體外銀屑病樣三維皮膚模型的構(gòu)建

解雨馨，彭慧玲，先德海，鐘建橋

銀屑病是一種慢性炎癥性疾病，與遺傳易感性、免疫、炎癥、氧化應(yīng)激、外界環(huán)境等因素密切相關(guān)，影響全球人群約2%～3%[1]。在組織學(xué)上主要表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KCs)異常增殖、真皮毛細(xì)血管增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。目前銀屑病的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，但炎癥和氧化應(yīng)激被認(rèn)為是致其發(fā)病的重要促進(jìn)因素[2-3]。為更好地闡明銀屑病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)而開(kāi)發(fā)相應(yīng)的藥物，各種體內(nèi)外模型得以快速發(fā)展。雖然動(dòng)物模型能在一定程度上模擬人銀屑病，但由于動(dòng)物和人體的差異性與倫理學(xué)爭(zhēng)議，使該類模型在發(fā)病機(jī)制研究和新藥療效觀察方面仍受局限?；诖?，體外模型得到了很好的發(fā)展，尤其是體外三維皮膚模型具有比單層細(xì)胞模型更符合人體皮膚結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)[4-5]。故本研究通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和γ-干擾素(interferon-gamma，IFN-γ)干預(yù)正常三維皮膚模型，建立具有類銀屑病形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)特征的銀屑病樣三維皮膚模型，為進(jìn)一步探究銀屑病的發(fā)病機(jī)制以及后續(xù)藥物研發(fā)提供理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 構(gòu)建三維皮膚模型的細(xì)胞所需要的原代KCs和成纖維細(xì)胞(fibroblasts, FBs)，均來(lái)自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行包皮環(huán)切術(shù)的2～10歲健康兒童的包皮。該研究獲得西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(2015016A)，同時(shí)已獲取患兒家屬的書面同意，簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑 Ⅰ型鼠尾膠原蛋白購(gòu)自北京鴻躍生物科技有限公司；TNF-α和IFN-γ購(gòu)自美國(guó)PROTEINTECH GROUP公司；白細(xì)胞介素17(interleukin-17,IL-17)、IL-22、IL-23及活性氧(reactive oxygen species, ROS)試劑盒購(gòu)自北京安迪華泰科技有限公司；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及谷胱甘肽(glutathione, GSH)試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司；角蛋白17(keratin-17, K17)、Ki67抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 參照課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[6-8]，將獲取的新鮮包皮組織徹底清洗、消毒，去除皮下血管、脂肪等，然后將其切成0.5 cm2的組織塊，以真皮朝下浸沒(méi)于0.25%中性蛋白酶4 ℃消化過(guò)夜。次日分離表皮和真皮，進(jìn)一步將其剪碎，分別置于0.1%胰酶中37 ℃消化60 min。終止消化后以1 200 r/min速度離心6～8 min。經(jīng)吸管反復(fù)吹打后收集上清，予以40 μm細(xì)胞濾器過(guò)濾上清，再度離心棄上清后余留表、真皮細(xì)胞沉淀。然后予以Dk-SFM培養(yǎng)基(限制性KCs無(wú)血清培養(yǎng)基)重懸表皮細(xì)胞即KCs沉淀和含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸真皮細(xì)胞即FBs沉淀。最后分別接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37 ℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)傳代至2～3代時(shí)進(jìn)行相關(guān)研究。因課題組前期已對(duì)上述細(xì)胞成功進(jìn)行鑒定，故此處未再行鑒定[6]。

1.2.2正常和銀屑病樣三維皮膚模型的建立 按照課題組前期構(gòu)建正常三維皮膚模型方法[6, 8]，將200 μL的Ⅰ型鼠尾膠原蛋白、12 μL NaOH和28 μL稀釋10倍后的FBs培養(yǎng)基混勻，隨后立即加入760 μL FBs細(xì)胞懸液，充分混勻后移入Transwell上室，室溫靜置凝固后，上下室各加1 mL FBs培養(yǎng)基，置于37 ℃，含5%CO2孵箱中培養(yǎng)。3～6 d后待真皮類似物收縮成穩(wěn)定大小，接種KCs于其表面，以Dk-SFM培養(yǎng)基浸沒(méi)培養(yǎng)5～7 d，再氣-液培養(yǎng)約10～14 d獲得正常三維皮膚模型。同時(shí)在氣-液培養(yǎng)的最后4 d，每天于上室中加入7.5 ng/mL的TNF-α和7.5 ng/mL的IFN-γ，以構(gòu)建銀屑病樣三維皮膚模型，肉眼每日觀察模型的變化。干預(yù)結(jié)束后，收集兩種三維皮膚模型的組織和上清，行組織病理學(xué)觀察其形態(tài)變化，運(yùn)用免疫組織化學(xué)、分子學(xué)方法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)以鑒定該模型。

1.3實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1HE染色檢測(cè)三維皮膚模型的病理組織改變 把經(jīng)4%多聚甲醛固定、蔗糖溶液脫水后的正常皮膚組織與銀屑病樣三維皮膚組織，進(jìn)行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，觀察所構(gòu)建的三維皮膚模型結(jié)構(gòu)。

1.3.2免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)三維皮膚模型K17和Ki67表達(dá)情況 正常與銀屑病樣三維皮膚模型組織的前期石蠟包埋、切片等步驟同HE染色。制備好的切片經(jīng)過(guò)干燥、脫蠟、水洗后，依次予以3%過(guò)氧化氫和5%BSA封閉、一抗孵育過(guò)夜。次日二抗孵育0.5～1 h、DAB顯色、蘇木素復(fù)染，脫水、封片完成后在鏡下觀察K17和Ki67的表達(dá)情況。 KCs胞漿顯示棕黃色表示K17 陽(yáng)性，胞核顯示棕黃色即Ki67陽(yáng)性，而未顯色則為陰性表達(dá)。

1.3.3ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-17、IL-23、ROS等表達(dá)水平 采用ELISA檢測(cè)正常與銀屑病樣三維皮膚模型上清中 IL-17、IL-22、IL-23、ROS、MDA、SOD和GSH的含量。具體操作嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，終止反應(yīng)后在酶標(biāo)儀上不同波長(zhǎng)處讀取兩個(gè)樣本各指標(biāo)的OD值，最后參照標(biāo)準(zhǔn)曲線量化各指標(biāo)在不同樣本中的濃度。

2 結(jié)果

2.1KCs和FBs細(xì)胞形態(tài)和特征 倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代人KCs呈貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)為多角形或鋪路石樣，3～4 d逐漸融合(圖1a)。FBs呈貼壁生長(zhǎng)，呈梭形外觀，逐漸形成密集分布放射狀(圖1b)。

Primary KCs; Primary FBs圖1 KC和FBs原代培養(yǎng)形態(tài) (×400)Fig.1 Morphology of KCs and FBs in primary culture (×400)

2.2銀屑病樣三維皮膚模型外觀表現(xiàn) 正常三維皮膚模型外觀呈均勻乳白色，半透明狀，邊緣整齊無(wú)卷曲，具有一定的韌性和彈性(圖2a)。銀屑病樣三維皮膚模型則呈乳白色不透明狀，邊緣卷曲，較正常三維皮膚模型增厚、縮小(圖2b)。

Normal three-dimensional skin model; Psoriasis-like three-dimensional skin model圖2 兩種三維皮膚模型的外觀形態(tài)Fig.2 Appearance of two three-dimensional skin models

2.3銀屑病樣三維皮膚模型組織病理學(xué)表現(xiàn) HE染色后光鏡下觀察，正常三維皮膚模型可見(jiàn)分層的表皮和真皮，表皮層由 1～3 層排列整齊、緊密的 KCs 組成，真皮層見(jiàn)梭形FBs 和紅色膠原(圖3a)。銀屑病樣三維皮膚模型的表皮層較正常三維皮膚模型明顯增厚，由6～8層KCs組成，真皮層仍可見(jiàn)FBs和紅色膠原(圖3b)。

Normal three-dimensional skin model; Psoriasis-like three-dimensional skin model圖3 兩種三維皮膚模型組織病理學(xué)改變 (×400)Fig.3 Histopathology of two three-dimensional skin models (×400)

2.4銀屑病樣三維皮膚模型高表達(dá)K17 和Ki67 免疫組化染色顯示，正常三維皮膚模型表皮細(xì)胞胞質(zhì)中幾乎不表達(dá)K17(圖4a)，僅見(jiàn)少量胞核表達(dá)Ki67(圖4b)。銀屑病樣三維皮膚模型表皮細(xì)胞胞質(zhì)中K17呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖4c)，約70%胞核表達(dá)Ki67(圖4d)。

Expression of K17 in normal three-dimensional skin model; Expression of Ki67 in normal three-dimensional skin model; Expression of K17 in psoriasis-like three-dimensional skin model; Expression of Ki67 in psoriasis-like three-dimensional skin model圖4 兩種三維皮膚模型K17和Ki67的表達(dá)情況 (×400)Fig.4 Expression of K17 and Ki67 in two three-dimensional skin models (×400)

2.5銀屑病樣三維皮膚模型炎癥因子表達(dá)上調(diào) 與正常三維皮膚模型相比，銀屑病樣三維皮膚模型上清中炎癥因子IL-17、IL-22和IL-23的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)(圖5)。

IL-17;IL-22;IL-23Note: A indicated normal three-dimensional skin model; B indicated psoriasis-like three-dimensional skin model;compared with the normal three-dimensional skin model, **P<0.01.圖5 兩種三維皮膚模型炎癥因子的表達(dá)Fig.5 Expression of inflammatory factors in two three-dimensional skin models

2.6銀屑病樣三維皮膚模型氧化-抗氧化平衡失調(diào) 與正常三維皮膚模型比較，銀屑病樣三維皮膚模型上清中氧化物ROS和MDA水平升高明顯(P<0.01)，而抗氧化物/酶SOD和GSH表達(dá)明顯下降(P<0.01)(表1)。

表1 兩種三維皮膚模型上清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平Tab.1 Levels of oxidative stress-related indicators in supernatant of two three-dimensional skin

3 討論

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，可出現(xiàn)在任何年齡段，近年發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，全球約2%～3%的人群日常生活與身心健康受到其影響[1]。目前銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，炎癥和氧化應(yīng)激可能是促進(jìn)該病發(fā)生發(fā)展的重要因素，其中一些關(guān)鍵的促炎因子參與了銀屑病的發(fā)病過(guò)程。由于缺乏一個(gè)精準(zhǔn)、穩(wěn)定、可復(fù)制又無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議的銀屑病臨床前模型，因而對(duì)于其發(fā)病機(jī)制的探究始終難以深入，并且極大地阻礙了新藥研發(fā)。故在本研究中，筆者通過(guò)機(jī)械分離結(jié)合酶消化法，獲得KCs和FBs，并以Ⅰ型鼠尾膠原蛋白作為支架，構(gòu)建出正常三維皮膚模型。隨后予以TNF-α和IFN-γ干預(yù)建立銀屑病樣三維皮膚模型。造模完成后取皮膚模型組織經(jīng)HE染色后觀察其病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)染色測(cè)定K17和Ki67的表達(dá)，ELISA和比色法分析兩種三維皮膚模型上清液中IL-17、IL-22、IL-23、ROS、MDA、SOD和GSH的水平變化，以探尋出更符合銀屑病特征的模型。

既往對(duì)銀屑病模型的研究主要局限于動(dòng)物試驗(yàn)或者細(xì)胞水平如單層細(xì)胞培養(yǎng)的KCs[9]。現(xiàn)今已經(jīng)成功構(gòu)建出的多種銀屑病模型，如體內(nèi)動(dòng)物模型包括直接誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型、異種移植小鼠模型、細(xì)胞因子注射小鼠模型、Camk4小鼠以及基因工程小鼠模型等[10-13]；但因其成本高以及動(dòng)物倫理、人與小鼠免疫系統(tǒng)間差異等問(wèn)題，使其應(yīng)用受限。而體外細(xì)胞模型如以HaCaT及人KCs為細(xì)胞源，加入相關(guān)因子建立的銀屑病樣細(xì)胞模型，雖然構(gòu)建方法簡(jiǎn)單、可重復(fù)性高，但該類模型難以模擬體內(nèi)狀態(tài)，尤其是難以呈現(xiàn)銀屑病組織病理學(xué)特點(diǎn)[9]。因此在更接近人體皮膚狀態(tài)下，應(yīng)用三維皮膚模型進(jìn)行銀屑病的研究尤為恰當(dāng)。它不僅能真實(shí)地模仿人體內(nèi)環(huán)境，還可避免倫理學(xué)爭(zhēng)議。本研究通過(guò)建立體外三維皮膚模型后加入細(xì)胞因子以模擬銀屑病狀態(tài)，最終構(gòu)建出銀屑病樣三維皮膚模型。

本實(shí)驗(yàn)基于課題組前期方法成功分離和培養(yǎng)出KCs和FBs，以Ⅰ型鼠尾膠原為支架混合FBs構(gòu)建真皮層，再接種KCs重建表皮層，最終獲得類似人皮膚的乳白色、半透明狀物，其邊緣整齊無(wú)卷曲，具有一定韌性和彈性；同時(shí)組織病理學(xué)表現(xiàn)為表皮層由1～3層KCs組成，細(xì)胞排列整齊、緊密，真皮層為梭形FBs和膠原構(gòu)成。這與本課題組前期[8]以及Morin[5]、Mok等[4]構(gòu)建的三維皮膚模型無(wú)論是形態(tài)學(xué)還是組織病理學(xué)特征均一致，證實(shí)本研究再次成功培養(yǎng)出人正常三維皮膚模型。盡管所構(gòu)建的三維皮膚表皮細(xì)胞層數(shù)略少，細(xì)胞之間的連接不夠緊密，考慮可能與體外KCs分化不良以及KCs快速增殖使角質(zhì)透明蛋白和脂質(zhì)的減少有關(guān)；但本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的三維皮膚已具備較完整的表、真皮結(jié)構(gòu)，接近正常皮膚，這為后續(xù)銀屑病樣三維皮膚模型的建立奠定良好基礎(chǔ)。

眾多研究已證實(shí)TNF-α和IFN-γ是銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵因子[9]，并與疾病的嚴(yán)重度密切相關(guān)[14]。TNF-α可通過(guò)增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)以促進(jìn)血管生成，還可激活NF-κB進(jìn)而促進(jìn)KCs增殖。而IFN-γ可以誘導(dǎo)抗凋亡蛋白表達(dá)，刺激KCs增殖[15]，從而加重銀屑病皮損[16]。既往的研究[9]常應(yīng)用這兩種因子干預(yù)人KCs(如HaCaT細(xì)胞)以獲得銀屑病樣細(xì)胞模型[17]。因此，在課題組前期三維皮膚模型構(gòu)建的基礎(chǔ)上優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，分別將7.5 ng/mL的TNF-α和7.5 ng/mL的IFN-γ加入正常三維皮膚模型中進(jìn)行誘導(dǎo)刺激以構(gòu)建銀屑病樣三維皮膚模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入上述因子的三維皮膚較正常三維皮膚增厚、縮小，且皮膚邊緣出現(xiàn)卷曲，這可能是與TNF-α和IFN-γ共同刺激后，致KCs快速增殖從而牽拉組織以及表皮生長(zhǎng)周期明顯縮短有關(guān)。同時(shí)HE染色顯示其表皮層明顯增厚約6～8層，與人銀屑病組織病理學(xué)改變相類似，提示本課題構(gòu)建的三維皮膚模型具有銀屑病的特點(diǎn)。

那么本研究構(gòu)建的模型是否為銀屑病樣三維皮膚模型？是否具有銀屑病KCs異常增殖、炎癥及氧化應(yīng)激等狀態(tài)特征？較多研究認(rèn)為，炎癥和氧化應(yīng)激是銀屑病發(fā)病的重要促進(jìn)因素，它們始終貫穿于銀屑病的發(fā)生發(fā)展中[2-3]。銀屑病患者血清和皮損中的炎癥及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)表達(dá)顯著異常，如促炎因子(IL-17、IL-23、IL-22等)以及ROS、MDA等水平升高，而SOD、GSH等降低，使銀屑病氧化應(yīng)激狀態(tài)持續(xù)；在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS激活MAPK、JAK/STAT等通路，促進(jìn)KCs和T細(xì)胞活化并分泌一系列促炎因子，以及銀屑病特異性標(biāo)志物K17和促增殖因子Ki67等形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]，使KCs異常增殖、過(guò)多血管形成、炎癥持續(xù)，最終導(dǎo)致銀屑病發(fā)生[16-19]。因此結(jié)合上述銀屑病的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步證實(shí)本研究構(gòu)建的模型是銀屑病樣三維皮膚模型，本課題組又檢測(cè)了相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TNF-α和IFN-γ誘導(dǎo)后的三維皮膚強(qiáng)表達(dá)銀屑病特異性標(biāo)記K17和促增殖因子Ki67，而正常三維皮膚無(wú)明顯表達(dá)或表達(dá)很弱，提示本實(shí)驗(yàn)建立的三維皮膚模型具有銀屑病生物學(xué)特性，且KCs出現(xiàn)異常增殖。同時(shí)IL-17、IL-22、IL-23等炎癥因子以及ROS和MDA水平顯著升高，而SOD、GSH水平降低，均提示炎癥和氧化應(yīng)激發(fā)生，符合銀屑病的改變[18]，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。以上結(jié)果證實(shí)本研究已成功構(gòu)建出銀屑病樣三維皮膚模型。

綜上所述，本研究中經(jīng)TNF-α和 IFN-γ干預(yù)后的三維皮膚模型，無(wú)論是外觀、組織病理學(xué)表現(xiàn)，還是炎癥因子和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化，均符合銀屑病改變，表明通過(guò)本組實(shí)驗(yàn)方法能成功構(gòu)建出銀屑病樣三維皮膚模型，為銀屑病發(fā)病機(jī)制的深入研究和新藥的開(kāi)發(fā)提供理想的實(shí)驗(yàn)載體，值得進(jìn)一步研究和應(yīng)用。由于該模型不具備T細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管等結(jié)構(gòu)，仍不能完全模擬人體皮膚結(jié)構(gòu)，因此需要繼續(xù)完善。