補(bǔ)體C3調(diào)控細(xì)胞凋亡抑制咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮膚炎癥反應(yīng)

鄭權(quán)友，楊奕，梁申菊

銀屑病(psoriasis)是一種炎癥性皮膚病，其典型病理表現(xiàn)為免疫炎癥細(xì)胞浸潤、真皮毛細(xì)血管增生紊亂、角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖及分化不良等[1]。免疫炎癥反應(yīng)介導(dǎo)銀屑病病理過程，角質(zhì)形成細(xì)胞-免疫細(xì)胞相互作用促進(jìn)銀屑病進(jìn)展[2]。補(bǔ)體系統(tǒng)是天然免疫的重要組分，包含多種表面分子、可溶性蛋白及諸多受體，在促進(jìn)炎癥反應(yīng)、清除病原體及損傷細(xì)胞、調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮重要作用[3]。

補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)的樞紐分子：補(bǔ)體系統(tǒng)由經(jīng)典、凝集素及旁路途徑活化，形成C3裂解酶，裂解C3分子并活化下游補(bǔ)體成分，最終形成攻膜復(fù)合物介導(dǎo)細(xì)胞損傷及多種活性成分參與免疫應(yīng)答[4]。皮膚組織中，角質(zhì)形成細(xì)胞是補(bǔ)體C3的主要來源，C3參與調(diào)節(jié)多種皮膚疾病病理過程，包括特應(yīng)性皮炎及銀屑病[5]。然而，補(bǔ)體C3在銀屑病中的作用及機(jī)制尚不完全明確。

IMQ乳膏局部涂抹是一種常用銀屑病皮炎動物模型，其主要依賴于IMQ激活Toll樣受體7(TLR7)及其他信號通路[6-7]。該病理過程中IMQ可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡及壞死，并釋放大量炎癥因子，如IFN-γ、IL-1、核酸及S100A8/A9等，激活皮膚炎癥反應(yīng)[8]。補(bǔ)體分子，如C1q及C3，在清除凋亡細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。研究[11]表明，凋亡細(xì)胞清除障礙可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)異?；罨龠M(jìn)多種自身免疫疾病病理過程，包括銀屑病。據(jù)此，筆者推測補(bǔ)體C3可通過調(diào)節(jié)凋亡細(xì)胞清除在IMQ誘導(dǎo)銀屑病皮炎病理過程中發(fā)揮重要作用。

本研究擬利用IMQ誘導(dǎo)銀屑病皮炎模型，探討補(bǔ)體C3通路在銀屑病病理過程中的作用及機(jī)制，結(jié)果報告如下。

1 材料及方法

1.1實驗小鼠 C57B6/L野生型(C3+/+)對照小鼠購自北京華阜康生物技術(shù)有限公司。C3基因敲除小鼠(C3-/-，C57B6/L背景)購自美國Jackson實驗室。實驗操作及動物倫理嚴(yán)格依據(jù)第三軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會制定的動物倫理規(guī)范執(zhí)行。

1.2實驗材料 5%咪喹莫特乳膏(明欣利迪，H20030128，成都)；Z-VAD-FMK、抗熒光淬滅封片劑、抗小鼠Cleaved cap3(Ccap3)/Cyt C/BAK抗體(上海碧云天生物技術(shù)公司)；DMSO溶液、Hoechst 33258、Ⅳ型膠原酶、DNA酶Ⅰ、pyromellitic acid及ionomycin(Sigma公司)；抗小鼠CD3、CD4 及C3(Santa Cruz)；抗小鼠Ly-6G、F4/80(Abacm)；HRP標(biāo)記二抗、DAB(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；Cell MeterTMApoptosis Assay Kit(ATT Bioquest?, Sunnyvale, CA, USA)；TruStain fcX antibody、熒光標(biāo)記抗小鼠CD45、Gr-1、CD3及CD4(BioLegend)；抗小鼠Ki67、Brefeldin A、Fixation-Permeabilization kit及APC-IFN-γ(eBioscience)；1640 完全培養(yǎng)基(Hyclone)。

1.3銀屑病模型建立 取8～12周齡雌性C3+/+及C3-/-小鼠各5～6只，實驗前1 d刀片刮除小鼠背部毛發(fā)備皮(大小約為2.0 cm× 3.0 cm)，實驗組(IMQ組)用50 mg 5%咪喹莫特乳膏均勻涂抹小鼠背部皮膚，1次/d,連續(xù)5 d，對照組(Control組)用凡士林乳膏涂抹背部皮膚相同次數(shù)。凋亡阻斷實驗中，在IMQ 涂藥前2 h C3-/-小鼠腹腔注射Z-VAD-FMK(10 mg/kg)或者等體積10% DMSO溶液，其余方法同前。每次涂藥前及實驗結(jié)束后用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照，根據(jù)臨床銀屑病評分標(biāo)準(zhǔn)雙盲法半定量分析小鼠銀屑病樣皮膚炎癥程度。

1.4組織病理分析 涂藥5次后于第6天，脫頸處死小鼠，收集其背部皮膚組織，4%多聚甲醛固定。石蠟包埋切片(4 μm)，HE染色明確其皮膚組織病理改變。IHC檢測角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤，詳細(xì)方法如下：切片脫蠟水化，檸檬酸緩沖液微波高溫抗原修復(fù)20 min，自然冷卻，3%H2O2孵育20 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA室溫封閉1 h后，加入抗小鼠Ki67(1∶100)、CD3或者CD4(1∶200)、Ly-6G(1∶200)、F4/80(1∶200)、C3(1∶200,)、Ccap3/Cyt C/BAK(1∶100)抗體4 ℃冰箱孵育過夜。次日，PBS溶液洗去未結(jié)合抗體，HRP標(biāo)記二抗(1∶800)室溫孵育1 h，加入新鮮配制DAB溶液顯色2 min左右，蘇木素染液復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡(Olympus, Tokyo)觀察組織中Ki67、CD3/4、Ly-6G及F4/80陽性染色情況。隨機(jī)選擇5～6個高倍鏡視野半定量統(tǒng)計分析切片中上述蛋白陽性染色細(xì)胞數(shù)。

1.5細(xì)胞凋亡檢測 石蠟包埋切片(4 μm)，脫蠟水化，根據(jù)Cell MeterTMApoptosis Assay Kit 提供說明檢測組織細(xì)胞凋亡情況。Hoechst 33258(5 μg/mL)室溫孵育10 min標(biāo)記細(xì)胞核，抗熒光淬滅封片劑封固后于熒光顯微鏡(Leica Microsystems, Germany)下檢測，并用Image J軟件(NIH, Bethesda, MD, USA)對陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行半定量評分。

1.6流式細(xì)胞檢測(FCM) 各組小鼠涂藥5次后于第6天，脫頸處死小鼠，收集其背部皮膚組織及右側(cè)腋窩引流淋巴結(jié)，制備皮膚及淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液用于后續(xù)FCM實驗。步驟如下：眼科剪剪碎背部皮膚組織(1 cm×1 cm)，用含Ⅳ型膠原酶(2 mg/mL)及DNA酶Ⅰ(200 U/mL)的1640培養(yǎng)基37 ℃孵育箱中消化1 h，含5% EDTA的 BSA溶液終止消化。70目篩網(wǎng)過濾2次制備皮膚單細(xì)胞懸液備用。腋窩淋巴結(jié)取出后，取適當(dāng)大小組織團(tuán)塊70目篩網(wǎng)輕柔碾磨過濾制備單細(xì)胞懸液備用。細(xì)胞表面染色：單細(xì)胞懸液(1×106個/mL)，TruStain fcX antibody(2 μL/test)冰上孵育20 min封閉，加入熒光標(biāo)記抗小鼠CD45、Gr-1、CD3及CD4(1 μL/test)冰上避光孵育25 min，流式洗液(含1% FBS的PBS)清洗2次后上機(jī)檢測(BD FACS Canto Ⅱ)或進(jìn)行胞內(nèi)因子染色。胞內(nèi)因子IFN-γ檢測：制備好的皮膚或淋巴細(xì)胞懸液以含50 ng/mL pyromellitic acid, 500 ng/mL ionomycin和3 μg/mL Brefeldin A的1640 完全培養(yǎng)基(含10% FBS, 100 μg/mL streptomycin, 100 U/mL penicillin, 2 μmol/L glutamine, 50 μmol/L β-mercaptoethanol)37 ℃ 刺激4 h。細(xì)胞表面染色后，F(xiàn)ixation-Permeabilization kit固定通透細(xì)胞，加入IFN-γ(1 μL/test)抗體冰上染色25 min。流式洗液清洗2次后上機(jī)檢測(BD FACS Canto Ⅱ)，運(yùn)用Flow Jo軟件分析所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1C3基因缺陷明顯加重IMQ誘導(dǎo)慢性銀屑病樣皮膚炎癥反應(yīng) IMQ可誘導(dǎo)C3+/+小鼠出現(xiàn)銀屑病皮炎典型表現(xiàn)，如鱗屑、紅斑及皮膚增厚；與C3+/+組相比，C3-/-組小鼠銀屑病皮損表型明顯加重，如鱗屑及皮膚增厚(圖1a～1b)。HE染色及半定量統(tǒng)計分析表明，C3基因缺陷顯著增強(qiáng)IMQ刺激后銀屑病典型病理改變，如角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖、微膿腫及角化不全等(圖1c～1d)。與上述結(jié)果相似，IHC染色發(fā)現(xiàn)C3-/-組角質(zhì)形成細(xì)胞增殖(Ki67陽性細(xì)胞，圖1e)較C3+/+組明顯增多。上述結(jié)果表明：補(bǔ)體C3缺陷顯著加重IMQ誘導(dǎo)銀屑病皮炎病理過程。

2.2C3抑制IMQ誘導(dǎo)銀屑病皮損局部炎癥細(xì)胞浸潤 與C3+/+組相比，C3-/-組銀屑病皮損局部的CD3/4+T細(xì)胞、Ly-6G+中性粒細(xì)胞及F4/80+巨噬細(xì)胞(圖2a)浸潤均顯著增多；運(yùn)用FCM方法檢測到C3-/-組銀屑病皮損組織CD45+白細(xì)胞以及Gr-1+CD45+中性粒細(xì)胞的百分率均顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2b)。上述研究結(jié)果提示：補(bǔ)體C3抑制IMQ誘導(dǎo)銀屑病皮炎局部炎癥細(xì)胞浸潤。

Note:*P<0.05， **P<0.01.Representative IHC staining for inflammatory cells(CD3/4, Ly-6G and F4/80) and semi-quantification graphs were presented (×200);Representative flow plots and graphs of infiltrated CD45+ leukocytes and Gr-1+CD45+ neutrophils were presented圖2 C3基因缺陷顯著增加IMQ誘導(dǎo)皮膚炎癥細(xì)胞浸潤Fig.2 C3-deficiency remarkably increased IMQ-induced inflammatory cells infiltration

2.3C3基因敲除促進(jìn)IMQ誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞凋亡 與C3+/+組相比，C3-/-組凋亡蛋白Cleaved casp3、Cyt C及BAK表達(dá)顯著上調(diào)(圖3a)；C3-/-組TUNEL陽性凋亡細(xì)胞較C3+/+組增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3b)。上述研究結(jié)果表明：補(bǔ)體C3缺陷促進(jìn)IMQ誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞凋亡。

2.4C3基因缺陷增強(qiáng)IMQ誘導(dǎo)IFN-γ應(yīng)答 IMQ刺激可誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌大量IFN-γ，且其主要來源細(xì)胞為CD8+CD3+T細(xì)胞(圖4a)；與C3+/+組相比，C3-/-組淋巴結(jié)細(xì)胞中IFN-γ+CD3+T及IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻率顯著增加，而兩組IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比例無明顯差異(圖4b～4d)。上述研究結(jié)果提示：補(bǔ)體C3缺陷促進(jìn)IMQ誘導(dǎo)IFN-γ應(yīng)答。

Note:**P<0.01, ns indicated no significance. Representative flow plots showed that CD4-CD3+CD8+T cells were the main source of IFN-γ;～Representative flow plots and graphs of IFN-γ+ T cell responses圖4 C3基因缺陷明顯上調(diào)IFN-γ應(yīng)答Fig.4 C3 loss enhanced IFN-γ responses

2.5Z-VAD-FMK抑制凋亡顯著緩解IMQ誘導(dǎo)C3缺陷小鼠銀屑病皮炎反應(yīng) 為明確銀屑病皮炎是否依賴于IMQ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在C3-/-小鼠(C57B6/L背景)體內(nèi)給予凋亡抑制劑Z-VAD-FMK并建立銀屑病模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，Z-VAD-FMK組小鼠銀屑病皮損明顯衰減，如鱗屑及紅斑(圖5a～5b)。HE染色表明Z-VAD-FMK減輕銀屑病典型病理改變，如角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖、微膿腫及角化不全等(圖5c)。同時，IHC染色發(fā)現(xiàn)阻斷凋亡后角質(zhì)形成細(xì)胞增殖(Ki67，圖5c)明顯減少。Z-VAD-FMK組皮損局部CD3+T細(xì)胞浸潤明顯減少(圖5d)。此外，Z-VAD-FMK組TUNEL陽性凋亡細(xì)胞較對照組減少(圖5e)。上述結(jié)果表明：Z-VAD-FMK抑制凋亡顯著緩解IMQ誘導(dǎo)C3缺陷小鼠銀屑病皮炎反應(yīng)。

Note:*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.Psoriatic skin lesion phenotype(2 representative mice for each group);The mPASI scores for each group;Light microscopy examination of skin sections stained with HE(top, ×200) and IHC staining for Ki67(bottom, ×400);Representative images and graphs of IHC staining for CD3;Skin sections were subjected to TUNEL(red) and stained with the nuclear dye Hoechst 33258(blue) (×400)圖5 抑制凋亡顯著緩解IMQ誘導(dǎo)C3小鼠銀屑病樣皮炎反應(yīng)Fig.5 Apoptosis inhibition attenuated IMQ induced psoriatic skin lesion in C3 deficient mice

2.6Z-VAD-FMK抑制凋亡明顯衰減IMQ誘導(dǎo)IFN-γ應(yīng)答 與對照組相比，Z-VAD-FMK組淋巴結(jié)細(xì)胞中IFN-γ+CD3+T細(xì)胞及IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻率顯著減低，而兩組IFN-γ+CD4+T比例無明顯差異(圖6)。上述研究結(jié)果提示：Z-VAD-FMK抑制凋亡明顯衰減IMQ誘導(dǎo)IFN-γ應(yīng)答。

Note:*P<0.05， ns indicated no significant.圖6a～6b 抑制凋亡顯著減弱IMQ誘導(dǎo)IFN-γ反應(yīng)Fig.6a～6b Apoptosis blocking attenuated IMQ induced IFN-γ expression

3 討論

銀屑病病理過程中補(bǔ)體系統(tǒng)激活已早有報道，然而補(bǔ)體C3在該過程中的作用及機(jī)制尚不完全明確[12]。本研究利用IMQ誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎模型，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體C3缺陷明顯加重IMQ誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎，表現(xiàn)為：角質(zhì)形成細(xì)胞增生、微膿腫、棘皮癥及炎癥細(xì)胞浸潤等顯著增加，角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖(Ki67)，T細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加，凋亡相關(guān)蛋白(Cleaved casp3、Cyt C及BAK)表達(dá)顯著上調(diào)，TUNEL陽性凋亡細(xì)胞明顯增加。此外，F(xiàn)CM檢測發(fā)現(xiàn)C3-/-小鼠皮損局部白細(xì)胞(CD45)及中性粒細(xì)胞(Gr-1)浸潤較C3+/+組顯著增加；C3-/-小鼠腋窩引流淋巴結(jié)IFN-γ應(yīng)答明顯增強(qiáng)。與之相反，Z-VAD-FMK阻斷凋亡途徑后C3-/-小鼠皮炎明顯減輕，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖減弱，TUNEL陽性細(xì)胞減少，CD3+T細(xì)胞浸潤減少，IFN-γ應(yīng)答明顯減弱。上述結(jié)果表明：補(bǔ)體C3可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,抑制IMQ誘導(dǎo)銀屑病樣皮膚炎癥反應(yīng)。

補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)樞紐分子，在調(diào)節(jié)天然免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)多種疾病進(jìn)展，如病毒及寄生蟲感染，移植排斥反應(yīng)及自身免疫病等[13]。角質(zhì)形成細(xì)胞組成性表達(dá)C3分子，皮炎過程中C3表達(dá)顯著上調(diào)，表明C3在調(diào)節(jié)皮膚免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[14]。研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體C3缺陷加速接觸性皮炎程度，且上調(diào)炎癥因子IL-12及IFN-γ表達(dá)，表明C3抑制接觸性皮炎；補(bǔ)體C3促進(jìn)流感病毒A及其他細(xì)胞內(nèi)病原體清除，緩解疾病進(jìn)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體C3缺陷顯著增強(qiáng)IMQ誘導(dǎo)銀屑病皮炎，且伴隨角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生，炎癥細(xì)胞浸潤增加，細(xì)胞凋亡增多及IFN-γ表達(dá)上調(diào)。與之相反的是，有研究[5]發(fā)現(xiàn)，利用小干擾RNA下調(diào)C3可顯著緩解角質(zhì)形成細(xì)胞Jun基因敲除導(dǎo)致銀屑病皮炎程度。此外，IMQ可上調(diào)BALB/c小鼠耳部皮膚C3表達(dá)，而C3缺陷緩解IMQ誘導(dǎo)銀屑病病情[17]。上述研究結(jié)果差異可能與銀屑病模型、IMQ用量、組織特異性及小鼠背景差異等因素有關(guān)，其具體原因尚有待進(jìn)一步研究明確。

IMQ促進(jìn)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)銀屑病皮膚炎癥反應(yīng)，而補(bǔ)體C3調(diào)節(jié)凋亡細(xì)胞清除[8, 11]。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)C3基因敲除后IMQ誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)顯著增強(qiáng)。據(jù)此推測，凋亡細(xì)胞清除障礙導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增強(qiáng)可能是C3敲除后銀屑病皮炎加重的重要原因。為驗證該推測，本研究利用凋亡抑制劑阻斷IMQ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，C3敲除小鼠銀屑病病情明顯減輕，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖減弱，TUNEL陽性細(xì)胞減少，T細(xì)胞浸潤及IFN-γ應(yīng)答明顯減弱。因此，筆者認(rèn)為C3缺乏致凋亡細(xì)胞清除障礙及炎癥反應(yīng)激活是介導(dǎo)IMQ誘導(dǎo)銀屑病病理過程的重要原因。

綜上所述，本研究利用IMQ誘導(dǎo)銀屑病皮炎模型發(fā)現(xiàn)：補(bǔ)體C3缺陷后銀屑病皮損明顯加重，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖加強(qiáng)，炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞凋亡及IFN-γ應(yīng)答明顯增強(qiáng)；與之相反，阻斷凋亡途徑后C3敲除小鼠上述指標(biāo)明顯減弱，表明補(bǔ)體C3可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡抑制IMQ誘導(dǎo)銀屑病樣皮膚炎癥反應(yīng)。本研究揭示了補(bǔ)體C3在調(diào)節(jié)IMQ誘導(dǎo)銀屑病皮炎病理過程中的重要作用，增加了對補(bǔ)體系統(tǒng)在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的認(rèn)識，可為銀屑病治療提供新的策略。

本研究尚存在以下不足之處：①銀屑病是一種極易復(fù)發(fā)的慢性炎癥性疾病，本研究中探討了補(bǔ)體C3在IMQ誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎急性期的重要作用及可能機(jī)制，而C3在銀屑病慢性化病理生理過程中的重要作用及機(jī)制尚不清楚，值得進(jìn)一步探討；②角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚組織補(bǔ)體C3的重要來源，特異性敲除角質(zhì)形成細(xì)胞補(bǔ)體C3后IMQ誘導(dǎo)銀屑病樣皮膚炎癥反應(yīng)情況有待后期實驗探討。