食管癌手術(shù)與非手術(shù)切除患者腸道菌群組成及差異

王文浩，萬里新，尚付梅，陶海云

(1.河南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475000；2.南陽市中心醫(yī)院，河南 南陽 473000；3.廣西科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 柳州 545000)

食管癌是原發(fā)于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，主要為鱗癌和腺癌，鱗癌多發(fā)于亞洲東部，腺癌多發(fā)于歐美國家[1]，食管癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，《2020年全球癌癥中心報(bào)告》顯示，2020年全球食管癌發(fā)病人數(shù)60.4萬例，發(fā)病率居全球惡性腫瘤第8位，死亡人數(shù)54.4萬，死亡率居全球惡性腫瘤第6位[2]；食管癌的發(fā)生發(fā)展是多因素作用的結(jié)果，隨著宏基因組和二代測序技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)腸道微生物與消化道腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[3-4]。腸道微生物在人體內(nèi)保持著一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)此動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)有益菌的減少和有害菌的增加，從而導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生；腸道菌群紊亂與炎癥性腸病、腸易激綜合征、糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展有著一定的關(guān)系[5-6]。研究表明，食管癌的發(fā)生發(fā)展與食管黏膜微生物的變化密切相關(guān)，Gao等[7]發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌在食管癌中有致病作用，但食管癌的發(fā)生與腸道微生物的改變是否有關(guān)，目前尚不明確；通過手術(shù)方式切除食管腫瘤后，對腸道菌群的變化產(chǎn)生何種影響，目前仍未可知，需要進(jìn)一步去探索。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2021年11月至2022年3月南陽市中心醫(yī)院收治的食管癌患者，其中手術(shù)切除患者21例，非手術(shù)切除患者20例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為食管癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)2周內(nèi)應(yīng)用過抗生素或益生菌；(2)目前患有腹瀉或腸梗阻等其他消化道疾??；(3)合并其他部位惡性腫瘤病史；(4)手術(shù)患者接受過除手術(shù)外的其他抗腫瘤治療(放療、化療、免疫及靶向治療等)；(5)非手術(shù)患者既往接受過抗腫瘤治療。從醫(yī)療記錄中收集其臨床數(shù)據(jù)，包括姓名、性別、年齡、吸煙飲酒史、家族史、腫瘤生長部位、病理類型、分化程度、臨床分期等。所有研究對象在參加本研究之前均簽署了書面知情同意書，且該研究已通過南陽市中心醫(yī)院臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本收集及檢測分析方法

1.2.1糞便標(biāo)本收集 收集患者治療前的糞便標(biāo)本，囑其排便前先排空小便，將大便排入準(zhǔn)備好的器皿內(nèi)，并囑其盡量勿將尿液排入器皿，避免糞便標(biāo)本受到污染，用一次性無菌牙簽或糞便取樣器挑取約2 g中段內(nèi)部大便放入到寫有編號凍存管中，置入液氮中保存。

1.2.2糞便細(xì)菌DNA提取及測序 運(yùn)用Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取糞便標(biāo)本中細(xì)菌DNA，利用Illumina測序方法對細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，運(yùn)用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit試劑盒構(gòu)建高通量測序文庫。

1.2.3序列去噪及功能基因矯正 運(yùn)用QIIME2(2019.4)軟件調(diào)用切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列，通過DADA2[8]進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體后得到ASVs。完成對所有文庫的去噪后，合并ASVs特征序列和ASV表格，并去除singletons ASVs。使用R語言對全部樣本中所包含的高質(zhì)量序列的長度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并對核酸序列中的插入和缺失錯(cuò)誤進(jìn)行糾正。

1.2.4物種分類學(xué)注釋及ASV表抽平 通過QIIME2中的classify-sklearn[9]算法對每個(gè)ASVs的特征序列進(jìn)行物種分類學(xué)注釋，再使用qiime feature-table rarefy功能在每個(gè)樣本中分別隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列以到達(dá)統(tǒng)一的深度，并預(yù)測各樣本在該測序深度下，所能觀測到的ASVs及其相對豐度[10]，抽平深度設(shè)為最低樣本序列量的95%。

1.2.5微生物多樣性及分類分析 微生物Alpha多樣性分析是使用未抽平的ASV表，通過運(yùn)用QIIME2、R語言計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，包括Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Faith’s PD指數(shù)、Pielou指數(shù)、Good’s coverage指數(shù)，來評估組內(nèi)微生物的均勻度和豐富度；Beta多樣性是通過R腳本對bray-curtis距離矩陣進(jìn)行NMDS分析，以三維排序圖展示微生物群落的組間差異。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)組與非手術(shù)組食管癌患者的臨床特征本研究共納入41例食管癌患者，男32例，女9例；年齡為53～85歲，平均(66.59±8.31)歲；病理類型中鱗癌患者有36例，腺癌患者有5例；手術(shù)患者21例，非手術(shù)患者20例，手術(shù)組與非手術(shù)組患者間的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、病理類型及臨床分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 手術(shù)與非手術(shù)患者基本臨床特征

2.2 食管癌患者糞便標(biāo)本測序結(jié)果本研究中，共41份糞便標(biāo)本進(jìn)行16S rRNA高通量測序，共得到4 630 070條有效序列，去噪后得到4 047 187條序列，聚類去嵌合體及功能基因矯正后共得到2 687 172條高質(zhì)量序列，每條序列平均長度為416.5 bp，平均每個(gè)樣品有886個(gè)ASV，分類注釋后共得到29門、70綱、126目、228科、497屬、698種。

2.3 手術(shù)組與非手術(shù)組食管癌患者菌群Alpha多樣性分析本研究采用QIIME2(2019.4)軟件對數(shù)據(jù)加以分析，使用R腳本對數(shù)據(jù)處理并繪制成箱線圖，以此來直觀地展示不同樣分組間的Alpha多樣性及差異，研究結(jié)果顯示，兩組間Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Faith’s PD指數(shù)、Pielou指數(shù)、Good’s coverage指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。手術(shù)組與非手術(shù)組食管癌患者之間的Alpha多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

S_TX為手術(shù)患者；NS_TX為非手術(shù)患者。圖1 Alpha多樣性指數(shù)

2.4 手術(shù)組與非手術(shù)組食管癌患者菌群組成結(jié)構(gòu)本研究通過采用ASV在所有樣本中的豐度數(shù)據(jù)，將每個(gè)分組作為一個(gè)集合，按樣品的分組情況統(tǒng)計(jì)每個(gè)集合中的ASV，并計(jì)算各個(gè)集合之間的關(guān)系，得到兩組所共有和獨(dú)有的ASV數(shù)量，即Venn圖(圖2)，其中有2 697個(gè)ASV是兩組間共有的，有10 088個(gè)ASV是手術(shù)組患者所獨(dú)有的，有9 226個(gè)ASV是非手術(shù)組患者獨(dú)有的；通過QIIME2軟件對去除singleton后的特征表進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組患者腸道微生物在門水平的主要優(yōu)勢細(xì)菌分別是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門、互養(yǎng)菌門、梭桿菌門、軟壁菌門(圖3)；在屬水平上，手術(shù)組中的鏈球菌屬(11.36%比4.58%)、雙歧桿菌屬(10.06%比4.59%)、糞桿菌屬(5.11%比4.57%)、布勞特氏菌屬(4.33%比3.59%)的菌群豐度比非手術(shù)組高，非手術(shù)組中的志賀菌屬(12.07%比6.03%)、擬桿菌屬(8.79%比6.51%)、乳桿菌屬(6.14%比5.36%)、羅氏菌屬(2.86%比2.33%)的菌群豐度要比手術(shù)組高(圖4)。

圖2 韋恩圖

圖3 門水平菌群相對豐度

圖4 屬水平菌群相對豐度

2.5 手術(shù)組與非手術(shù)組食管癌患者菌Beta多樣性分析本研究通過對bray-curtis距離矩陣進(jìn)行NMDS分析，采用Anosim非參數(shù)檢驗(yàn)分析方法比較，比較兩組之間的菌群差異，結(jié)果顯示手術(shù)組與非手術(shù)組間腸道微生物群落差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R=0.067，P=0.040)。見圖5。

圖5 NMDS分析(P=0.04)

2.6 手術(shù)組與非手術(shù)組食管癌患者菌LEfSe分析LEfSe分析是一種差異分析方法，本研究通過描述顯著差異物種LDA值分布柱狀圖，來展示每個(gè)組內(nèi)顯著富集的物種。LEfSe分析結(jié)果顯示，手術(shù)組與非手術(shù)之間微生物群落存在差異，手術(shù)組微生物富集區(qū)包括：乳桿菌目(LDA得分4.65，P=0.047)、鏈球菌科(LDA得分4.58，P=0.042)、放線菌科(LDA得分4.43，P=0.044)、雙歧桿菌科(LDA得分4.42，P=0.019)、韋榮球菌(LDA得分4.11，P=0.017)、梭桿菌屬(LDA得分2.99，P=0.011)、月形單胞菌屬(LDA得分2.72，P=0.014)(圖6)；非手術(shù)組中有6種微生物顯著富集，主要包括小桿菌屬(LDA得分4.01，P=0.036)、馬賽菌屬(LDA得分3.33，P=0.019)、螺桿菌屬(LDA得分3.29，P=0.033)、消化球菌屬(LDA得分2.62，P=0.045)、巨單胞菌屬(LDA得分2.57，P=0.012)、微單胞菌屬(LDA得分2.49，P=0.041)。

圖6 LEfSe分析

3 討論

人體腸道中存在著至少100萬億種微生物，共同影響著人體的免疫系統(tǒng)及健康狀況，包括癌癥的發(fā)生[11-13]。飲食習(xí)慣、生活方式及藥物等都可以影響腸道菌群的組成，腸道微生物通過維持腸道黏膜屏障的完整性、營養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)等功能來維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[14-16]。人體腸道微生物處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)此平衡遭到破壞時(shí)，菌群結(jié)構(gòu)和豐度會(huì)發(fā)生一定的變化，進(jìn)而導(dǎo)致病理學(xué)的改變及一些疾病的發(fā)生[17]，因此腸道菌群在維持人體正常生理功能中起著至關(guān)重要的作用，又被稱為人體“被遺忘器官”[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，食管病變與食管內(nèi)菌群特征緊密相關(guān)，YANG等[19]通過16S rRNA測序技術(shù)描述了正常食管、反流性食管炎及巴雷特食管患者遠(yuǎn)端食管菌群的多樣性，Pei等[20]對健康人群食管研究發(fā)現(xiàn)，在門水平上食管菌群中厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門豐度較高，占比95.1%。本研究發(fā)現(xiàn)，在門水平上，食管癌患者腸道菌群主要優(yōu)勢菌門分別為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門，占比95%左右，提示在門水平食管微生態(tài)與胃腸道微生態(tài)微生物群落差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另有研究表明，與健康成年人相比，食管癌患者口腔內(nèi)厚壁菌門豐度顯著增加[21-22]；而本研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)組厚壁菌門豐度要低于非手術(shù)組，推測可能原因?yàn)橥ㄟ^手術(shù)切除腫瘤，減輕腫瘤負(fù)荷作用，進(jìn)而影響腸道微環(huán)境。Gall等[23]發(fā)現(xiàn)，鏈球菌和普雷沃菌在巴雷特食管患者的食管微生物群中占主導(dǎo)地位，鏈球菌和普雷沃菌的比值與食管腺癌的一些風(fēng)險(xiǎn)因素有密切關(guān)系；本研究并未在食管癌患者腸道菌群中檢測到上述2種菌群的差異，表明食管微生態(tài)與胃腸道微生態(tài)在屬水平上存在差異，可能原因?yàn)榧?xì)菌從上消化道至下消化道的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中受到胃液、胰液以及某些代謝作用的影響，進(jìn)而促使腸道菌群發(fā)生改變。

對于早期食管癌患者，手術(shù)切除仍為主要治療手段[24]，但術(shù)口感染、吻合口瘺等術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率依然很高。研究表明，腸道微生物會(huì)對術(shù)后患者的預(yù)后產(chǎn)生影響。Bachmann等[25]發(fā)現(xiàn)腸道微生物對結(jié)直腸癌術(shù)后吻合口的愈合有較大的影響，宣煜龍等[26]發(fā)現(xiàn)口腔及胃內(nèi)微生物群組成不同可致吻合口瘺發(fā)生率增加。為了探索手術(shù)切除食管腫瘤引起的腸道菌群差異，本研究對食管癌患者手術(shù)與非手術(shù)組腸道菌群的Alpha及Beta多樣性加以分析，發(fā)現(xiàn)兩組間的Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、 Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Faith’s PD指數(shù)、Pielou指數(shù)、Good’s coveragecha指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩組間菌群豐富度、多樣性、均勻度、覆蓋度相似；但NMDS分析表明，兩組間微生物組成有所不同，提示手術(shù)切除腫瘤，對腸道微環(huán)境的變化產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響菌群組成。平貫芳等[27]發(fā)現(xiàn)消化道腫瘤會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)乳桿菌及雙歧桿菌豐度顯著減少，本研究通過LEfSe分析，評估兩組間腸道微生物的組成差異，發(fā)現(xiàn)與非手術(shù)組相比，乳桿菌目與雙歧桿菌等有益菌在手術(shù)組中較富集，推測由于通過手術(shù)切除腫瘤，減輕腫瘤負(fù)荷，進(jìn)而改變腫瘤微環(huán)境，更適合有益菌群的增長。而夏冰清等[28]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者術(shù)后腸道內(nèi)乳桿菌和雙歧桿菌等益生菌的豐度較術(shù)前減少，這與本研究結(jié)果存在差異，考慮可能原因?yàn)榻Y(jié)直腸癌根治術(shù)在切除腫瘤的同時(shí)，也直接破壞了腸道微環(huán)境，食管癌患者的發(fā)病部位位于上消化道，手術(shù)切除食管腫瘤，僅消除腫瘤對腸道微環(huán)境的影響，并未對腸道微環(huán)境造成直接破壞；而非手術(shù)組中有益菌減少，有害菌增加，這是否與腫瘤改變胃腸道生理，進(jìn)而導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，需要進(jìn)一步探索。

本研究為小樣本量關(guān)于食管癌患者手術(shù)與非手術(shù)組腸道菌群組成及差異的研究，排除了抗生素、益生菌及其他胃腸道疾病對試驗(yàn)結(jié)果的影響，并嚴(yán)格遵循糞便收集標(biāo)準(zhǔn)，及時(shí)保存送檢。本研究局限在于樣本量小，部分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，下一步將擴(kuò)大樣本量，繼續(xù)往下探索腸道微生物對食管癌患者手術(shù)切除與非手術(shù)切除預(yù)后的影響。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)食管癌患者手術(shù)切除與非手術(shù)切除腸道菌群組成存在差異，手術(shù)組較非手術(shù)有益菌群組富集，考慮通過手術(shù)切除食管腫瘤，減輕腫瘤負(fù)荷，由此改變了腫瘤對胃腸道生理環(huán)境的影響。