刺梨提取物抗炎活性及對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的治療作用

王 麗 李立郎 李齊激 王 瑜 楊小生

(1.省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種常見的原因不明的慢性結(jié)腸炎癥，為消化內(nèi)科常見病，臨床上主要以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為特征，反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者身心健康。近年來，UC 在全球的患病率呈持續(xù)上升的趨勢，發(fā)病高峰在20～40歲，老年人是另一個(gè)發(fā)病高峰，但稍低于青年人群，世界范圍內(nèi)的UC患病率估計(jì)在5～500人/10萬人[1]。目前治療UC主要以5-氨基水楊酸類藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主，這些藥物普遍存在副作用大、復(fù)發(fā)率高且價(jià)格昂貴等特點(diǎn)[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，用中藥治療UC不僅能夠長期緩解癥狀，還可以減少復(fù)發(fā)，且療效顯著，能明顯提高患者的生活質(zhì)量。

刺梨為薔薇科薔薇屬植物刺梨RosaroxburghiiTratt.(Cili)的果實(shí)，主要分布于中國貴州、云南、湖南等省份，尤其在貴州省呈大規(guī)模人工種植。《中華本草》[4]中記載刺梨具有健胃、消食、止瀉之功效，主治食積飽脹、腸炎腹瀉。刺梨富含維生素C、超氧化歧化酶(SOD)、多糖及三萜類化合物等多種活性成分，針對刺梨的藥理活性，目前有抗氧化、抗癌、防治糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用的研究報(bào)道[5-6]，尚未見關(guān)于刺梨的抗炎活性及對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用的研究報(bào)道。

Keap1-Nrf2-ARE信號通路是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激損傷的最重要機(jī)制之一，與氧化應(yīng)激相關(guān)的多種疾病(如炎癥、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心血管系統(tǒng)疾病和代謝等疾病)都有相關(guān)性，已成為這些疾病預(yù)防和治療的靶點(diǎn)[7-8]。研究擬采用RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞炎癥模型評價(jià)刺梨提取物的體外抗炎活性，將刺梨提取物作用于UC小鼠，觀察其治療效果，并初步探討其藥理作用機(jī)制，為UC的臨床治療方案提供試驗(yàn)依據(jù)，闡釋刺梨的健脾、止瀉功效，明確其治療腸炎腹瀉的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠：清潔級，體重(20±2)g，雌雄各半，遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 藥品與試劑

RAW264.7細(xì)胞：功能天然產(chǎn)物與產(chǎn)品開發(fā)中心細(xì)胞庫；

葡聚糖硫酸鈉：分析純，美國MP公司；

地塞米松、脂多糖：分析純，美國Sigma公司；

DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、雙抗：美國GIBCO公司；

NO試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、β-actin抗體：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；

Nrf2單克隆抗體、Keap1單克隆抗體：英國Abcam公司。

1.3 主要設(shè)備

CO2恒溫培養(yǎng)箱：CCL-240B-8型，新加坡藝思高科技有限公司；

倒置熒光顯微鏡：TS2 FL型，尼康映像儀器銷售(中國)有限公司；

細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：Countess Ⅱ型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

酶標(biāo)儀：VICTOR Nivo型，美國PerkinElmer公司；

電泳儀：1645050型，美國BIO-RAD公司；

蛋白成像系統(tǒng)：ChemiScope 3000mini型，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 刺梨提取物的制備 刺梨鮮果于55 ℃烘干，粉碎，過二號篩，按料液比1∶15(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，提取2次，每次提取2 h，合并提取液，過濾，濾液回收乙醇，濃縮至適量，加入10倍量的雙蒸水，回流2次，每次回流1 h，棄去濾液，濾渣真空干燥(濾渣厚度為6 mm，置于-80 ℃預(yù)凍過夜，絕對壓強(qiáng)為20 Pa、隔板溫度40 ℃、冷阱溫度-60 ℃)成粉末，即為刺梨提取物。

1.4.2 MTT法檢測刺梨提取物對RAW264.7細(xì)胞活力的影響 根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]，將對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7以3×104mL-1的密度制成細(xì)胞混懸液并接種于96孔板中，每孔加入90 μL細(xì)胞混懸液，放于(37 ℃，5% CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。給藥組給予不同濃度的刺梨提取物溶液，每孔10 μL，空白組加入同體積的培養(yǎng)基，每組濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)18 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，將上清液吸出，每孔加入160 μL DMSO溶解甲臜沉淀，避光條件下振搖10 min使甲臜完全溶解后置于酶標(biāo)儀490 nm下檢測每個(gè)孔的OD值。重復(fù)試驗(yàn)3次。按式(1)計(jì)算細(xì)胞活力：

(1)

式中：

Cv——細(xì)胞活力，%；

A1——給藥組的吸光度值；

A2——對照組的吸光度值。

1.4.3 刺梨提取物對RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

根據(jù)文獻(xiàn)[10-11]，將對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7以2×105mL-1的密度制成細(xì)胞混懸液并接種于96孔板中，每孔加入80 μL細(xì)胞混懸液，放于(37 ℃，5% CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。每孔加入10 μL含有不同濃度的刺梨提取物或者Dex溶液，LPS組及空白對照組均加入等體積的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。1 h后每孔加入10 μL LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)，空白組加入等體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18 h后，按試劑盒說明書收集細(xì)胞上清采用Griess法進(jìn)行NO含量測定。

1.4.4 刺梨提取物對UC的影響 小鼠50只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、刺梨提取物低、中、高劑量組(50，100，200 mg/kg)。空白組飲用蒸餾水除外，其余各組試驗(yàn)小鼠自由飲用3% DSS溶液7 d，以誘導(dǎo)試驗(yàn)性UC模型。試驗(yàn)期間仔細(xì)觀察記錄小鼠的一般狀態(tài)、大便性狀及隱血情況，并對各組小鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評分，評分標(biāo)準(zhǔn)[12-13]見表1，按式(2)計(jì)算出各組小鼠的DAI得分情況。

表1 DAI 評分標(biāo)準(zhǔn)表?

DAI=S1+S2+S3，

(2)

式中：

DAI——疾病活動(dòng)指數(shù)；

S1——小鼠體重下降評分；

S2——小鼠大便性狀評分；

S3——小鼠大便隱血評分。

試驗(yàn)第8天脫頸椎處死小鼠，分離出小鼠脾臟并稱重，游離并截取全段結(jié)腸，去除腸內(nèi)容物，冰冷生理鹽水漂洗，濾紙輕輕吸干后稱濕重，測量結(jié)腸長度。距肛門2 cm 處剪取1 cm長結(jié)腸組織樣本，采用福爾馬林溶液進(jìn)行固定，石蠟包埋，切片，HE染色，并采用免疫組化檢測結(jié)腸組織中Nrf2及Keap1蛋白的表達(dá)。剩余結(jié)腸置于-80 ℃冰箱中保存，用來進(jìn)行Western blot試驗(yàn)。

1.4.5 Western blot檢測結(jié)腸組織中Keap1及Nrf2的表達(dá) 剪取小鼠結(jié)腸組織約80 mg，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后剪碎并加入RIPA裂解液500 μL，勻漿機(jī)研磨提取蛋白，經(jīng)BCA定量蛋白濃度后，電泳，蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，TBST 洗滌3遍，每遍10 min，5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，Keap1及Nrf2抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3遍，每遍10 min，加入二抗(1∶30 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3遍，每遍10 min，滴加ECL后避光進(jìn)行化學(xué)曝光，顯影并掃描分析，對目的條帶做灰度分析，以目的蛋白的灰度值比內(nèi)參β-actin 的灰度值校正誤差，比較蛋白表達(dá)情況[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨提取物對RAW264.7細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，刺梨提取物質(zhì)量濃度達(dá)到20 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出了細(xì)胞毒性(P<0.05)，當(dāng)質(zhì)量濃度≤10 μg/mL時(shí)對細(xì)胞存活率無顯著影響(P>0.05)。因此，在后續(xù)的細(xì)胞試驗(yàn)中選用刺梨提取物的最高質(zhì)量濃度為10 μg/mL。

與空白組相比，* P<0.05

2.2 刺梨提取物對RAW264.7細(xì)胞NO釋放的影響

不同質(zhì)量濃度的刺梨提取物(2.5～10.0 μg/mL)和LPS(1.0 μg/mL)共同作用于RAW264.7細(xì)胞18 h 后，采用Griess法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NO的含量。結(jié)果如圖2所示，空白對照組的NO含量微少，LPS組用LPS處理后NO含量較空白組顯著增加(P<0.001)，表明造模成功，陽性對照藥Dex顯著降低NO的釋放(P<0.001)。

與空白組相比，### P<0.001；與模型組相比，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001

不同濃度刺梨提取物可不同程度地逆轉(zhuǎn)由LPS誘導(dǎo)的NO釋放量增加，且呈劑量依賴關(guān)系。

2.3 對試驗(yàn)性小鼠UC的影響

2.3.1 一般狀態(tài)觀察及DAI評分 空白對照組小鼠在整個(gè)試驗(yàn)過程中均保持精神狀態(tài)良好，日常進(jìn)食量正常，毛發(fā)光澤，活躍，大便正常。模型組小鼠日常進(jìn)食量減少，明顯消瘦，出現(xiàn)拱背、活動(dòng)減少、大便性狀改變等現(xiàn)象，造模第3天開始大部分小鼠出現(xiàn)不同程度的黏液便或血便等大便異?，F(xiàn)象，DAI評分逐日增高，于第3天起顯著高于空白對照組。刺梨提取物各組小鼠一般狀態(tài)良好，大便異常情況出現(xiàn)晚于模型組，刺梨提取物100 mg/kg組在第3，5，7天的DIA評分明顯低于模型組，刺梨提取物200 mg/kg組在第5，7天的DIA評分明顯低于模型組，結(jié)果見表2。

表2 刺梨提取物對試驗(yàn)性UC小鼠DIA評分和體重的影響?

2.3.2 小鼠體重、結(jié)腸長度、結(jié)腸濕重指數(shù)及脾臟重量的測定 小鼠攝入DSS后會(huì)導(dǎo)致其免疫力下降、結(jié)腸出現(xiàn)水腫等情況，具體表現(xiàn)為小鼠體重下降、結(jié)腸長度縮短、結(jié)腸濕重指數(shù)升高、脾臟重量升高。與空白組相比，模型組小鼠在造模第3天出現(xiàn)不同程度的腹瀉、血便等情況，體重減輕的情況在第4～5天表現(xiàn)得尤為明顯。100 mg/kg組小鼠在第4天出現(xiàn)體重減輕的情況，而在第5天后體重有所回升并在之后超過模型組，除50 mg/kg組小鼠第7天外，其余各組小鼠的體重均大于模型組，見圖3(a)。與空白組小鼠相比，模型組小鼠的結(jié)腸變短，差異極顯著(P<0.001)，而刺梨提取物100 mg/kg和200 mg/kg劑量組小鼠結(jié)腸均較模型組長(P<0.05或P<0.01)，見圖3(b)。與空白組小鼠相比，模型組小鼠的結(jié)腸濕重指數(shù)升高，差異顯著(P<0.05)，而刺梨提取物各組小鼠結(jié)腸濕重指數(shù)較模型組均降低，其中100 mg/kg和200 mg/kg劑量組小鼠結(jié)腸濕重指數(shù)較模型組比具有顯著性差異(P<0.01或P<0.001)，見圖3(c)。與空白組小鼠相比，模型組小鼠的脾臟重量升高，差異顯著(P<0.01)，刺梨提取物100 mg/kg和200 mg/kg劑量組小鼠脾臟重量較模型組降低，其中100 mg/kg組與模型組相比差異顯著(P<0.05)，見圖3(d)。

與空白組相比，# P<0.05，## P<0.01，### P<0.001；與模型組相比，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001

2.3.3 結(jié)腸黏膜病理學(xué)觀察 如圖4所示，結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色后，通過顯微鏡觀察小鼠結(jié)腸組織病理切片，發(fā)現(xiàn)正常組小鼠結(jié)腸的結(jié)構(gòu)完整，紋路清晰；模型組小鼠結(jié)腸黏膜層炎性細(xì)胞浸潤、隱窩結(jié)構(gòu)紊亂或消失、杯狀細(xì)胞大量丟失等，提示UC模型造模成功。刺梨提取物各組小鼠結(jié)腸黏膜相對完整，少數(shù)可見淺潰瘍，大部分上皮細(xì)胞和隱窩結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，少量炎癥細(xì)胞浸潤，未見基底淋巴細(xì)胞聚集。刺梨提取物各劑量組對UC小鼠腸道黏膜層顯示出了較好的保護(hù)和修復(fù)作用，能降低炎癥的嚴(yán)重程度和范圍，改善結(jié)腸炎癥程度，起到黏膜保護(hù)作用。

圖4 刺梨提取物對各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化的影響

2.3.4 刺梨提取物對小鼠結(jié)腸組織中Keap1及Nrf2蛋白表達(dá)的影響 如圖5所示，模型組與空白組相比，結(jié)腸組織中Keap1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，給予不同劑量刺梨提取物后結(jié)腸組織中Keap1的表達(dá)水平顯著或極顯著下調(diào)(P<0.01或P<0.001)；與空白組相比，模型組結(jié)腸組織中Nrf2的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，給予刺梨提取物100 mg/kg 和200 mg/kg能上調(diào)Nrf2的表達(dá)水平，其中200 mg/kg 組與模型組相比差異顯著(P<0.01)。

與空白組相比，## P<0.01；與模型組相比，** P<0.01，*** P<0.001

2.3.5 刺梨提取物對小鼠結(jié)腸組織中Keap1及Nrf2蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，模型組小鼠結(jié)腸組織中Keap1的表達(dá)與空白組相比明顯增加，刺梨提取物各組與模型組比較Keap1表達(dá)均有所減少，呈劑量依賴關(guān)系?？瞻捉M及模型組小鼠結(jié)腸中Nrf2的表達(dá)較少，刺梨提取物各組Nrf2的表達(dá)明顯增加，且Nrf2的表達(dá)呈劑量依賴關(guān)系。

圖6 刺梨提取物對小鼠結(jié)腸組織中Keap1及Nrf2蛋白表達(dá)的影響

3 結(jié)論

刺梨提取物能降低由脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的釋放增加，且呈劑量依賴關(guān)系，表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗炎活性。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)刺梨提取物對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎具有較好的預(yù)防作用，主要體現(xiàn)在能夠逆轉(zhuǎn)由葡聚糖硫酸鈉所引起的體重降低、結(jié)腸長度縮短、結(jié)腸濕重指數(shù)增加、脾臟指數(shù)及疾病活動(dòng)指數(shù)增加；HE染色結(jié)果顯示，刺梨提取物各組炎性細(xì)胞浸潤、隱窩破壞程度均降低，提示刺梨提取物能降低炎癥的嚴(yán)重程度和范圍，對潰瘍性結(jié)腸炎臨床癥狀和腸道黏膜層顯示出了較好的保護(hù)和修復(fù)作用。刺梨提取物對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用，其可能的機(jī)制為下調(diào)Keap1的表達(dá)水平，上調(diào)Nrf2的表達(dá)水平，其作用可能與Keap1/Nrf2/ARE信號通路有關(guān)。由于刺梨提取物的主要成分為刺梨苷、野薔薇苷、委陵菜酸、野薔薇酸和氧代坡模酸[14]，推測刺梨提取物的抗炎作用及治療潰瘍性結(jié)腸炎可能與以上成分有關(guān)，有待進(jìn)一步深入研究。