：分離剩余5只大鼠左側(cè)股骨，經(jīng)甲醛(10%)固定后，脫鈣、常規(guī)脫水、透蠟、包埋、切片，行HE染色，于光學顯微鏡下觀察。

1.3.8 qRT-PCR法檢測大鼠骨組織RANKL、RANK、OPG mRNA水平：取適量1.3.7中各組剩余5只大鼠右側(cè)股骨組織，利用Trizol抽提試劑盒抽提組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進行擴增。反應條件：95℃預熱3 min，95℃ 變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共35次循環(huán)，72℃ 5 min終止反應。RANKL/RANK/OPG以GAPDH為內(nèi)參基因[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]。通過2-ΔΔCt法計算RANKL、RANK、OPG mRNA相對表達量。見表1。

表1 引物序列

1.3.9 Western Blot法檢測骨組織RANKL/RANK/OPG通路蛋白表達：取1.3.8中剩余右側(cè)股骨組織，勻漿后蛋白裂解液裂解，離心后取上清，BCA法檢測蛋白含量，按一定比例(4∶1)加入樣品緩沖液，95℃煮沸5 min，離心后取上清進行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)、封閉2 h。加入RANKL、RANK、OPG、GAPDH(內(nèi)參)一抗(稀釋比分別為1∶1 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶5 000)，4℃孵育過夜，洗膜加入二抗37℃孵育2 h，洗膜。ECL顯影，測定各蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠血清骨代謝標志物的表達情況比較 與對照組相比，模型組大鼠血清CBF-α1、PINP、OC水平降低(P<0.05)；與模型組相比，土貝母苷甲低劑量組CBF-α1、PINP水平升高，土貝母苷甲高劑量組、OPG組血清CBF-α1、PINP、OC水平升高(P<0.05)；與土貝母苷甲高劑量組相比，土貝母苷甲高劑量+OPG組血清CBF-α1、PINP、OC水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 6組大鼠血清骨代謝標志物的含量比較

2.2 6組大鼠股骨機械強度比較 與對照組相比，模型組大鼠股骨最大負荷、斷裂撓度降低(P<0.05)；與模型組相比，土貝母苷甲高劑量組、OPG組大鼠股骨最大負荷升高(P<0.05)；與土貝母苷甲高劑量組相比，土貝母苷甲高劑量+OPG組大鼠股骨最大負荷升高(P<0.05)。見表3。

表3 6組大鼠股骨最大負荷和斷裂撓度比較

2.3 6組大鼠骨密度及骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較 與對照組相比，模型組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低，Tb.Sp升高(P<0.05)；與模型組相比，土貝母苷甲低劑量組、土貝母苷甲高劑量組、OPG組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，Tb.Sp降低(P<0.05)；與土貝母苷甲高劑量組相比，土貝母苷甲高劑量+OPG組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，Tb.Sp降低(P<0.05)。見表4。

表4 6組大鼠骨密度及骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

2.4 6組大鼠骨組織形態(tài)的變化 對照組大鼠可見完整骨小梁形態(tài)，結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊且網(wǎng)狀；模型組大鼠骨小梁數(shù)量明顯減少且出現(xiàn)斷裂，排列疏松，孔隙變大；土貝母苷甲低、高劑量組、OPG組可見新生骨小梁，數(shù)量有所增多，形態(tài)相對完整；土貝母苷甲高劑量+OPG組骨小梁形態(tài)進一步恢復。見圖1。

對照組 模型組 土貝母苷甲低劑量組

2.5 6組大鼠骨組織RANKL/RANK/OPG通路相關(guān)蛋白的表達比較 與對照組相比，模型組大鼠骨組織OPG mRNA與蛋白表達降低，RANKL、RANKmRNA與蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組相比，土貝母苷甲低劑量組、土貝母苷甲高劑量組、OPG組大鼠骨組織OPG mRNA與蛋白表達升高，RANKL、RANK mRNA與蛋白表達降低(P<0.05)；與土貝母苷甲高劑量組相比，土貝母苷甲高劑量+OPG組大鼠骨組織OPG mRNA與蛋白表達升高，RANKL、RANK mRNA與蛋白表達降低(P<0.05)。見圖2，表5。

表5 6組大鼠骨組織RANKL/RANK/OPG通路相關(guān)蛋白的表達

圖2 6組大鼠骨組織RANKL/RANK/OPG通路相關(guān)蛋白的表達;A 對照組；B 模型組；C 土貝母苷甲低劑量組；D 土貝母苷甲高劑量組；E OPG組；F 土貝母苷甲高劑量+OPG組

2.6 6組大鼠骨表面破骨細胞數(shù)量 與對照組相比，模型組大鼠破骨細胞/骨表面的平均數(shù)量(N.Oc/BS)增多(P<0.05)；與模型組相比，土貝母苷甲高劑量組、OPG組大鼠N.Oc/BS降低(P<0.05)；與土貝母苷甲高劑量組相比，土貝母苷甲高劑量+OPG組大鼠N.Oc/BS降低(P<0.05)。見圖3，表6。

對照組 模型組 土貝母苷甲低劑量組

表6 6組大鼠骨表面的破骨細胞數(shù)量比較

3 討論

骨骼內(nèi)穩(wěn)態(tài)是基于成骨細胞與破骨細胞的微妙平衡介導的，成骨/破骨細胞的失衡會破壞骨微結(jié)構(gòu)，造成OP。OP是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，可能是由胰島素抵抗造成的內(nèi)分泌失調(diào)導致，增加患者脆性骨折風險，這通常帶來發(fā)病率與危及生命的死亡率升高，并帶來沉重的經(jīng)濟負擔。對糖尿病性O(shè)P的治療方法以及發(fā)病機制進行研究有其臨床意義。

本研究通過高脂高糖飲食+腹腔注射鏈脲佐菌素復制糖尿病性O(shè)P模型，發(fā)現(xiàn)血糖值>16.7 mmol/L，BMD<對照組平均BMD 2.5個標準差，提示造模大鼠符合本研究試驗條件。

近年來，中藥在藥物開發(fā)方面做出了突出貢獻。諸多研究證實中藥復方或中藥提取物靶向破骨細胞是治療OP的重要方法，如當歸補血湯[9]、葛根芩連湯[10]、絞股藍總皂苷[11]等。土貝母苷甲是從中藥土貝母中提取的活性物質(zhì)，被證明有抗腫瘤特性，如土貝母苷甲可通過誘導活性氧介導的自噬溶酶體累積受損增加結(jié)直腸癌細胞對化療敏感[12]。土貝母苷甲對破骨細胞有一定保護作用，Wang等[4]研究顯示，土貝母苷甲可通過抑制破骨細胞分化對去卵巢模型小鼠的OP有保護作用。何峰等[13]研究顯示，滌痰散結(jié)藥物在類風濕關(guān)節(jié)炎中有應用，土貝母是其中發(fā)揮藥效的藥物之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠BMD明顯降低、骨小梁微結(jié)構(gòu)受損嚴重。土貝母苷甲低高劑量組大鼠BMD升高，骨小梁微小結(jié)構(gòu)部分恢復，血清CBF-α1、PINP、OC含量升高，三點彎曲結(jié)果顯示OP大鼠的最大負荷和斷裂撓度顯著升高。CBF-α1、PINP、OC是骨代謝中的關(guān)鍵標志物，CBF-α1是成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，血清PINP含量可反應1型膠原合成速率與骨轉(zhuǎn)換情況；血清OC與骨組織OC正相關(guān)[14]。Micro-CT能夠很好的評價骨小梁微結(jié)構(gòu)，TRAP染色可評估破骨細胞數(shù)目，本研究發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲處理后大鼠骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)BV/TV、Tb.N、Tb.Th明顯增加，Tb.Sp和N.Oc/BS明顯降低，提示土貝母苷甲可能通過抑制破骨細胞的生成，有效改善OP大鼠的骨代謝失衡和骨微結(jié)構(gòu)。

RANKL/RANK/OPG通路在破骨細胞的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，RANKL/RANK相結(jié)合可促進破骨細胞的活化以實現(xiàn)體內(nèi)平衡與宿主防御，OPG可與RANK競爭RANKL，進而抑制破骨細胞生成[15,16]。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)RANKL刺激后，激活ERK、p38和JNK、MAPK磷酸化促進破骨細胞成熟，抑制此通路可有效抑制破骨細胞成熟和骨吸收。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型大鼠骨組織RANKL、RANK mRNA水平與蛋白水平均升高，OPG mRNA水平與蛋白水平均降低，土貝母苷甲處理大鼠骨組織RANKL、RANK mRNA水平與蛋白水平較模型組降低，而OPG mRNA水平與蛋白水平較模型組升高，外源性O(shè)PG與土貝母苷甲處理發(fā)揮相同作用。在土貝母苷甲高劑量組基礎(chǔ)上添加OPG，大鼠骨組織RANKL、RANK mRNA水平與蛋白水平進一步升高，OPG mRNA水平與蛋白水平進一步降低，提示土貝母苷甲可能通過抑制RANKL/RANK/OPG通路發(fā)揮預防糖尿病性O(shè)P大鼠骨質(zhì)流失作用。

綜上所述，土貝母苷甲可能通過抑制RANKL/RANK/OPG通路，減少糖尿病性O(shè)P大鼠破骨細胞形成，抑制骨流失，緩解OP。