西藥聯(lián)合溫和灸對(duì)甲狀腺功能減退大鼠模型干預(yù)作用的機(jī)制研究

王紅陽，孫佳姿，劉清清，閆 婧，張?zhí)焐?，郝重?/p>

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2.山西省針灸醫(yī)院，山西 太原 030006）

甲狀腺功能減退癥（甲減）是一種由甲狀腺激素含量不足導(dǎo)致的內(nèi)分泌疾病，涉及多個(gè)器官系統(tǒng)。甲減的發(fā)病率正逐漸升高［1］。甲減的發(fā)病原因復(fù)雜，與免疫及機(jī)體的碘含量［2］等多種因素相關(guān)。甲狀腺自身抗體是甲減發(fā)病的影響因素之一，其檢出率女性高于男性［3］，甲減的發(fā)病率女性較高也與此有關(guān)。甲減已被發(fā)現(xiàn)與多種疾病相關(guān)［4-6］。最新研究還發(fā)現(xiàn)甲減與新冠的病情預(yù)后存在相關(guān)性［7］。甲減的臨床治療多采用激素替代法。激素替代治療因個(gè)體差異大，藥量控制難［8］，且研究表明激素替代治療可增加甲減患者心血管疾病及骨質(zhì)疏松癥的患病風(fēng)險(xiǎn)［9］。課題組前期研究表明麥粒灸可調(diào)節(jié)甲減大鼠海馬乙酰膽堿含量［10］、抑郁狀態(tài)［11］、調(diào)節(jié)免疫失衡［12］，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究艾灸對(duì)甲減的可能干預(yù)機(jī)制。麥粒灸操作難度大，存在推廣局限。本實(shí)驗(yàn)通過觀察西藥加溫和灸對(duì)甲減模型大鼠血清甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TGAb）、白 細(xì) 胞 介 素4（interleukin-4，IL-4）、白細(xì)胞介素23（interleukin-23，IL-23），甲狀腺組織鈉碘共轉(zhuǎn)運(yùn)體（na/I symporter，NIS）的含量，及甲狀腺組織NISmRNA 表達(dá)量，探究西藥聯(lián)合溫和灸對(duì)甲減的干預(yù)作用，及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)8 周齡SD 大鼠32 只（雌雄各半），體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)自北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。溫度（25±1） ℃，濕度（48±2）%，光照12 h，自由飲食飲水。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為4 組，分別為：空白組、模型組、西藥組、西藥加溫和灸組，每組8 只。實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)山西省針灸研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)號(hào)：倫審科2020 第003 號(hào)）。

1.2 主要儀器

37 度 酶 標(biāo) 儀 Rayto RT-6100 450 nm 波 長(zhǎng) 微 量高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司TG16W

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司 TGL16M 120 g/0.1 mg 電子分析天平 上海良平生產(chǎn) AE1204 電子分析天平 瑞士PRECISA生 產(chǎn) XB220A 細(xì) 胞 破 碎 儀 EasyWeLL 系 列JY98-IIIN 正置顯微鏡 OLYMPUS 公司CX41 恒溫烘箱 上海恒一科學(xué)儀器有限公司 低溫冷凍離心機(jī)上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司 TG-16M 移液槍吉爾森P 型移液器公司 青浦瀘西儀器廠K30 電動(dòng)勻漿機(jī) FLUKO 公司 PRO200

1.3 主要試劑

大鼠白細(xì)胞介素23（IL-23）ELISA 試劑盒 WKSUbio 20210810 大鼠白細(xì)胞介素4（IL-4）ELISA 試劑盒 WKSUbio 20210710 大鼠免疫球蛋白G4 ELLSA 試 劑 盒 WKSUbio 20210826 大 鼠TSH ELISA 檢測(cè)試劑WKSUbio 20210623 大鼠FT3 ELISA 檢測(cè)試劑盒 WKSUbio 20210705 大鼠FT4 ELISA 檢測(cè)試劑盒 WKSUbio 20210705 石蠟 上海國(guó)藥集團(tuán) 69018961 甲醛 上海國(guó)藥集團(tuán) 10010018二甲苯 上海國(guó)藥集團(tuán) 10023418 無水乙醇 上海國(guó)藥集團(tuán) 10092680 30%H2O2 上海國(guó)藥集團(tuán)10011218 廣譜二抗 上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司D-3004 DAB 濃縮型試劑盒 上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司FL-6001 蘇木素 廠家BASO 714094 中性樹脂wksubio PAB180017 PCR 試 劑 盒 SYBR Green Thermo #K0223 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 Fermentas #K1622氯仿 國(guó)藥集團(tuán) 10023419 異丙醇 國(guó)藥集團(tuán)80109218 Trizol invitrogen 1596-026 水合氯醛 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 4%多聚甲醛 大連美侖生物技術(shù)有限公司

1.4 藥品

丙硫氧嘧啶片（上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司，H31021082，50 μg；規(guī)格：50 mg/片）；左旋甲狀腺素鈉片（德國(guó)默克公司， H20140052；規(guī)格：50 μg/片）

1.5 造模

參考劉洲君［13］的造模，除空白組外其余各組均采用10% 丙硫氧嘧啶（PTU）溶液按10 mL/kg 體重的劑量每日灌胃，以制備甲減模型；每周記錄大鼠體重以調(diào)整灌胃劑量。灌胃4 周后尾靜脈取血，檢測(cè)各組大鼠血清中TSH、TT4 的值，與空白組相比其余組出現(xiàn)TSH 含量上升，TT4 含量下降，即可判斷為模型建立成功［14］。為維持大鼠甲減狀態(tài)，造模成功后除空白組外的各組依然用PTU 溶液灌胃，頻率改為隔日一次直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.6 干預(yù)措施

空白組：不做處理。

模型組：與西藥加溫和灸組同方式，同頻率固定。

西藥組：左甲狀腺素鈉混懸液60 μg/kg 每日灌胃；與西藥加溫和灸組同方式、同頻率固定。

西藥加溫和灸組：左甲狀腺素鈉混懸液60 μg/kg 每日灌胃。固定大鼠，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［15］，取大鼠的大椎、命門、脾俞、腎俞，溫和灸以上各穴，艾條垂直于穴位上2-3 cm 每穴灸10 min，治療每6 日休息1 日，共治療4 周。

1.7 數(shù)據(jù)收集

末次干預(yù)后大鼠禁食不禁水24 h，以10%水合氯醛按3.5 mL/kg 體重腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置1 h，3000 rp/min 離心機(jī)中離心10 min，取上層血清封存后，于-80℃冰箱中保存，待測(cè)。

大鼠處死后，割開頸部皮膚，剝離頸部肌肉及筋膜組織，暴露甲狀腺，取左側(cè)甲狀腺組織于10%多聚甲醛溶液中，常溫保存；右側(cè)甲狀腺組織，于凍存管中-80℃冰箱保存，待測(cè)。

1.8 指標(biāo)檢測(cè)

1.8.1 血清中相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 將大鼠血清按ELISA 試劑盒要求逐步檢測(cè)，最終檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的OD 值，檢測(cè)各組大鼠血清中TSH、TT4、TGAb、TPOAb、IL-4、IL23 含量。

1.8.2 甲狀腺組織中NIS 免疫組化測(cè)定 于10%多聚甲醛中取出甲狀腺組織，經(jīng)固定-洗滌與脫水-透 明-浸 蠟-包 埋-切 片 后，進(jìn) 行 染 色，脫 蠟-水化-抗原修復(fù)-阻斷-封閉-PBS 清洗-脫水-透明-封片，鏡下圖像采集。

1.8.3 甲狀腺組織中NISmRNA 的基因表達(dá)測(cè)定具體操作方法如下：取出凍存管中的甲狀腺組織后，勻漿，反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增，引物序列見表1，觀察溶解曲線確定其特異性，以GAPDH 為內(nèi)參基因，空白組為對(duì)照組，用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR 引物序列Tab 1 Primer sequence of PCR

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊采用單因素ANOVA 進(jìn)行分析、兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊，用塔姆黑尼檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西藥加溫和灸對(duì)各組大鼠甲狀腺功能的影響

干預(yù)前，與空白組比較，其余各組大鼠血清中TSH 含量上升，TT4 含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；干預(yù)后，與空白組比較模型組大鼠血清中TSH 含量上升，TT4 含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較西藥組及西藥加溫和灸組大鼠血清中TSH 含量下降，TT4 含量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與西藥組比較，西藥加溫和灸組大鼠血清中TSH 含量下降，TT4 含量上升，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中TSH、TT4 含量變化（n=8）Tab 2 Changes of serum TSH and TT4 contents of rats in each group（n=8）

2.2 西藥加溫和灸對(duì)大鼠甲狀腺自身抗體含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清中TPOAb、TGAb 含量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較西藥組及西藥加溫和灸組大鼠血清中TPOAb、TGAb 含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與西藥組比較，西藥加溫和灸組大鼠血清中TPOAb、TGAb 含量下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠干預(yù)前后血清中甲狀腺自身抗體含量（n=8）Tab 3 Serum thyroid autoantibodies in each group before and after intervention （n=8）

2.3 西藥加溫和灸對(duì)各組大鼠甲狀腺細(xì)胞因子表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-4 含量下降，IL-23 含量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較西藥組及西藥加溫和灸組大鼠血清中IL-4 含量上升，IL-23 含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與西藥組比較，西藥加溫和灸組大鼠血清中IL-4、IL-23 含量上升，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清中細(xì)胞因子含量變化（n=8）Tab 4 Changes in serum cytokine content of rats in each group （n=8）

2.4 西藥加溫和灸對(duì)各組大鼠甲狀腺組織中NIS含量的影響

NIS 的陽性染色呈棕黃色，主要分布于甲狀腺濾泡細(xì)胞胞膜上。圖片中空白組及西藥加溫和灸組染色較深，分布范圍廣，西藥組染色相對(duì)較淺，分布范圍廣；模型組染色淺，分布范圍。見圖1。

與空白組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中NIS的含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較西藥組及西藥加溫和灸組大鼠甲狀腺組織中NIS 的含量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與西藥組比較，西藥加溫和灸組大鼠甲狀腺組織中NIS 的含量上升，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠NIS 平均灰度值比較（n=4，±s）Tab 5 Comparison of average gray values of NIS in each group （n=4，±s ）

表5 各組大鼠NIS 平均灰度值比較（n=4，±s）Tab 5 Comparison of average gray values of NIS in each group （n=4，±s ）

注：與空白組比較，1）P＜0.01;與模型組比較，2）P＜0.01;與西藥組比較，3）P＞0.05。

IOD 值32.78±0.56 19.67±5.851）35.85±0.802）33.08±1.512）3）22.465 0.000組別空白組模型組西藥組西藥加溫和灸組FP

2.5 西藥加溫和灸對(duì)各組大鼠甲狀腺組織中NISmRNA 表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中NISmRNA 的含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較西藥組及西藥加溫和灸組大鼠甲狀腺組織中NISmRNA 含量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與西藥組比較，西藥加溫和灸組大鼠甲狀腺組織中NISmRNA 含量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 各組大鼠甲狀腺組織NISmRNA 相對(duì)表達(dá)量Tab 6 Relative expression of NISmRNA in thyroid tissue of rats in each group

3 討論

甲減的發(fā)病與多種疾病相關(guān)，其發(fā)病率的逐漸升高，對(duì)機(jī)體傷害較大。甲減還與妊娠及新生兒生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系密切［16，17］。甲減的治療目前多針對(duì)其激素缺乏的病因采用激素替代治療。激素替代治療療效好，但依從性差［18］，且治療的藥物用量難以把控［19］，易增加副作用產(chǎn)生率。針灸治療甲減療效好［20］，優(yōu)勢(shì)明顯。艾灸對(duì)甲減的干預(yù)作用顯著，可有效解決激素替代治療中的問題。為甲減的臨床治療提供新的選擇。艾灸對(duì)于甲減的治療遵循中醫(yī)理論指導(dǎo)，從甲減脾腎陽虛的病機(jī)［21］角度出發(fā)，選用脾俞、腎俞、大椎、命門補(bǔ)益脾腎之陽。溫和灸操作簡(jiǎn)單，易推廣。

免疫系統(tǒng)功能紊亂是甲減發(fā)病的原因之一。甲狀腺自身抗體含量上升是甲減發(fā)病的重要免疫系統(tǒng)表現(xiàn)。TPOAb 和TGAb 是甲狀腺的自身抗體，可抑制甲狀腺功能［22］。調(diào)節(jié)免疫是甲減的干預(yù)機(jī)制之一［23］。IL-4、IL-23 分別是Th2、Th23 產(chǎn)生的細(xì)胞因子。IL-4 的含量一定程度上可預(yù)測(cè)甲減的嚴(yán)重程度［24］。甲減發(fā)病與IL-23 含量變化相關(guān)［25］。甲 減 患 者 的IL-23/IL-23R/Th17 細(xì) 胞 軸 增 強(qiáng)［26］。研究結(jié)果顯示，西藥組及西藥加溫和灸均可降低大鼠血清中TSH、TPOAb、TGAb、IL-23 的含量（P＜0.01），升高TT4、IL-4 含量（P＜0.01），可見西藥及西藥加溫和灸組對(duì)甲減模型大鼠干預(yù)作用確切，可調(diào)節(jié)甲減模型大鼠的免疫因子含量，調(diào)節(jié)免疫平衡。

碘是甲狀腺激素合成的重要原料。甲狀腺細(xì)胞對(duì)于碘的攝取能力與甲狀腺激素的分泌直接相關(guān)。NIS 是碘向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的一種糖蛋白，甲狀腺細(xì)胞上碘的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于NIS 實(shí)現(xiàn)。NIS 在甲狀腺組織中的含量，與甲狀腺激素的產(chǎn)生量正相關(guān)。甲狀腺組織中NIS 的含量與血清TGAb、TPOAb 含量存在相關(guān)性［27］。研究結(jié)果表明：西藥及西藥加溫和灸可促進(jìn)甲狀腺組織中NISmRNA 的表達(dá)；且西藥加溫和灸組效果優(yōu)于西藥組（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。說明西藥加溫和灸具有干預(yù)甲減模型大鼠，其增強(qiáng)甲狀腺組織中NISmRNA 表達(dá)的作用優(yōu)于西藥。

4 結(jié)論

西藥聯(lián)合溫和灸可以調(diào)節(jié)甲減大鼠的免疫系統(tǒng)，降低TPOAb、TGAb、及IL-23 的含量，升高IL-4的含量，促進(jìn)甲減大鼠甲狀腺組織中NIS 的基因表達(dá)，增加NIS 的含量。這與炎性因子對(duì)NIS 具有調(diào)節(jié)作用的研究結(jié)果一致，IL-4 過表達(dá)的小鼠可代償由碘缺乏導(dǎo)致的甲減，IL-4 過表達(dá)小鼠的甲減可由補(bǔ) 碘 解 決［16］。這 可 能 說 明IL-4 與NIS 表 達(dá) 間 存 在雙向調(diào)節(jié)關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。另外在本實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)西藥加溫和灸對(duì)甲減模型大鼠的干預(yù)作用更顯著，但其效果與西藥組相比并不明確，只在對(duì)NISmRNA 表達(dá)的促進(jìn)上更加確定（P＜0.05），其原因可能與本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，或溫和灸刺激量小相關(guān)，有待進(jìn)一步探究，以確定溫和灸與西藥是否具有協(xié)同作用。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張?zhí)焐簩?duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)；郝重耀：技術(shù)指導(dǎo)，文章審校；王紅陽，孫佳姿，劉清清，閆婧：負(fù)責(zé)藥物干預(yù)，指標(biāo)檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析；王紅陽：執(zhí)筆撰寫論文。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。