珍稀瀕危植物細(xì)果秤錘樹開花生物學(xué)特性和繁育系統(tǒng)

臺昌銳 趙 凱陽艷芳 吳 彥 翟 偉 童躍偉

（安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院皖西南生物多樣性研究與生態(tài)保護重點實驗室，安慶 246133）

開花生物學(xué)在植物的生活史研究中扮演著重要角色［1］。近年來，有關(guān)猬實（Kolkwitzia amabilis）、長梗杜鵑（Rhododendron longipedicellatum）、掌葉木（Handeliodendron bodinieri）等珍稀瀕危物種的開花生物學(xué)研究相繼開展［2-4］，以探索其開花特性及瀕危機制。同時，珍稀瀕危植物的繁育系統(tǒng)研究對植物資源保護具有重要的指導(dǎo)作用，越來越受研究人員重視，也逐漸成為一熱點研究課題［5-6］。它主要包括花部特征觀測、傳粉授粉行為和交配習(xí)性等內(nèi)容［7-8］。肖宜安等［9］，林鵬等［10］，余道平等［11］，戴攀峰等［12］對于長柄雙花木（Disanthus cercidifolius）、吊羅山薹草（Carex diaoluoshanica）、峨眉擬單性木蘭（Parakmeria omeiensis）等瀕危植物展開繁育系統(tǒng)研究，進一步探究其瀕危機制，為瀕危植物的保護和管理提供科學(xué)依據(jù)。

細(xì)果秤錘樹（Sinojackia microcarpa）屬安息香科（Styracaceae）秤錘樹屬（Sinojackia）觀賞性植物［13］，該種分布范圍狹窄，已知分布于臨安和建德，種群數(shù)目及個體數(shù)目少，現(xiàn)為國家Ⅱ級重點保護野生植物［14-15］。該種在研究秤錘樹屬的進化以及安息香科的發(fā)育上具有重要意義［16］。由于該種種群大多分布在海拔較低，距離人類活動范圍較近，由于開荒造林、修路開發(fā)等原因，其生境破壞嚴(yán)重。此外，該屬自身存在種子空殼率較高、種子萌發(fā)困難等問題，導(dǎo)致物種自然更新能力較差，種群大小急劇減小，目前已處于瀕危狀態(tài)，亟待有效保護［14］。而有關(guān)該屬植物的研究大多集中于物種資源現(xiàn)狀［17］、形態(tài)學(xué)［18］、遺傳多樣性［19］等方面，對細(xì)果秤錘樹開花生物學(xué)和繁育系統(tǒng)等方面研究鮮有報道。因此，本研究以細(xì)果秤錘樹為研究對象，對自然生境下細(xì)果秤錘樹的開花生物學(xué)特性和繁育系統(tǒng)進行研究，旨在進一步了解其開花特征和有性繁殖，為該珍稀瀕危植物資源保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

研究地點位于安徽省池州市貴池區(qū)梅街鎮(zhèn)栗山，地處安徽省老山自然保護區(qū)內(nèi)（117°21′7″N；30°17′4″E），海拔約66 m。該區(qū)域?qū)儆趤啛釒Ъ撅L(fēng)亞濕潤氣候區(qū)，氣候溫暖，陽光充足，雨水充沛，四季分明，年均溫在15.6～17.4 ℃，年均降水量為1 200～1 700 mm。整個種群內(nèi)有細(xì)果秤錘樹60 余株，主要分布在落葉闊葉林中，其林內(nèi)優(yōu)勢樹種主要 有 槲 櫟（Quercus aliena）、甜 櫧（Castanopsis eyrei）、板栗（Castanea mollissima）、杉木（Cunninghamia lanceolata）等喬木樹種；伴生有箬竹（Indocalamus tessellatus）、檵木（Loropetalum chinense）、中華石楠（Photinia beauverdiana）、白檀（Symplocos paniculata）等灌木樹種和狗脊蕨（Woodwardia japonica）、山類蘆（Neyraudia montana）、貫眾（Cyrtomium fortunei）、鞘柄菝葜（Smilax stans）等草本植物。

1.2 研究方法

1.2.1 花部形態(tài)特征觀測

隨機選取3 株植株，每株采集盛花期的花朵10 枚，并用游標(biāo)卡尺對花序長度、花冠口直徑、花瓣長度和寬度、雄蕊長度、花絲長度、花藥長度、雌蕊長度、花柱長度進行測量；按照Dafni［20］的研究方法計算雜交指數(shù)OCI（Out-crossing index）值，判斷其繁育系統(tǒng)的類型。

1.2.2 開花生物學(xué)觀察

隨機選取30枚未開放的花蕾，并掛牌標(biāo)記，連續(xù)數(shù)天觀察并記錄開花過程，直至花朵枯萎脫落。主要觀察內(nèi)容為：花序的類型，花朵各組成部分的顏色、形狀及數(shù)量，花蜜與氣味有無，花朵開放、花粉散出、柱頭伸長的時間，并記錄單花花期及種群花期。

1.2.3 花粉胚珠比

隨機采取10 枚新鮮花蕾置于FAA 固定液中，帶回實驗室進行花粉胚珠比測定。以花為單位將其花藥置于蒸餾水中，用玻璃棒將花粉擠散，定容于1 mL 的離心管中，充分搖勻，取出1 μL 在顯微鏡下用番紅染液染色后計數(shù)，每組重復(fù)3次。在光學(xué)顯微鏡（LEICA DM500，德國）下對子房進行解剖，并統(tǒng)計胚珠數(shù)量。

1.2.4 花粉活力測定

以離體培養(yǎng)萌發(fā)法測定細(xì)果秤錘樹花粉活性。選用5%、10%、15%、20% 4 個梯度水平的蔗糖溶液及0.010、0.025、0.050 g·L-13 個梯度水平硼酸溶液，加入0.5%的瓊脂制成固體培養(yǎng)基。每組試驗重復(fù)3 次。25 ℃培養(yǎng)3 h，探究細(xì)果秤錘樹花粉離體萌發(fā)最適條件。同時，選取最適培養(yǎng)基，開展花粉活性測定試驗，從花蕾期開始測定，每天10：00測定1次，隨機取不同植株的3朵花，并掛牌標(biāo)記，每朵花做2 個切片，每個切片取3 個視野范圍，每個視野范圍內(nèi)花粉數(shù)量要大于50枚，用平均花粉萌發(fā)率來評估花粉活力。

1.2.5 柱頭可授期檢測

采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性。將不同開花時間的柱頭分別浸泡在聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液中。若柱頭周圍的反應(yīng)液呈現(xiàn)藍(lán)色并出現(xiàn)大量氣泡，則柱頭具有可授性；若溶液不變藍(lán)色并無氣泡產(chǎn)生，則不具有可授性。

1.2.6 套袋實驗

在自然條件下，隨機選取未開放的花蕾進行套袋試驗，分別進行以下6 種處理（每種處理50枚，每組重復(fù)3 次）：①自然對照；②不去雄，套袋；③去雄，套紙袋；④去雄，套網(wǎng)袋；⑤去雄，套袋，人工同株異花授粉；⑥去雄，套袋，人工異株授粉。果實成熟后統(tǒng)計其坐果率和結(jié)籽率。

1.2.7 訪花者及訪花頻率觀察

隨機選取5 個盛花期植株，對其進行連續(xù)3 d的觀察記錄，觀察時間為08：00—18：00，以1 h 為1 個時間段對訪花昆蟲進行觀察和記錄。需記錄不同訪花者的訪花過程，主要包括訪花時間、停留時間、訪花數(shù)量、訪花行為等。訪花頻率=訪花次數(shù)/觀察時間，平均訪花頻率為不同時間段的訪花頻率的平均數(shù)。捕捉訪花昆蟲制作憑證標(biāo)本，并對其進行種類鑒定。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

將試驗相關(guān)數(shù)據(jù)用Excel 2016 軟件進行統(tǒng)計及圖表繪制，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 23.0 軟件作單因素方差（One-way ANOVA）分析，來比較不同處理下的坐果率、結(jié)籽率、不同訪花昆蟲的平均訪花頻率之間是否差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 開花生物學(xué)特征

2.1.1 花部形態(tài)特征

細(xì)果秤錘樹花期在4月中上旬，種群花期可持續(xù)20 d 左右，單花期5～7 d?；榭偁罹蹅慊ㄐ颍瑐?cè)生于小枝頂端（見圖1）；花白色，單花為完全花，無氣味；花兩性，花梗和花序梗均纖細(xì)而彎垂；萼片通常5～7 裂，裂片長圓狀披針形，長（12.22±0.92）mm，寬（4.54±0.48）mm。雄蕊通常10～12枚，密被短柔毛，子房半下位，3 室?；ㄖL（10.02±0.93）mm，線形，柱頭不明顯3 裂。按照Dafni［20］的標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)果秤錘樹花冠口直徑為（22.51±1.66）mm，記為3；花為兩性花，雌蕊先熟，記為0；雌雄蕊在空間分離，柱頭高于花藥，記為1；因此統(tǒng)計得出細(xì)果秤錘樹的雜交指數(shù)≥4。根據(jù)繁育系統(tǒng)評判標(biāo)準(zhǔn)，其部分自交親和，異交需要傳粉者。細(xì)果秤錘樹花形態(tài)各項參數(shù)值見表1。

表1 花形態(tài)各項參數(shù)值Table 1 Various morphological parameters of flower

2.1.2 開花物候

細(xì)果秤錘樹單花花期5～7 d，不同天氣條件下開花時間有所不同，在晴天溫暖天氣條件下花期較短約為5 d，在陰雨低溫的天氣條件下花期延長為7 d。依據(jù)開花進程，可將其花期分為5 個階段（見圖2）。①花蕾期：花蕾和柱頭均呈淡綠色，花瓣未開放，雄蕊呈一輪包圍雌蕊，花藥膨大呈黃綠色圍繞在柱頭周圍。②初開期：花瓣呈白色未完全展開，柱頭呈淡綠色，已明顯伸長且高于花藥。距離柱頭較近的花藥呈淡黃色，已開裂，但未散粉。距離花柱較遠(yuǎn)的部分花藥呈黃綠色，仍未開裂。③盛開期：白色花瓣完全展開，柱頭呈白色，距離花柱較近的花藥開始散出花粉，散粉后花藥變得干癟且顏色加深。距離花柱較遠(yuǎn)的部分花藥依然未散粉呈淡黃色。④衰落期：此時，柱頭顏色加深呈黃色，花藥圍繞花柱緊密排列，已全部開裂，呈黃色，花粉散出，并萎縮。⑤凋謝期：花瓣呈枯萎皺縮，花藥萎縮，花粉基本散盡，柱頭與花藥的顏色加深，呈褐色，最后，花瓣和花藥一起脫落。

圖2 細(xì)果秤錘樹開花動態(tài)A.花蕊期；B.初開期；C～D.盛開期；E衰落期；F～G.凋謝期Fig.2 Flowering dynamics of Sinojackia microcarpaA.Stamen stage；B.Initial opening stage；C-D.Blooming stage；E.Declining stage；F-G.Withering stage

2.1.3 花粉胚珠比

由表2 可知，細(xì)果秤錘樹單花花藥數(shù)量為10.70±0.82，單花花粉量為61 190.40±9 669.66，胚珠數(shù)量為15.00±2.00，花粉與胚珠比為4 093.21±498.56。依據(jù)Cruden［21］的標(biāo)準(zhǔn)，理論上細(xì)果秤錘樹的交配方式是專性異交。

表2 細(xì)果秤錘樹P/O值Table 2 P/O value of S.microcarpa

2.2 繁育系統(tǒng)特征

2.2.1 花粉活力

試驗表明，15%的蔗糖溶液及0.025 g·L-1的硼酸溶液制成的固體培養(yǎng)基最適于細(xì)果秤錘樹花粉萌發(fā)（見圖3）。用該配置制成培養(yǎng)基測得開花前（花蕾期）細(xì)果秤錘樹花粉活力較低約為5.58%，開花當(dāng)天的花粉活力有所提高，約為44.05%。開花第2天的花粉活力持續(xù)增長，達(dá)58.16%。開花第3天的花粉活力最高，約為76.21%。隨后細(xì)果秤錘樹的花粉活力持續(xù)下降，開花第4 天、第5 天、第6天的花粉活力分別為62.96%、42.52%、34.45%，開花第7 天時花朵大多枯萎，花粉已大量散去，花粉活力較低為18.37%?；ǚ廴旧盎ǚ酃苊劝l(fā)情況見圖4。

圖3 細(xì)果秤錘樹花粉活力（n=3）Fig.3 Pollen vitality of S.microcarpa

圖4 花粉染色及花粉管萌發(fā)A～B.花粉的醋酸洋紅染色；C～D.花粉管生長明顯Fig.4 Pollen staining and pollen tube germination A-B.Magenta acetate staining of pollen；C-D.The pollen tube grew obviously

2.2.2 柱頭可授性

試驗表明細(xì)果秤錘樹開花前期柱頭不具可授性，開花第1天柱頭部分具有可授性，開花第2天的柱頭可授性最高，第3天柱頭具有可授性，第4天柱頭可授性較低，第5天不具可授性（見表3）。

表3 細(xì)果秤錘樹柱頭可授性Table 3 Stigma acceptability of S.microcarpa

2.2.3 套袋處理結(jié)果

通過單因素分析顯示，不同處理下的坐果率差異顯著（P＜0.05），結(jié)籽率差異極顯著（P＜0.01）。試驗表明（表4），細(xì)果秤錘樹在自然條件下結(jié)籽率為（55.33±5.03）%，結(jié)籽率較低，僅有（2.67±2.31）%。說明在自然條件下，可能存在花粉限制問題。不去雄、套袋，坐果率為0，說明其傳粉需要昆蟲。去雄套紙袋和去雄套網(wǎng)袋2種處理下，坐果率均為0，表明細(xì)果秤錘樹不存在無融合生殖現(xiàn)象和風(fēng)媒傳粉。去雄人工同株異花授粉條件下，結(jié)籽率為（17.33±3.06）%，結(jié)籽率較低，僅有（1.33±1.15）%。去雄后人工異株授粉，坐果率較高，為（83.33±5.03）%，結(jié)籽率有所提高但仍較低，為（5.33±2.31）%，說明異株授粉能夠提高坐果率和結(jié)籽率。

表4 不同授粉處理下細(xì)果秤錘樹的坐果率和結(jié)籽率Table 4 Fruitset rate and seed set rate of S.microcarpaunder different pollination treatments

2.3 訪花昆蟲及訪花行為

通過野外觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)果秤錘樹的訪花昆蟲有3目5科7種，主要訪花昆蟲有黃胸木蜂（Xylocopa appendiculata）、熊蜂（Bombussp.）、胡蜂（Vespasp.）、中華蜜蜂（Apis cerana）、黑帶食蚜蠅（Episyrphus balteatus）和大黃長角蛾（Nemophora amurensis）（見圖5）。蜂類訪花的目的主要是采集花粉，在訪花過程中其足部的采粉器及腹胸部會附著大量花粉。黃胸木蜂體型較大，在訪花過程中聲音較大，振幅較強，訪花時間較短，每朵大概停留3～5 s，通常在同一植株上連續(xù)訪問幾朵花后才離開。采集花粉時通常將身體弓起，用前足緊緊抱住花，上顎抵住花粉囊，從花冠正上方開口處進入花內(nèi)采集花粉。熊蜂體長體被稠密的絨毛，攜粉量大，訪花時間短且訪花多，每朵花大概停留1～4 s。訪花時，熊蜂用喙吸取花粉，前足直接落于雄蕊上，后足有花粉筐，在訪花過程中足部和胸部粘有很多花粉，接觸到雌蕊柱頭而實現(xiàn)傳粉。中華蜜蜂在訪花時，單花停留時間5～9 s，直接落于花上，身體緊緊保住雄蕊，足部不停的摩擦花粉囊，頭、胸、腹、足均與雄蕊和柱頭直接接觸。黑帶食蚜蠅單花停留時間較長，平均為45 s，訪花時落到花瓣上，在花上用中足和后足支撐身體然后采集花粉，兩前足來回搓動花粉，舔舐花粉。黑帶食蚜蠅雖在覓食中也能攜帶花粉，但體型較小且訪花次數(shù)較少，對傳粉的貢獻(xiàn)不大。胡蜂訪花時，足部抱住雄蕊和花柱，足部和腹部沾有花粉，平均停留時間較短（約5 s），但在觀察期間訪花次數(shù)較少。家蠅訪花時，上顎和足部接觸花粉，但在觀察期間僅有2次訪花行為，故并非主要訪花昆蟲。大黃長角蛾僅停落在花瓣上，停留時間較短，未見明顯傳粉行為，為無效傳粉媒介。

由表5可知，不同傳粉者在平均訪花頻率上存在顯著差異（P＜0.05）。其中，黃胸木蜂和熊蜂的平均訪花頻率較高分別為（4.42±0.11），（8.67±0.21）次·h-1；中華蜜蜂平均訪花頻率約為（2.88±0.05）次·h-1，最高訪花頻率為3 次·h-1；胡蜂和黑帶食蚜蠅的平均訪花頻率較低，分別為（0.39±0.05），（0.61±0.05）次·h-1。隨著時間的變化，昆蟲的訪花頻率存在顯著差異（P＜0.05）（見圖6），整體看來，08：00—10：00 昆蟲訪花頻率較低，11：00—14：00昆蟲對于細(xì)果秤錘樹的訪花頻率較高，為訪花高峰期，15：00—18：00 昆蟲的訪花頻率較低。根據(jù)觀察訪花昆蟲的訪花次數(shù)與天氣溫度有關(guān)，在晴天溫暖的中午有較多昆蟲訪花，而清晨和傍晚，以及陰雨低溫的天氣訪花昆蟲較少。

表5 主要訪花昆蟲的平均訪花頻率Table 5 Average visiting frequency of main flower visiting insects

圖6 不同時間段昆蟲訪花頻率Fig.6 Frequency of insect visiting flowers in different periods

3 討論

3.1 開花生物學(xué)特征及繁育系統(tǒng)

從細(xì)果秤錘樹的生物學(xué)特征來看，細(xì)果秤錘樹在開花過程中，花朵顏色潔白，并無明顯芳香氣味，花朵多且聚集成一定的花序結(jié)構(gòu)，從某種程度上增加了對昆蟲的吸引?；ㄐ螤?、顏色和氣味均是植物吸引昆蟲進行傳粉的重要條件［22-23］?；ǖ拈_放方式，可視為花的表現(xiàn)特征，是影響其傳粉成功的關(guān)鍵［24-25］。從花部結(jié)構(gòu)上來看，細(xì)果秤錘樹的柱頭始終比花藥高，不利于自花花粉落在柱頭上。根據(jù)花部形態(tài)特征估算，細(xì)果秤錘樹的雜交指數(shù)等于4，其繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交需要傳粉者。并且通過試驗發(fā)現(xiàn)其花粉活力與柱頭可授性峰期不同步，存在一定的時間間隔，避免了自花自交。套袋試驗驗證，細(xì)果秤錘樹存在部分自交不親和性，且不存在無融合生殖，故傳粉昆蟲是其傳粉過程中必不可少的；異株異花授粉的坐果率明顯大于自花授粉坐果率，表現(xiàn)為一定的近交衰退，再一次驗證了細(xì)果秤錘樹繁育系統(tǒng)是以異交為主，需要傳粉者，研究結(jié)果具有一致性。

3.2 細(xì)果秤錘樹有性繁殖的限制因素

根據(jù)物候觀察，細(xì)果秤錘樹單花花期時間僅5～7 d，而種群花期為20 d 左右，且花期大多處于梅雨季節(jié)，在開花過程中容易遭遇強降雨等惡劣天氣，會導(dǎo)致花瓣和雄蕊直接脫落，花粉被雨水沖刷脫落、花藥發(fā)生水溶性腐敗等不良影響，從而導(dǎo)致授粉難以成功。李曉婷等［26］的研究結(jié)果表明植物的花期不同步、且種群花期較長的優(yōu)勢在于保證異花傳粉受精的完成，另一方面降低了開花期間惡劣環(huán)境條件對其生殖過程的影響［27-28］。

傳粉昆蟲的限制是影響植物生殖成功的重要原因之一［29-30］。對植物訪花昆蟲種類的確認(rèn)是傳粉生物學(xué)的重要內(nèi)容之一，同時也是探究該物種的瀕危機制的重要前提［31］。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)細(xì)果秤錘樹在破碎化生境中傳粉昆蟲種類較少，且訪花頻率低，易受惡劣天氣影響，傳粉昆蟲在訪花時常在同一植株連續(xù)訪問數(shù)朵。本研究的傳粉昆蟲是否為有效傳粉昆蟲還需進一步研究討論。自然條件下中細(xì)果秤錘樹的花較多，坐果率較高，但結(jié)籽率很低且種子大多空殼或種子發(fā)育不良，推測可能與該物種缺少傳粉昆蟲和傳粉效率低有關(guān)。李俊蘭等［32］認(rèn)為大部分瀕危植物缺少有效產(chǎn)傳粉者或傳粉效率不高，導(dǎo)致傳粉環(huán)節(jié)失敗，結(jié)籽率降低，變異率降低，從而嚴(yán)重影響種群的自我更新，致使物種的瀕危［33-34］。此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在細(xì)果秤錘樹自然分布區(qū)內(nèi)，罕見幼苗，其繁殖方式主要是無性繁殖，通過根部產(chǎn)生分蘗產(chǎn)生新植株，推測在傳粉、胚珠受精過程存在限制因素導(dǎo)致種子敗育。在自然狀態(tài)下，細(xì)果秤錘樹種群往往呈破碎化分布，種群大小不一，且距離間隔較遠(yuǎn)，異株傳粉在很大程度上受到限制，對其傳粉和結(jié)果具有一定影響。另外，細(xì)果秤錘樹種子萌發(fā)困難，且萌發(fā)幼苗在轉(zhuǎn)化成幼樹的過程中易受環(huán)境脅迫，以分蘗產(chǎn)生克隆植株是細(xì)果秤錘樹對生境破壞的一種適應(yīng)對策，有利于其種群在自然界生存和繁育。毛少利等［2］對猬實的研究結(jié)果也表明植物通過根糵產(chǎn)生克隆植株可作為其有性生殖受阻的一個補償，以適應(yīng)特殊生境，保證其種群在自然界繁衍生息［35］。

4 結(jié)論及展望

細(xì)果秤錘樹的瀕危機制是多方面因素導(dǎo)致的，本研究從開花生物學(xué)及繁育系統(tǒng)角度展開相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)該種存在致瀕因子：花期處于梅雨季節(jié)，傳粉易受天氣影響；其花粉活性和柱頭可授性峰期不同步，存在時間間隔，進一步影響其傳粉成功；其繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交為主，需要傳粉者；傳粉昆蟲種類較少，且訪花頻率低，易受惡劣天氣影響。本研究結(jié)果可為該種資源保護提供新策略，例如進行人工授粉提高坐果率和結(jié)籽率等。此外，針對在傳粉環(huán)節(jié)和發(fā)育環(huán)節(jié)存在限制因素導(dǎo)致該種子空殼率較高且萌發(fā)率極低等問題，仍需進一步開展深入研究。