胱天蛋白酶募集域蛋白9介導(dǎo)心肌缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的機制研究進展

張智祿，何新雨，彭瑜，張鉦

1 蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；2 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展及人口老齡化的不斷加速，心血管疾病的發(fā)病率和病死率不斷增高，其中急性心肌梗死（AMI）因起病急且病情變化快成為患者死亡的主要原因。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療雖然可以有效恢復(fù)冠狀動脈血流，但AMI患者1年內(nèi)再發(fā)心肌梗死率為2.5%，早期再發(fā)心肌梗死患者1年病死率達53.5%［1］。AMI患者較差的預(yù)后與心肌缺血再灌注損傷（MIRI）密切相關(guān)，閉塞血管重新開放的同時加劇了心肌細胞的代謝失調(diào)，導(dǎo)致缺血心肌細胞不可逆死亡的增加及梗死區(qū)擴大，這被稱為無復(fù)流現(xiàn)象，目前尚無有效的治療方法［2］。MIRI的發(fā)生涉及多種復(fù)雜的病理生理過程，如炎癥反應(yīng)、細胞凋亡及自噬、鈣超載及氧化應(yīng)激等［3］。胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9）主要表達于骨髓細胞，此外在巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞等抗原呈遞細胞中也有表達［4］，其由定位于人類9q34.3的基因編碼，包含2個功能區(qū)，即位于N端的CARD結(jié)構(gòu)域和位于C端的具有450個氨基酸的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，前者具有胱天蛋白酶募集功能，后者主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)寡聚化作用［5］。生理狀態(tài)下，CARD9在細胞內(nèi)與其他含有CARD結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用，實現(xiàn)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動哺乳動物針對特定真菌、細菌和病毒的先天免疫反應(yīng)及適應(yīng)性免疫，調(diào)節(jié)機體炎癥及免疫反應(yīng)［6-7］。但是在缺血、缺氧等病理狀態(tài)下，CARD9可被異常激活，導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)功能紊亂，從而引發(fā)炎癥性疾病或某些腫瘤的發(fā)生［8］。越來越多的研究顯示，CARD9可以在心血管疾病中調(diào)控p38 MAPK、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體及核因子κB（NF-κB）的激活［9］，而這些炎癥因子能夠通過介導(dǎo)心肌細胞炎癥反應(yīng)、凋亡及自噬的方式作用于MIRI的病理生理過程，參與MIRI的發(fā)生發(fā)展。現(xiàn)就CARD9介導(dǎo)MIRI的機制作一綜述，以期為MIRI的治療提供新思路。

1 CARD9通過調(diào)控心肌細胞炎癥反應(yīng)介導(dǎo)MIRI發(fā)生發(fā)展

炎癥反應(yīng)是MIRI的重要環(huán)節(jié)，當(dāng)MIRI發(fā)生時，固有免疫應(yīng)答立即被激活，造成過度的急性炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致免疫細胞浸潤、活性氧分泌及血管內(nèi)皮損傷，進一步加重心肌組織損傷［10］。

1.1 通過激活p38 MAPK調(diào)控心肌細胞炎癥反應(yīng)先天免疫反應(yīng)與MIRI具有一定的因果關(guān)系，CARD9作為先天免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)蛋白，能夠通過介導(dǎo)p38 MAPK激活調(diào)控促炎細胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生［11］。在肥胖小鼠模型中，小鼠心臟組織CARD9表達及p38 MAPK的磷酸化激活均顯著增加，而敲除CARD9不僅會下調(diào)小鼠心臟組織中p38 MAPK的活性，并且可減少小鼠心臟中浸潤的巨噬細胞數(shù)量及心肌、血漿和巨噬細胞衍生的炎癥細胞因子表達，如白細胞介素6（IL-6）、IL-1β及腫瘤壞死因子α（TNF-α），在一定程度上改善心臟肥大、纖維化和心肌功能障礙［12-13］。在缺血45 min后再灌注24 h的小鼠MIRI模型中發(fā)現(xiàn)，CARD9-/-小鼠比野生型（WT）對照小鼠梗死面積更小，心臟和血清中中性粒細胞浸潤、磷酸化p38 MAPK及細胞因子TNF-α、IL-6、CXC趨化因子配體1（CXCL1）、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）水平下降，提示敲除CARD9對心肌再灌注損傷起一定的保護作用［14］。此外，秦星［15］研究也發(fā)現(xiàn)，CARD9在MIRI的心肌組織中含量升高，且這種升高與中性粒細胞浸潤呈正相關(guān)，敲除CARD9可通過阻斷NOD2-MAPK通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減弱MIRI后心臟功能的損害程度，并且在MIRI環(huán)境中，CARD9可能還參與了其他模式識別受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。在另一項研究中，研究者使用小干擾RNA（siRNA）對急性胰腺炎大鼠進行了CARD9基因沉默，發(fā)現(xiàn)沉默CARD9的大鼠胰腺組織中NF-κB p65和p38 MAPK表達下降，并且中性粒細胞浸潤和髓過氧化物酶活性顯著減弱，提示沉默CARD9基因可以減少胰腺組織中的炎癥反應(yīng)［16］。由上可見，基于CARD9及p38 MAPK在炎癥反應(yīng)中的作用，抑制p38 MAPK依賴性過度活躍的炎癥反應(yīng)可能是MIRI的潛在治療策略，靶向產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細胞因子及吸引浸潤性免疫細胞進入心肌的趨化因子有可能成為未來對抗MIRI的新方向。

1.2 通過激活NLRP3炎癥小體調(diào)控心肌細胞炎癥反應(yīng) NLRP3炎癥小體是一種與心血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的炎癥細胞死亡形式，NLRP3可以募集含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）的前體和含有CARD的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白以形成NLRP3炎癥小體，其介導(dǎo)的Caspase-1信號通路能夠誘導(dǎo)細胞焦亡，在MIRI中可導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的大量產(chǎn)生和心肌細胞死亡，進而引發(fā)心室重構(gòu)［17］。目前，只有少數(shù)研究探索了CARD9信號介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活在MIRI中的作用機制，但通過其他研究結(jié)果或許可以間接了解兩者的關(guān)系。CARD9在真菌感染中可上調(diào)IL-1β的產(chǎn)生，而在小鼠骨髓衍生巨噬細胞中卻抑制脾酪氨酸激酶（Syk）磷酸化并抑制之后的NLRP3活化及Caspase-8向炎癥小體的募集，負向調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生，以響應(yīng)沙門菌感染［18］。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2（Ripk2）是一種在NLRP3炎癥小體激活期間通過與Caspase-1競爭性結(jié)合來抑制NLRP3活性的分子，XU等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的敗血癥小鼠模型中，CARD9-/-小鼠表現(xiàn)出更嚴重的腸道炎癥和腸道屏障功能障礙，CARD9可通過募集Ripk2來抑制NLRP3炎癥小體的過度激活和隨后IL-1β、IL-18的過度產(chǎn)生。因此，CARD9可視為NLRP3炎癥小體激活的負調(diào)節(jié)因子，其在MIRI及其他心血管疾病中的作用有待進一步研究。

2 CARD9通過調(diào)控心肌細胞凋亡介導(dǎo)MIRI發(fā)生發(fā)展

心肌細胞凋亡可誘導(dǎo)心臟重構(gòu)并導(dǎo)致多種心血管疾病以致心功能障礙［20］，多項研究表明，CARD9在此過程中發(fā)揮重要作用。線粒體依賴性細胞凋亡是MIRI后心肌細胞死亡的一種突出形式，其特征是誘導(dǎo)線粒體釋放細胞色素C，細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合形成凋亡小體［21］。凋亡小體是一種多亞基蛋白復(fù)合物，可作為半胱天冬酶激活的平臺。LI等［22］研究發(fā)現(xiàn)，CARD9在 H9c2心肌細胞中受過氧化氫的刺激而表達增加，而CARD9的缺失能夠顯著增強氧化應(yīng)激反應(yīng)；進一步對其機制進行研究，發(fā)現(xiàn)CARD9的CARD結(jié)構(gòu)域有助于抑制線粒體依賴性細胞凋亡。同時，與WT小鼠比較，CARD9-/-小鼠在MIRI后表現(xiàn)出更高數(shù)量的凋亡細胞，CARD9可通過與Apaf-1結(jié)合使細胞色素C-Apaf-1-proCaspase-9凋亡復(fù)合體分離，從而減少心肌細胞凋亡。PETERSON等［23］研究也表明，CARD9在心肌細胞和內(nèi)皮細胞中表達，主要通過抑制Caspase-9的激活來減少心肌細胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)提示心肌細胞上的CARD9在應(yīng)激環(huán)境下表現(xiàn)出抗凋亡作用以保護心臟，這與其在炎癥反應(yīng)中的作用不同。YAN等［24］在心肌梗死后第3天觀察到Dectin-2（一種在骨髓細胞上表達的模式識別受體）敲除小鼠的梗死愈合改善和心肌細胞凋亡率下降，而這一結(jié)果歸因于激活了Syk-CARD9-NF-κB通路誘導(dǎo)的細胞因子產(chǎn)生。CARD9對心肌細胞影響的差異除了CARD9信號傳導(dǎo)的不同通路之外，還可能因為所研究細胞類型的不同而產(chǎn)生，比如CARD9在心肌細胞上表現(xiàn)出抗凋亡作用［22］，而在骨髓細胞上可能表現(xiàn)出促凋亡作用［24］。也就是說，不同的細胞環(huán)境可能存在不同的細胞凋亡調(diào)節(jié)機制。鑒于CARD9介導(dǎo)的心血管疾病中有關(guān)心肌細胞凋亡的研究數(shù)量有限，在未來希望可以從關(guān)于CARD9上游靶標(biāo)的研究中找到一些線索，以更好地解釋這種差異。

3 CARD9通過調(diào)控心肌細胞自噬介導(dǎo)MIRI發(fā)生發(fā)展

自噬是一種自然的自我清潔過程，通過溶酶體降解受損的細胞器和多余的蛋白質(zhì)來維持細胞在壓力環(huán)境中的平衡［25］，對于細胞存活至關(guān)重要。在心血管疾病中，自噬是一把雙刃劍。一方面，自噬是對限制心臟損傷壓力條件的適應(yīng)性反應(yīng)；另一方面，在某些壓力條件下，過度的自噬激活可能對心臟有害［26］。及時再灌注是治療AMI的有效方法，能夠最大限度減少血流恢復(fù)時間，對于治療AMI和減少再灌注損傷至關(guān)重要。研究顯示，MIRI后活性氧激活可誘導(dǎo)心肌細胞發(fā)生自噬［27］。LI等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧/復(fù)氧或過氧化氫反應(yīng)中，CARD9表達在MIRI小鼠心臟、H9c2心肌細胞及新生大鼠心室肌細胞中增加；且與WT小鼠相比，CARD9-/-小鼠在MIRI后表現(xiàn)出更明顯的心功能障礙。該團隊進一步研究顯示，在體外和體內(nèi)MIRI過程中，CARD9的缺失均可通過微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）酯化和p62（一種已知會被自噬降解的蛋白質(zhì)）積累減少抑制自噬。自噬的發(fā)生有3個關(guān)鍵步驟，即自噬體形成、自噬體與溶酶體融合成熟、自噬溶酶體形成。自噬體可以通過組成復(fù)合物來刺激形成，該復(fù)合物包含紫外線輻射抗性相關(guān)基因（UVRAG）、自噬相關(guān)基因beclin-1及磷脂酰肌醇3激酶催化亞基3（PI3KC3）。Rubicon是一種公認的自噬負調(diào)節(jié)因子，LI等［28］研究顯示，CARD9可以與UVRAG競爭性結(jié)合Rubicon，導(dǎo)致UVRAG釋放與beclin-1、PI3KC3組成復(fù)合物，最終促進自噬體的形成、成熟和內(nèi)吞作用，提示心肌細胞中CARD9與Rubicon能夠相互作用，以恢復(fù)自噬通量來保護心肌細胞免受MIRI誘導(dǎo)的細胞死亡和損傷。然而，PETERSON等［29］在主動脈弓縮窄誘導(dǎo)的壓力過載致心功能障礙小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，CARD9-/-減輕了小鼠心功能障礙，并且可以觀察到自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3BⅡ（LC3BⅡ）/LC3BⅠ的比值增加，自噬受體蛋白p62表達降低，提示CARD9-/-恢復(fù)了功能失調(diào)的心肌自噬。這一結(jié)果與LI等［28］研究結(jié)論相反，這種不一致可能是由于使用了不同的模型，導(dǎo)致疾病環(huán)境有所差異造成的。PETERSON等［29］研究的是慢性疾病模型，而LI等［28］研究的是急性損傷模型。這也提示我們，CARD9通過上調(diào)自噬來保護心肌的作用可能只在急性心肌損傷中發(fā)揮作用，因此，未來需要更多研究來驗證和確認這些結(jié)論。

綜上所述，CARD9信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)的促炎作用已被證實參與MIRI的心臟損傷及重塑，因此，通過靶向干預(yù)CARD和CARD9介導(dǎo)的信號通路進行抗炎治療可能是一個很有前景的選擇。目前，體內(nèi)干細胞注射治療心肌梗死的方案已在研究中，ZHAO等［30］在注射干細胞的心肌梗死模型中發(fā)現(xiàn)CARD9-/-小鼠的早期死亡率降低，并且含有T細胞和巨噬細胞的肉芽腫形成較對照組小鼠明顯減少，提示CARD9的免疫抑制作用可預(yù)防體內(nèi)干細胞治療中巨噬細胞介導(dǎo)的急性免疫損傷，進而保護MIRI后的心功能并可顯著提高患者存活率。此外，有學(xué)者認為CARD9是鋅離子介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的潛在靶標(biāo)，WANG等［13］研究發(fā)現(xiàn)，鋅補充劑可以通過抑制CARD9/BCL10信號傳導(dǎo)來預(yù)防小鼠模型中與肥胖相關(guān)的心臟肥大，鋅可以與CARD9的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制CARD9-CARD聚合成螺旋體，從而抑制CARD9/BCL10信號傳導(dǎo)。最新研究顯示，CARD9的化學(xué)抑制劑BRD5529可以顯著降低肺孢子菌肺炎小鼠肺組織中IL-6和TNF-α的產(chǎn)生以減輕肺部炎癥，研究者同時對BRD5529用于臨床研究的安全性進行了驗證，研究結(jié)果數(shù)據(jù)支持對該抑制劑進行更為廣泛的體內(nèi)測試，以期作為治療宿主免疫反應(yīng)的輔助治療［31］。但是，迄今為止，關(guān)于CARD9與MIRI的相關(guān)研究仍然有限，尤其對CARD9在不同細胞類型（如骨髓細胞和心肌細胞）中的確切機制需要進一步探索。因此，針對CARD9的未來研究應(yīng)關(guān)注其在MIRI中的主要上、下游分子以及與其他信號分子的串?dāng)_，同時對于CARD9的表觀遺傳修飾機制，如磷酸化和泛素化等進行更深入的研究。期待有更多關(guān)于CARD9的動物實驗及臨床研究出現(xiàn)，或可會為MIRI的治療開辟新的方向。