釀膿鏈球菌生物學(xué)特性及其檢測(cè)方法應(yīng)用進(jìn)展

劉 爽 姚 粟 李 婷 翟 磊 姚晨之?

1.中國(guó)日用化學(xué)工業(yè)研究院有限公司，山西太原，030001；

2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015

釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）屬于鏈球菌屬，是乙型溶血性鏈球菌的一種，常存在于水、空氣及人的口腔、鼻腔和咽喉。釀膿鏈球菌為兼性厭氧菌，在培養(yǎng)環(huán)境中添加5%二氧化碳有助于其生長(zhǎng)及溶血性。釀膿鏈球菌致病機(jī)制較為復(fù)雜，能引起人的多種疾病，引起的相對(duì)輕微的非侵襲性疾病一般包括咽炎、急性扁桃體炎、急性輸卵管炎[1]、膿包病、猩紅熱；也可能引起侵襲性疾病，如壞死性筋膜炎、菌血癥和鏈球菌中毒休克綜合征；還可以造成嚴(yán)重的非化膿性后遺癥，如風(fēng)濕性心臟病和急性腎小球炎[2-3]。呼吸道飛沫被認(rèn)為是釀膿鏈球菌的主要傳播途徑，同時(shí)，接觸該菌感染引起的潰瘍或者被其污染的材料、器械也可能引起傳播，食源性傳播也有報(bào)道[4]。流行病學(xué)顯示，釀膿鏈球菌感染的常見(jiàn)環(huán)境為醫(yī)院、幼兒園、收容所等人群密集場(chǎng)所，具有時(shí)空聚集性[5]，個(gè)人和手衛(wèi)生不良會(huì)加劇傳播風(fēng)險(xiǎn)[6]，因此加強(qiáng)個(gè)人手部衛(wèi)生和公共環(huán)境消毒來(lái)切斷釀膿鏈球菌的傳播是有效的預(yù)防措施。

對(duì)于釀膿鏈球菌的檢測(cè)，目前最常用的是傳統(tǒng)分離技術(shù)，但其過(guò)程煩瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，較為依賴肉眼觀察結(jié)果，難以應(yīng)對(duì)突發(fā)的公共衛(wèi)生安全事件，也難以滿足相關(guān)食品、用品快速流通的需求。本文對(duì)釀膿鏈球菌生物學(xué)特性及致病機(jī)制進(jìn)行介紹，指出該菌的關(guān)鍵毒力因子，并總結(jié)了目前常見(jiàn)的釀膿鏈球菌檢測(cè)方法，對(duì)尋找新的檢測(cè)靶點(diǎn)，建立更準(zhǔn)確、高效的釀膿鏈球菌快速檢測(cè)方法，進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)釀膿鏈球菌感染的預(yù)防有重要意義。

1 生物學(xué)特性

1.1 形態(tài)特性

釀膿鏈球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體形態(tài)呈圓形或卵圓形，直徑為0.5～1 μm。通常呈鏈狀排列，不形成芽孢，有莢膜，無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。其菌毛具有抗原性，常應(yīng)用于T血清型鑒定[7-8]。

1.2 培養(yǎng)特性

釀膿鏈球菌為兼性厭氧菌，初代培養(yǎng)需要5% CO2的環(huán)境以促進(jìn)生長(zhǎng)。最適生長(zhǎng)溫度為35～37 ℃，生長(zhǎng)的pH為7.4～7.6。對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，通常需要在普通培養(yǎng)基上補(bǔ)充血清、血液、腹水等。在液體培養(yǎng)基中易成長(zhǎng)鏈，于管底呈絮狀或顆粒狀沉淀生長(zhǎng)。在血瓊脂平板上形成灰白色、透明或半透明、表面光滑或略粗糙、邊緣整齊的圓形凸起細(xì)小菌落，菌落周圍形成透明的溶血環(huán)[9]。有研究表明，釀膿鏈球菌的菌落形態(tài)有明顯的M蛋白分型特異性[10]。此外，高濃度還原糖會(huì)抑制溶血[11]。

其液體培養(yǎng)基包括TSB肉湯（tryptic soy broth）、THB肉湯（todd-hewitt broth）和BHI肉湯（brain heart infusion broth）。THB肉湯通常用于釀膿鏈球菌血清學(xué)分型的培養(yǎng)。

1.3 生化特性

釀膿鏈球菌具有葡萄糖、乳糖和蘋(píng)果酸攝取途徑，優(yōu)先使用葡萄糖作為主要能量來(lái)源[12]。不分解尿素，桿菌肽和鏈激酶實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性。過(guò)氧化氫酶活性為陰性。釀膿鏈球菌對(duì)青霉素、氨芐霉素等抗生素敏感。L-吡咯烷酮芳胺酶實(shí)驗(yàn)可將釀膿鏈球菌與無(wú)乳鏈球菌區(qū)分開(kāi)，奧普托欣耐藥實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性可分辨其與肺炎鏈球菌。

1.4 釀膿鏈球菌致病機(jī)制

釀膿鏈球菌主要定植于咽喉和皮膚的黏膜，導(dǎo)致各種形式的非侵入性或侵入性的感染及并發(fā)癥。這些感染涉及呼吸道、皮膚和軟組織以及血液，嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命[13]。因此，了解釀膿鏈球菌的致病機(jī)制以及對(duì)其引起的疾病的監(jiān)督非常重要，有利于為這些疾病的控制和預(yù)防奠定基礎(chǔ)。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示不同菌株之間不僅存在通用的致病機(jī)制，還會(huì)因?yàn)榫哂胁煌z傳背景而具有獨(dú)特的致病機(jī)制。本文對(duì)釀膿鏈球菌的通用致病機(jī)制進(jìn)行概述。

1.4.1 釀膿鏈球菌的黏附定植

人類皮膚是一種不適宜細(xì)菌定植的環(huán)境，包括角質(zhì)層的物理屏障、酸性表面pH值以及天然防御因子（如抗菌肽、蛋白酶、溶菌酶、細(xì)胞因子和趨化因子）的積極合成，這些因子共同用于募集免疫細(xì)胞和啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[14]。為了成功地在皮膚或咽喉中定植或建立感染，釀膿鏈球菌會(huì)依賴某些特異性的黏附因子，使得在定植過(guò)程中與組織上正常的常在菌群競(jìng)爭(zhēng)時(shí)處于有利地位。在皮膚的黏附定植過(guò)程中，皮膚存在的傷口使釀膿鏈球菌更容易克服第一道屏障，同時(shí)釀膿鏈球菌也可以分泌某些毒力因子對(duì)咽喉上皮細(xì)胞或者皮膚上皮細(xì)胞造成直接損傷。研究表明，廣譜半胱氨酸蛋白酶（SpeB）基因廣泛存在于釀膿鏈球菌中，該酶可以降解宿主表面蛋白，破壞組織屏障，方便釀膿鏈球菌入侵宿主并建立感染。此外，有研究認(rèn)為釀膿鏈球菌在不同的環(huán)境下會(huì)表達(dá)不同的黏附素以促進(jìn)其進(jìn)入皮膚深層組織，如介導(dǎo)了釀膿鏈球菌對(duì)上皮細(xì)胞黏附能力60%的脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）。

目前對(duì)釀膿鏈球菌黏附過(guò)程的代表性理論是兩步法模型，即第一步是通過(guò)LTA介導(dǎo)細(xì)菌克服和宿主之間的靜電斥力，這一黏附過(guò)程作用相對(duì)較弱，是可逆性黏附。第二步通過(guò)菌毛、M蛋白或血清混濁因子形成較為穩(wěn)定的、非可逆的黏附。

1.4.2 入侵上皮細(xì)胞

釀膿鏈球菌具有一定的入侵上皮細(xì)胞的能力，主要依賴于M蛋白和纖連蛋白結(jié)合蛋白的表達(dá)。纖連蛋白是一種多結(jié)構(gòu)域糖蛋白，由約250 kDa單體的二聚體組成，存在于人體體液、細(xì)胞表面和各種組織的細(xì)胞外基質(zhì)[15]，釀膿鏈球菌通過(guò)纖連蛋白結(jié)合蛋白與纖連蛋白結(jié)合，并利用纖連蛋白與宿主整合素之間的親和力，此處纖連蛋白的作用類似于釀膿鏈球菌黏附到宿主細(xì)胞的橋梁，進(jìn)而激活包括磷酸肌醇3-激酶和整合素連接激酶等在內(nèi)的信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的重排及形態(tài)變化，并通過(guò)幾種不同的機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)化到宿主細(xì)胞中[16-17]。有研究從無(wú)法根治鏈球菌咽炎的患者扁桃體中發(fā)現(xiàn)侵入細(xì)胞內(nèi)的釀膿鏈球菌，證明了釀膿鏈球菌入侵上皮細(xì)胞的現(xiàn)象[18]。

1.4.3 免疫逃逸

進(jìn)入機(jī)體之后的釀膿鏈球菌還要克服各種不利的體內(nèi)環(huán)境，主要包括宿主的固有免疫應(yīng)答以及感染過(guò)程遇到的各種細(xì)胞。釀膿鏈球菌主要依賴自身多種毒力因子逃避宿主攻擊以便于在新的體內(nèi)環(huán)境存活，這些毒力因子主要包括M蛋白、DNA酶sda 1以及莢膜多糖。

當(dāng)細(xì)菌侵入宿主后，宿主中性粒細(xì)胞會(huì)分泌一種由DNA、組蛋白、顆粒蛋白酶和抗菌肽組成的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular trap，NET），用以清除感染的細(xì)菌。某些釀膿鏈球菌中含有sda1基因，其編碼DNA酶并分泌到細(xì)菌外部降解NET框架，從而使釀膿鏈球菌逃避NET的清除殺傷作用。此外，釀膿鏈球菌表面的M蛋白也可以通過(guò)抑制吞噬細(xì)胞的吞噬作用幫助其免疫逃逸。還有一些強(qiáng)毒力的釀膿鏈球菌表面具有莢膜包裹，莢膜主要由透明質(zhì)酸多糖組成，與宿主結(jié)締組織中的多糖類似，因此可能利用該機(jī)制逃避宿主免疫作用。

1.4.4 細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)

進(jìn)入機(jī)體后，釀膿鏈球菌通過(guò)各種胞外產(chǎn)物和毒素使宿主產(chǎn)生細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。釀膿鏈球菌可以分泌兩種鏈球菌溶血素，分別是鏈球菌溶血素O（streptolysin o，SLO）和鏈球菌溶血素S（streptolysin s，SLS）。SLO是一種依賴膽固醇的溶細(xì)胞素，它通過(guò)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)細(xì)菌免受吞噬性殺傷[19-20]。SLS是一種由9個(gè)連續(xù)基因編碼修飾的多肽性細(xì)胞溶素，除了溶解紅細(xì)胞以外還可以損害多種細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和白細(xì)胞等，在釀膿鏈球菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[21]。

鏈球菌致熱性外毒素家族由speA、speB、speC、speJ、speH和speK基因編碼，屬于超抗原。它們能夠刺激定植生物體的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活性，導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，進(jìn)而使炎癥因子過(guò)度釋放，引起猩紅熱等[22]。speB基因廣泛存在于釀膿鏈球菌中，與侵襲性和非侵襲性感染都有關(guān)系。而在釀膿鏈球菌菌株中檢測(cè)到speA或speJ基因可能與侵襲性感染的潛在發(fā)展有關(guān)，Kittang等[23]證明了這些基因與感染侵襲性之間的關(guān)系，分離出攜帶這些基因的釀膿鏈球菌菌株的患者分別發(fā)生了以下感染：壞死性筋膜炎、中毒休克綜合征、肺炎、腦膜炎和腹膜炎。

2 釀膿鏈球菌的檢測(cè)方法

2.1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

目前我國(guó)食品中釀膿鏈球菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法為GB 4789.11―2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) β型溶血性鏈球菌檢驗(yàn)》，標(biāo)準(zhǔn)中使用前增菌、平板分離、革蘭氏染色鏡檢的方法，并增加了觸酶試驗(yàn)以及生化鑒定。吳福平等[24]利用胰蛋白胨大豆肉湯TSB增菌液、哥倫比亞CNA血平板厭氧培養(yǎng)釀膿鏈球菌，發(fā)現(xiàn)增菌、分離效果優(yōu)于葡萄糖肉浸液肉湯和普通血瓊脂平板，且使用生化鑒定能有效簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，縮短檢測(cè)周期。譙林等[25]采用在血平板中加入10%結(jié)晶紫的方法培養(yǎng)釀膿鏈球菌咽拭子，陽(yáng)性率從2%～8.33%提高至30.7%～40.1%。

2.2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是以免疫酶技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫測(cè)定技術(shù)[26]，其基本原理是先將抗原或抗體與固相載體結(jié)合，當(dāng)加入酶標(biāo)抗體或抗原時(shí)，會(huì)經(jīng)過(guò)反應(yīng)形成酶標(biāo)免疫復(fù)合物，用洗滌液將未反應(yīng)的游離酶標(biāo)抗原抗體洗掉，再加入酶底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，便于進(jìn)行定性定量分析。王萬(wàn)相等[27]建立了ELISA法診斷釀膿鏈球菌，其檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法一致且用時(shí)更短。近年來(lái)，ELISA技術(shù)的不斷改進(jìn)以及全自動(dòng)酶標(biāo)儀的發(fā)明，使其靈敏度和特異度都有了顯著提高[28]。

2.2.2 免疫層析技術(shù)

免疫層析技術(shù)最早出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，1990年Beggs[29]首次報(bào)道了使用斑點(diǎn)層析技術(shù)檢測(cè)孕婦尿液中的人絨毛膜促性腺激素，用于判定孕情。目前免疫層析技術(shù)主要分為膠體金免疫層析技術(shù)和熒光微球免疫層析技術(shù)，常見(jiàn)的免疫層析試紙包括4個(gè)部分：樣本墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊。當(dāng)樣品滴加到試紙條上時(shí)，會(huì)利用毛細(xì)作用在纖維膜上泳動(dòng)，隨后與結(jié)合墊上的特定配體結(jié)合，繼續(xù)泳動(dòng)直至與纖維膜上的著色標(biāo)記物或酶反應(yīng)，顯示出顏色變化，便于肉眼觀察結(jié)果。傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)僅能對(duì)樣品進(jìn)行定性或半定量分析，相比而言，熒光微球技術(shù)便于進(jìn)行定量檢測(cè)，且熒光微球具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)。李泓馨等[30]對(duì)比了膠體金法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè)釀膿鏈球菌，膠體金法的敏感度為90.5%，特異度為94.8%，證實(shí)該方法可用于兒童鏈球菌感染性疾病的快速診斷，但也有文獻(xiàn)報(bào)道[31]該方法對(duì)成人釀膿鏈球菌咽炎的檢測(cè)靈敏度和特異度高于兒童，在用于兒童的病情檢測(cè)時(shí)應(yīng)加以輔助手段。Vanesa等[32]采用Monte BIO Strep A?免疫層析試劑盒對(duì)兒童醫(yī)院的患兒樣本進(jìn)行檢測(cè)，得到的試劑盒敏感度為97.1%，特異度為97.8%，但是在唾液鏈球菌分離的血液培養(yǎng)樣本中獲得了假陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明盡管免疫層析技術(shù)具有高特異度、敏感度，但仍需后續(xù)培養(yǎng)和鑒定來(lái)確認(rèn)鑒定結(jié)果。

2.3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

2.3.1 普通PCR方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種對(duì)特定DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法，近年來(lái)，PCR作為一種快速檢測(cè)病原的分子生物學(xué)方法得到了廣泛的應(yīng)用。目前，該技術(shù)主要運(yùn)用于釀膿鏈球菌的spy1528、speB以及DNase B基因[33-35]。也有文獻(xiàn)報(bào)道以莢膜多糖Cps2J基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行序列擴(kuò)增[36]。楊學(xué)明等[37]針對(duì)已公布的13株釀膿鏈球菌設(shè)計(jì)了7對(duì)引物，其中spyM引物具有高度特異性，檢測(cè)限可達(dá)10 cfu/g樣品。杜海燕等[38]針對(duì)鏈球菌延伸因子EF-Tu基因設(shè)計(jì)合成了一對(duì)通用引物用于鏈球菌的檢測(cè)，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與釀膿鏈球菌有高度同源性。Ramalingam[39]在化膿性鏈球菌的種特異性標(biāo)記開(kāi)發(fā)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了一條419 bp的單形條帶MB，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行鑒定，證實(shí)了MB的存在，且MB與釀膿鏈球菌具有高度特異性，相似性達(dá)到98%，在同一屬的其他物種中不存在。此外，有研究[40]報(bào)道鏈球菌的tuf基因（編碼延伸因子Tu）可作為開(kāi)發(fā)針對(duì)鏈球菌檢測(cè)的內(nèi)部探針，tuf序列數(shù)據(jù)與基于16S rRNA基因數(shù)據(jù)確定的系統(tǒng)發(fā)育基本一致，有望為鏈球菌感染的快速準(zhǔn)確診斷提供分子診斷工具。

基于常規(guī)PCR技術(shù)建立和發(fā)展的多重PCR是一種新型PCR技術(shù)，在一對(duì)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段。與普通PCR相比，多重PCR不僅特異性強(qiáng)、靈敏度高，而且更加經(jīng)濟(jì)便捷。Anna等[41]開(kāi)發(fā)了一種方法，可以同時(shí)檢測(cè)四個(gè)低容量多重PCR反應(yīng)中的20種釀膿鏈球菌毒力因子（spd3、sdc、sdaB、sdaD、speB、spyCEP、scpA、mac、sic、speL、K、M、C、I、a、H、G、J、smeZ和ssa），且反應(yīng)體系只有5 μl，試劑成本明顯較低。

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

熒光定量PCR技術(shù)基本原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程，擺脫了凝膠電泳和紫外成像等步驟，因此該技術(shù)不僅具有PCR技術(shù)的高特異度和高靈敏度，還具有光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點(diǎn)[42]。王遠(yuǎn)洋等[43]采用TaqMan探針?lè)?，針?duì)釀膿鏈球菌Dnase B基因設(shè)計(jì)引物探針，對(duì)肉類中釀膿鏈球菌的最低檢出限為23 pg/μl。

2.3.3 恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

傳統(tǒng)的PCR技術(shù)由于熱循環(huán)的需要，必須依賴電源和PCR儀，從而限制了這一技術(shù)脫離實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，為了克服這一缺點(diǎn)，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)。蔡妙森等[44]基于重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）原理，選擇釀膿鏈球菌致熱外毒素B基因（speB基因）和無(wú)乳鏈球菌表面免疫蛋白基因（SIP基因）分別設(shè)計(jì)RPA引物和探針，該兩重RPA檢測(cè)體系結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是近年來(lái)新興的一種快速檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。周勇等[45]將實(shí)時(shí)熒光技術(shù)與LAMP結(jié)合，建立了針對(duì)spy1258基因設(shè)計(jì)的熒光 LAMP反應(yīng)體系，與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果一致，但大幅縮減了檢測(cè)時(shí)間。并且該體系最低檢測(cè)濃度為 100 pg/μl，菌檢測(cè)限低至9.8 cfu/ml，相比尹歡等[46]針對(duì)scpA基因設(shè)計(jì)的檢出限為16.7 cfu/ml的LAMP體系，具有更高的靈敏度。

2.3.4 基因芯片技術(shù)與生物傳感器

基因芯片又稱為DNA微陣列，近年來(lái)作為一種高通量快速檢測(cè)新技術(shù)逐漸興起，其基本原理是以核酸序列雜交進(jìn)行序列測(cè)定。由于基因芯片技術(shù)將大量探針固定在支持物上，所以可以同時(shí)檢測(cè)和分析大量樣品序列，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)核酸技術(shù)操作復(fù)雜、檢測(cè)效率低的缺陷。生物傳感器是一類以生物活性單元（如酶、抗體、核酸、細(xì)胞等）作為生物敏感單元，對(duì)目標(biāo)測(cè)物具有高度選擇性的特殊傳感器，具有高度自動(dòng)化、微型化與集成化的特點(diǎn)。Swati等[47]通過(guò)將單鏈DNA探針固定在金納米枝修飾的復(fù)合電極上，開(kāi)發(fā)了阻抗式mga基因特異性DNA傳感器，用于快速檢測(cè)風(fēng)濕性心臟病患者咽拭子樣本中的釀膿鏈球菌。經(jīng)驗(yàn)證，該傳感器對(duì)釀膿鏈球菌具有高度特異性，僅在30 min內(nèi)就能檢測(cè)到6 μl樣本中低至0.01 ng的單鏈DNA。Natalia等[48]研究了一種新型阻抗式傳感器，通過(guò)碳二亞胺化學(xué)將商用抗體修飾到金盤(pán)電極表面，檢測(cè)限為9.3 cfu/ml，檢測(cè)時(shí)間約為3 min。

2.4 全基因組測(cè)序（whole-genome sequencing，WGS）

在過(guò)去數(shù)十年，WGS方法的快速進(jìn)步正在改變臨床實(shí)驗(yàn)室將基因組學(xué)應(yīng)用于生物學(xué)監(jiān)測(cè)的方式，從而協(xié)助對(duì)傳染病病原體的臨床和公共衛(wèi)生事件的處理。WGS能更好地研究菌株間的親緣關(guān)系，用于傳統(tǒng)流行病學(xué)具有局限性的不尋常的傳播環(huán)境下公共衛(wèi)生事件分析。通常認(rèn)為釀膿鏈球菌引起的侵襲性疾病是由于接觸了侵入性釀膿鏈球菌感染的人群或者感染但無(wú)癥狀的醫(yī)護(hù)人員，而有研究[49]通過(guò)WGS確認(rèn)2例通過(guò)相互無(wú)癥狀接觸獲得的侵入性釀膿鏈球菌患者的非典型點(diǎn)源傳播情況，不僅能通過(guò)患者分離出的菌株間單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）來(lái)判斷傳播途徑，而且可以通過(guò)比較毒力因子基因或者進(jìn)一步測(cè)定轉(zhuǎn)錄組來(lái)判斷菌株致病性。Tagini等[50]對(duì)侵襲性釀膿鏈球菌感染患者分離的11株釀膿鏈球菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，在較短時(shí)間內(nèi)區(qū)分密切相關(guān)的菌株，以及查明毒力因子，包括其調(diào)節(jié)機(jī)制以及抗生素耐藥性，為臨床治療提供參考。

2.5 基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionizer time-of- flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是一種于20世紀(jì)80年代末問(wèn)世的新技術(shù)，其基本原理是依據(jù)菌體蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖，與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從而獲得鑒定結(jié)果。MALDI-TOF-MS具有操作簡(jiǎn)便、鑒定迅速的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床微生物鑒定[51]。Hercules等[52]使用釀膿鏈球菌ATCC 700294作為實(shí)驗(yàn)菌株，改變鑒定過(guò)程中使用的前處理方法、基質(zhì)以及菌液濃度和培養(yǎng)基類型，得到的MALDI-TOF-MS圖譜在一組重復(fù)樣本內(nèi)和一段時(shí)間內(nèi)都是可重復(fù)的，表明該方法具有靈敏、特異和可靠的分析釀膿鏈球菌的潛力。Wang等[53]評(píng)估了MALDI Biotyper 2.0用于釀膿鏈球菌的快速檢測(cè)和聚類分析，對(duì)照生化鑒定的結(jié)果，MALDI-TOF-MS的準(zhǔn)確率為93.85%，聚類分析中，其匹配率為67.69%。這說(shuō)明，MALDI-TOFMS具有替代傳統(tǒng)分離鑒定方法的潛力，但在分類方面還需要數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)大以及MALDI-TOF-MS技術(shù)的進(jìn)展來(lái)提高準(zhǔn)確性。

3 釀膿鏈球菌感染的預(yù)防和治療

釀膿鏈球菌在自然界中分布較廣，人群攜帶率高，主要通過(guò)呼吸道飛沫傳播。由于還未有有效的鏈球菌疫苗開(kāi)發(fā)上市，目前對(duì)于釀膿鏈球菌的預(yù)防和治療主要靠給予抗生素藥物，對(duì)青霉素普遍敏感，對(duì)于青霉素過(guò)敏的患者，可使用紅霉素或新的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

近年來(lái)，釀膿鏈球菌通過(guò)環(huán)境表面進(jìn)行傳播的方式引起了廣泛關(guān)注，有研究[54]表明在干燥的環(huán)境下釀膿鏈球菌存活率有所提高，環(huán)境表面可能成為其傳播載體，并在感染和再感染中發(fā)揮作用。手部是生活中接觸物品較多的部位，做好手部衛(wèi)生有利于阻斷病菌傳播途徑，有研究[55]表明經(jīng)聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽（PHMB）處理的非無(wú)菌醫(yī)用手套對(duì)接觸表面的釀膿性鏈球菌有較好的抑制效果，可應(yīng)用于醫(yī)院等特殊場(chǎng)所。對(duì)于日常手部清潔，洗手液是較好選擇，目前市面上宣稱對(duì)釀膿鏈球菌有抑制作用的洗手液較少，開(kāi)發(fā)對(duì)釀膿鏈球菌有良好殺菌效果的綠色環(huán)保型抗抑菌洗手液具有較好的實(shí)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。此外，洗手液在生產(chǎn)和使用過(guò)程中，也可能受釀膿鏈球菌污染而成為傳播載體，因此建立適用于日化行業(yè)的釀膿鏈球菌快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)于洗手液的質(zhì)量控制具有重要意義。

4 結(jié)語(yǔ)

釀膿鏈球菌廣泛存在于自然界中，能分泌多種毒力因子，致病機(jī)制較為復(fù)雜，是人類健康的一大威脅。近年來(lái)，釀膿鏈球菌的檢測(cè)技術(shù)已從傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法發(fā)展到免疫學(xué)方法檢測(cè)及核酸分子方法檢測(cè)，毫無(wú)疑問(wèn)，高通量、高特異性的檢測(cè)方法是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。高效的檢測(cè)方法不僅有利于菌株感染的快速鑒定和及時(shí)提供治療方案，還有利于相關(guān)食品、日化產(chǎn)品的快速、安全流通。本文通過(guò)研究釀膿鏈球菌生物學(xué)特性及檢測(cè)方法，為尋找新的釀膿鏈球菌檢測(cè)靶點(diǎn)、開(kāi)發(fā)用于預(yù)防釀膿鏈球菌感染的日化產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)和思路。