三種昆蟲病原線蟲非生物脅迫耐受特性及其共生菌抑菌作用

陳 澄,侯新強,詹發(fā)強, ,楊 蓉,包慧芳,王 寧,史應武,龍宣杞

(1.新疆大學生命科學與技術學院,烏魯木齊 830046;2.新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】昆蟲病原線蟲具有對人畜環(huán)境無害、殺蟲范圍廣、可主動搜尋寄主等特征,能夠感染和殺死土棲性和鉆蛀類害蟲,具有較好的防效,是一種良好的生物殺蟲劑[1-3]。昆蟲病原線蟲及其共生菌協同作用于害蟲,導致害蟲種群迅速死亡,這種快速的死亡率在所有昆蟲目的一系列宿主中都能觀察到[4],使其成為開發(fā)有效生防劑的最合適的候選者?！厩叭搜芯窟M展】昆蟲病原線蟲是一種專性寄生昆蟲并且體內攜帶有共生細菌的體型微小的線蟲[5-6],包括斯氏線蟲屬(Steinernema)和異小桿線蟲屬(Heterorhabditis)兩類,分別與嗜線蟲致病桿菌屬(Xnowhabdus)和發(fā)光桿菌屬(Photorhabdus)細菌有互惠互利的關系,它們通常被稱為線蟲-細菌復合體[7]。Glazer[8]、Liu 等[9]對嗜菌異小桿線蟲(Heterorhabditisbacteriophora)進行了耐干燥能力和生理生化機制的研究,Chung 等[10]對其進行了致病力和繁殖力受侵染溫度及劑量影響的報道,Dutky[11]觀察到共生菌具有廣譜性抗菌能力。已經報道的共生菌對多種植物病原菌以及人的病原菌具有一定的抑制作用,不同種共生菌所具有的抑菌活性有所差異,楊秀芬等[12]對嗜線蟲致病桿菌代謝物對病原菌的抑制作用及穩(wěn)定性進行了研究,嗜線蟲致病桿菌對病原菌具有較好的抑制作用?！颈狙芯壳腥朦c】土壤中的各種非生物(即溫度、水分、土壤質地、土壤鹽度、紫外線、氧氣和pH)和生物(即天敵、雜食性動物、食腐動物、競爭對手和植物)因素都會影響侵染期線蟲的生存[13]。昆蟲病原線蟲具有一定的寄主特異性,所以不同種、不同品系會對同一寄主昆蟲產生不同的防治效果,相同的種或品系對不同的寄主昆蟲防效也不相同[14]。土壤的溫度和鹽濃度影響線蟲的生長、發(fā)育和繁殖,存活和侵染能力[15],同時會影響共生菌的增殖[16]。昆蟲病原線蟲通常在0～40℃溫度下均能生存,不過很少能在40℃存活較長時間,但不同種或不同品系的線蟲對溫度耐受力不同。新疆土壤溫度高、濕度低和鹽分大,篩選抗逆性較好的線蟲種或品系成為新疆本土生物防治害蟲的關鍵?！緮M解決的關鍵問題】利用新疆本土昆蟲病原線蟲資源研究非生物脅迫耐受特性,測定其繁殖能力、耐熱性和耐鹽度,以期得到一株繁殖能力和抗逆性較強、殺蟲活力高的昆蟲病原線蟲,并分析其共生細菌對相關病原微生物的拮抗作用,為拮抗病原微生物提供更多新型拮抗菌資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試線蟲

昆蟲病原線蟲小卷蛾斯氏線蟲(Steinernemacarpocapsae):All、XJ-94,夜蛾斯氏線蟲(Steinernemafeltiae):XJ-39、40-4,海濱斯氏線蟲(Steinernemalitorale):XJ-62、B-13均由新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所農用微生物研究室作物有益微生物團隊分離和保存。

最可惱的一次，是一位名叫宋歌生的師兄，他領著出恭牌去小解，發(fā)現臨空架在水潭之上的茅廁，坑位之前有一棵楠竹根部油光水滑，他問過其他幾位男弟子，明白這是顏師父出恭的時候，會一邊抱著竹子格物致知，思考懸垂露成豎的法門，一邊五谷輪回方便如斯，宋師兄伙同曲風、劉歆二人，悄悄將那棵竹子的根部用小刀挖空。

參照Glazer等[20-21]方法測定3種線蟲在35、38和40℃下的高溫耐受性。取新收集的活力為100%的線蟲懸浮液1 mL于2 mL離心管中,濃度為100 IJS/mL,用封口膜封住后置于不同溫度的水浴鍋中,處理1、2、3、4、5、6 h,每個處理3次重復。在設定的時間從試管中吸取100 μL混勻的線蟲懸浮液,轉移至干凈的玻璃培養(yǎng)皿中,加入3 mL無菌水放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中,24 h后記錄不同種線蟲的死亡情況。

大腸桿菌(E.coli),沙門氏菌(Salmonella),金黃色葡萄球菌(S.aureus)由新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所農用微生物研究室作物有益微生物團隊保存。

曾先生在車上要求警察將他們送到安全的地方。當地時間凌晨2點半左右，曾先生三人被帶到“林地公墓”附近。曾先生向環(huán)環(huán)形容稱，“當時周圍一片漆黑，打開地圖一看是片墓地。我認為這對于中國老人而言是一種侮辱，是警察在捉弄我們。”

研究表明,在不同時間下各劑量線蟲對大蠟螟幼蟲的致病力不同,隨著線蟲劑量的增加,大蠟螟幼蟲的校正死亡率上升。侵染時間為24 h時,不同劑量線蟲對大蠟螟的校正死亡率均低于10%;36 h時,校正死亡率顯著升高(P<0.05),線蟲劑量200 IJs/larva對大蠟螟的校正死亡率達到86.67%;48 h時,線蟲劑量為160和200 IJs/larva的校正死亡率達到100%,較低線蟲劑量20 IJs/larva下,大蠟螟的校正死亡率也達到了73.33%,小卷蛾斯氏線蟲XJ-94的致病力較強。圖3

1.1.3 供試昆蟲

我國可溶巖分布達1/3以上國土面積，有22個省份有分布，其中以桂、黔、湘、贛、川、滇、鄂等省區(qū)最為發(fā)育。巖溶塌陷不僅造成工業(yè)與民用建筑毀壞，破壞交通和水利水電設施，還造成巖溶區(qū)嚴重的地質環(huán)境惡化。基于此，國內一些學者對巖溶塌陷形成條件和成因機理進行了深入研究，取得了豐碩成果 [1～6]。福建省巖溶塌陷主要集中發(fā)生于閩西南山間盆地覆蓋性巖溶區(qū)(龍巖新羅區(qū)、永安大湖、連城北團、三明市區(qū)等)[7,8]。本文所述巖溶塌陷位于三明市大田縣境內覆蓋性巖溶區(qū)。在調查、勘查的基礎上，對區(qū)內巖溶塌陷特征和成因進行了總結和分析。

大蠟螟5齡幼蟲(Galleriamellonella)由新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所農用微生物研究室作物有益微生物團隊人工培養(yǎng)。

傍晚時沿著城墻根散步，我們似乎感受到了歷史的擠壓和古老文明所具有的源源活力。而從幽暗高大的城門洞穿過，則是一種更為奇特的體驗——仿佛從這里便可徑直走進秦時明月漢時關。

1.1.4 供試培養(yǎng)基

鑒別培養(yǎng)基(NBTA):氯化鈉5 g,蛋白胨10 g,牛肉膏5 g,瓊脂粉15 g,溴百里酚藍0.025 g,氯化三苯基四氮唑0.04 g,蒸餾水1 000 mL,pH(7±0.2),NA固體和NB液體培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2.2 線蟲的耐熱性測定

1.2.1 線蟲的分離及擴繁能力測定

取新收集的活力為100%的線蟲懸浮液1 mL于2 mL離心管中,濃度為100 IJS/mL,測定在不同鹽濃度(5%NaCl、9%NaCl、13%NaCl、17%NaCl)下的耐鹽性。放置在25℃室溫下,處理1、2、3、4 h,每個處理3次重復。在設定的時間段觀察死亡情況,計算死亡率。

1.2 方 法

1.1.2 病原菌

1.2.3 線蟲的耐鹽性測定

采用改良的White trap法[17],以100條/蟲的線蟲劑量侵染大蠟螟5齡幼蟲[18],對侵染致死的大蠟螟幼蟲進行稱重,平均每條幼蟲質量為0.4 g。在直徑15 cm的培養(yǎng)皿中倒置一直徑為9 cm的小培養(yǎng)皿,加入20 mL含適量0.1%甲醛溶液的去離子水,在小培養(yǎng)皿上鋪兩層滅菌濾紙,將5只侵染致死的大蠟螟幼蟲置于其上,重復3組,室溫25℃放置約14 d。待侵染期線蟲從死亡的大蠟螟體內鉆出進入水中后,將含有線蟲的水溶液轉移至燒杯中,反復換水,靜置沉淀收集。待線蟲收集完畢,采用稀釋法記錄線蟲總數量,計算出每條大蠟螟幼蟲產出侵染期線蟲的數量(IJs/larva)和每克大蠟螟幼蟲產出侵染期線蟲的數量(IJs/g)[19]。

1.2.4 不同線蟲劑量對大蠟螟幼蟲致病力測定

以篩選出的抗逆性較好的線蟲品系為實驗對象,配制5個不同濃度的線蟲懸液:100、300、500、800和1 000 IJS/mL;每個濃度為1個處理,每處理重復3次,將各濃度線蟲懸液用移液槍取2 mL均勻加入到墊有雙層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿內,對照組為等量無菌水,每皿放大蠟螟幼蟲10頭(平均0.4 g/larva),置于人工氣候箱(25℃,RH50%,無光照),每12 h觀察1次并記錄死亡情況。

1.2.5 昆蟲病原線蟲共生菌的分離

將線蟲侵染致死的大蠟螟幼蟲放置于超凈臺內,在75%的酒精中消毒10 s,用無菌濾紙吸去表面殘留酒精,用無菌剪刀剪去一對腹足頂端,用接種環(huán)蘸取血淋巴液后劃線于NBTA培養(yǎng)基平板上,28℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)2～3 d,挑取藍綠色單菌落再次劃線于NBTA平板上進行純化。

1.2.6 共生菌發(fā)酵液及上清液的制備

在NBTA培養(yǎng)基上挑取藍色的I型菌接入100 mL含有NB培養(yǎng)液的三角瓶中,于180 r/min,28℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)24 h,得到種子液。將種子液以1%的接菌量轉接于NB培養(yǎng)基中,于180 r/min,28℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)48 h,得到發(fā)酵液。將制備好的共生菌培養(yǎng)液在12、24、36、48、60、72 h各取樣3 mL,經4℃,10 000 r/min離心10 min,得到共生菌上清液,置于4℃冰箱中保存。

1.2.7 共生菌拮抗病原菌實驗

將共生菌接種到NB培養(yǎng)液體搖瓶中,共生細菌培養(yǎng)分時段取樣,在12、24、36、48 、60、72 h各取樣3組,每組1.5 mL,10 000 r/min離心5 min,取上清,凍存,備用。取100 μl病原菌懸浮液均勻涂布NA平板,每種病原菌涂布6個NA平板,總共54個NA平板。待涂布的病原菌懸液吸收后,在平板上用0.8 cm打孔器均勻打3個孔,加入200 μL共生菌上清液,放入28℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48 h,觀察并測量抑菌圈直徑。

學生對體育教學評教的有效性是教學評價中最為核心和關鍵的一項內容，在完善學生評教內容上，要同時強化體育教師和學生的思想意識，要明確進行教學評教的目的是為了對體育教學進行改進，尤其是學生要在評教中具有主人翁的權利意識，要意識到真實表達評價是行使權力的表現。完善評價內容還包括評教方法的豐富和多元化，由于高校體育教學具有特殊性，在評教上也要結合其特點，進行評價標準和項目的特殊設置，要結合體育教學發(fā)展的需求來收集相關的信息。

1.3 數據處理

應用origin 2021和SPSS 20.0進行數據處理統計和方差分析。利用SPSS 20.0軟件中LSD和Duncan’s多重比較法進行差異顯著性測定,P<0.05。

2 結果與分析

2.1 線蟲數量測定

研究表明,被侵染的昆蟲體內分離出來的線蟲中小卷蛾斯氏線蟲(All)和(XJ-94)數量明顯多于其它種類的線蟲。每條大蠟螟體內產出的線蟲數量分別為5.24×104、4.96×104IJs/larva,平均每克大蠟螟幼蟲產出線蟲數量分別為1.31×104、1.24×104IJs/g。表1