生物信息學方法對地塞米松致開角型青光眼潛在靶基因的確定和分析

劉麗玲 李德玲 曾偉婷 張心怡 徐建剛 余敏斌

中山大學中山眼科中心 眼科學國家重點實驗室 廣東省眼科視覺科學重點實驗室，廣州 510060

青光眼是一種因視神經(jīng)損傷導致視力喪失的疾病，其發(fā)病涉及到多基因和環(huán)境因素，其中病理性高眼壓是其主要危險因素。臨床上，多種系統(tǒng)性疾病和眼科疾病常用糖皮質(zhì)激素類藥物進行治療，其長期使用可能會引起眼壓升高，若不及時治療會導致青光眼，甚至致盲。糖皮質(zhì)激素進入靶組織后須與其受體(glucocorticoid receptor alpha，GRα)結(jié)合，受體通過改變構(gòu)象并移位到細胞核中發(fā)揮作用。GRα與糖皮質(zhì)激素配體結(jié)合誘導或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄可占人基因組的10%～20%[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松使細胞外基質(zhì)中相關的降解酶減少，導致基質(zhì)堆積在小梁網(wǎng)，同時使小梁網(wǎng)骨架交聯(lián)成肌動蛋白交聯(lián)網(wǎng)絡[2-7]，這些變化引起房水流出受阻，最后導致眼壓升高。隨著生物基因組測序工程技術的快速發(fā)展，許多生物學實驗數(shù)據(jù)不斷積累，互聯(lián)網(wǎng)上公布了不同類型的分子生物學數(shù)據(jù)庫，如核酸數(shù)據(jù)庫、基因表達數(shù)據(jù)庫、蛋白組學數(shù)據(jù)庫、代謝組學數(shù)據(jù)庫等，并提供相關的數(shù)據(jù)查詢和數(shù)據(jù)處理服務。以計算機為工具查找相關數(shù)據(jù)庫，對生物信息進行儲存、檢索和分析是生物信息學的重要應用領域。目前常用的生物信息學研究主要包括差異表達基因(differentially expressed gene，DEG)、基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析和加權基因共表達網(wǎng)絡分析。近年來研究者通過測序發(fā)現(xiàn)了激素類青光眼與正常人的差異表達基因及信號通路的變化，但是生物信息學工具分析的數(shù)據(jù)與實際并非完全相符，需要更多的實驗驗證結(jié)果。本研究擬借助GEO數(shù)據(jù)庫尋找地塞米松致開角型青光眼的潛在靶基因并用體外實驗加以驗證，為激素性青光眼的精準治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源 人眼原代小梁細胞(美國Sciencell公司)。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、Trizol、lipofectamine RNAiMAX、DAPI(2145S35)(美國Invitrogen公司)；地塞米松(美國Sigma公司)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(美國GLPBIO公司)；兔抗人BDKRB1抗體(ab75148)(美國Abcam公司)；鼠抗人TAGLN抗體(sc-53932)(美國Santa Gruz公司)；兔抗人LMOD1抗體(15117-1-AP)(美國Proteintech公司)；兔抗人β-actin抗體(4970)、兔抗人GAPDH抗體(5174S)、山羊抗兔二抗(7074S)、馬抗鼠二抗(7076S)(美國CST公司)；ECL化學發(fā)光液(美國Merck Millipore公司)。超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemDoc Touch)(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1不同生物信息學方法對地塞米松處理眼小梁細胞生物學功能的評估

1.2.1.1通過GEO數(shù)據(jù)庫檢索激素類青光眼相關數(shù)據(jù)集 以“Dexamethasone AND Open-angle glaucoma”作為關鍵詞在GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)[8]數(shù)據(jù)庫上搜索相關數(shù)據(jù)集，最后選定GSE16643、GSE37474和GSE124114。其中GSE16643基于GPL6480平臺，使用Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F芯片，包含TM86和TM93各3組配對樣本；GSE37474基于GPL570平臺，利用[HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片分析，包含5組配對樣本；GSE124114基于GPL6244平臺，利用[HuGene-1_0-st] Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array芯片分析獲得，包含9組配對樣本。

1.2.1.2GEO2R法分析小梁細胞差異基因 GSE37474、GSE124114和GSE16643數(shù)據(jù)經(jīng)過GEO2R得到相應的差異基因，采用t檢驗和Benjimani-Hochberg方法計算校正后P值。選擇有意義的差異基因標準為Log2倍數(shù)變化(fold change,FC)絕對值>1且P.adjust<0.05。從中選擇最有意義的基因，通過R軟件以Log2FC為橫坐標、-Log10(Pvalue)為縱坐標繪制GSE37474和GSE124114數(shù)據(jù)集差異基因的火山圖。采用DAVID(http://david.ncifcrf.gov)[9]找出數(shù)據(jù)集之間的交集基因。

1.2.1.3GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)軟件對數(shù)據(jù)集GSE37474和GSE124114進行富集分析 用1個預先定義的基因集中的基因來評估在以表型相關度排序的基因表中的分布趨勢，從而判斷其對表型的貢獻。數(shù)據(jù)集選取MSigDB數(shù)據(jù)庫中c2.cp.v7.2.symbols.gmt基因集合分析。Y軸代表1個基因集，X軸為每個基因集中核心分子對應的logFC分布情況；每個基因集對應1個山峰，山峰的形狀代表該基因集中核心分子的LogFC分布情況，其中峰高對應的位置代表大部分分子的logFC集中在這個位置；圖中每個峰下面還有1根小的豎線代表該組的核心分子，線越集中的位置說明該組數(shù)據(jù)在這個區(qū)間越集中，對應的是山峰的峰值；如果對應的基因集NES為負值，則一般該基因集的峰會在0的左側(cè)；如果對應的基因集歸一化富集分數(shù)(normalized enrichment score，NES)為正，則一般該基因集的峰會在0的右側(cè)。一般認為滿足錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.25且P.adjust<0.05即為顯著富集[10]。

1.2.1.4GTEx Portal數(shù)據(jù)庫查詢正常人成纖維細胞中差異基因表達量 將GO分析得分最高組的相關基因群導入GTEx Portal數(shù)據(jù)庫(https://www.gtexportal.org/)中，尋找基因群在人成纖維細胞的表達量每百萬條reads的轉(zhuǎn)錄本(transcripts per million，TPM)[11]。

1.2.1.5線上STRING網(wǎng)站尋找差異基因蛋白互作網(wǎng)絡 采用STRING(https://string-db.org/)[12]分析GSE16643、GSE37474和GSE124114差異基因的交集對應DEG的蛋白間網(wǎng)絡分析。蛋白分子間物理和功能聯(lián)系通過智能計算預測、高通量實驗、共表達網(wǎng)絡等得出。設置蛋白間interaction score>0.4閾值并繪制相應的網(wǎng)絡圖。采用Cytoscape v3.6.6軟件可視化并構(gòu)建蛋白間互作網(wǎng)絡[13]，相互連接最多的節(jié)點稱為關鍵節(jié)點(hub nodes)[14]。

1.2.1.6線上JASPAR和UCSU數(shù)據(jù)庫尋找相關轉(zhuǎn)錄因子 將上述生信工具找到的差異基因輸入UCSC(genome-asia.ucsu.edu/index.html)[15]尋找相關啟動子序列，并與JASPAR(https://jaspar.genereg.net)[16]連接尋找轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)合位點信息。

1.2.2實驗觀察地塞米松對培養(yǎng)小梁細胞的影響

1.2.2.1細胞培養(yǎng)及分組 第2～6代原代細胞復蘇后培養(yǎng)在含體積分數(shù)10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長融合達90%時進行傳代培養(yǎng)，取處于對數(shù)期的細胞加入500 nmol/L地塞米松2 ml培養(yǎng)7 d，設為地塞米松組。對照組加入等體積乙醇溶液培養(yǎng)7 d。實驗重復3次。

1.2.2.2Western blot法檢測小梁細胞中BDKRB1和TAGLN蛋白表達 采用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。將膜放在快速BSA封閉液中封閉10 min，分別加入一抗BDKRB1(1∶ 800)、TAGLN(1∶ 500)、LMOD1(1∶ 1 000)、β-actin(1∶ 2 000)、GAPDH(1∶ 2 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入相應二抗(1∶ 2 000)，室溫下孵育1 h；加入超敏ECL化學發(fā)光液顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin和GAPDH為內(nèi)參，計算各組細胞中目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)集信息處理和差異基因篩選

GEO2R分析發(fā)現(xiàn)，GSE37474有15個有意義的差異基因，其中上調(diào)12個，下調(diào)3個；GSE124112有13個有意義的差異基因，其中上調(diào)8個，下調(diào)5個(圖1)。

圖1 眼小梁細胞GSE37474和GSE124114差異表達基因火山圖 藍色代表表達下調(diào)基因，紅色代表表達上調(diào)基因 A：GSE37474 B：GSE124114 FC:倍數(shù)變化

2.2 GSEA軟件對數(shù)據(jù)集GSE37474和GSE124114的富集分析

經(jīng)過軟件分析，GSE37474和GSE124114基因集中滿足FDR<0.25且P.adjust<0.05的數(shù)據(jù)集分別有250個和71個，其中GSE37474排名前10且與激素類青光眼有關的數(shù)據(jù)集有7個，分別為花生四烯酸代謝相關通路、細胞黏附分子相關通路、趨化因子信號相關通路、補體和凝血級聯(lián)通路、細胞因子和其受體連接通路、細胞外基質(zhì)受體連接通路和黏著斑相關信號通路；其中，GSE37474排名前10且與激素類青光眼有關的數(shù)據(jù)集有4個，分別為補體和凝血級聯(lián)通路、細胞外基質(zhì)受體連接通路、黏著斑相關信號通路和溶解酶相關信號通路。可以看出補體和凝血級聯(lián)通路、細胞外基質(zhì)受體連接通路和黏著斑相關信號通路為共同信號通路(圖2)。

圖2 GSEA軟件對數(shù)據(jù)集GSE37474和GSE124114富集分析比較 列出前10個差異基因富集且與激素類青光眼有關的通路

2.3 數(shù)據(jù)集間差異表達基因及其功能通路

根據(jù)樣品信息和數(shù)據(jù)矩陣信息，用韋恩圖得到GSE37474、GSE124114和GSE16643交集差異基因有89個；在DAVID網(wǎng)站的功能分析GO發(fā)現(xiàn)這89個基因主要參與細胞外結(jié)構(gòu)和基質(zhì)的形成過程(圖3)。經(jīng)KEGG分析發(fā)現(xiàn)有3條信號通路與目標基因有關，分別是酪氨酸代謝、細胞色素P450藥物代謝和脂肪酸生物合成途徑。將GO分析得分最高、含有膠原的細胞外基質(zhì)的基因在GTEx Portal數(shù)據(jù)庫里尋找發(fā)現(xiàn)其主要表達在成纖維細胞中(表1)。

圖3 GSE16643、GSE37474和GSE124114數(shù)據(jù)集交集的韋恩圖與數(shù)據(jù)集交集差異基因的GO富集分析 A：3個數(shù)據(jù)集差異顯著DEG的基因數(shù)韋恩圖 紫色代表GSE124114；粉色代表GSE16643；綠色代表GSE374734 B：GO分析交集基因的功能組構(gòu)成

表1 GSE124114、GSE37474和GSE16643數(shù)據(jù)集差異基因的GO富集分析含膠原的細胞外基質(zhì)相關基因在正常成纖維細胞中的表達量Table 1 Relative expression of collagen-containing extracellular matrix-associated genes in normal fibroblasts of GSE16643,GSE37474 and GSE124114 datasets by GO enrichment analysis基因TPMSERPINA32.62COL8A22.44F3(TF)142.60MFGE8161.50NID1326.10OMD1.18SLPI2.08COL14A10.94GDF1523.82PRG40.83 注:GO:基因本體論;TPM:每百萬條reads的轉(zhuǎn)錄本 Note:GO:Gene Ontology;TPM:transcripts per million

2.4 差異基因中的核心基因及其功能通路

為了從交集差異基因中篩選核心基因，89個基因經(jīng)STRING網(wǎng)站上進一步分析，包含87個節(jié)點和50條關系線，平均聚類系數(shù)為0.28。其中與肌肉收縮相關的核心基因有LMOD1、ACTA2、MYL9；與肌動蛋白結(jié)合相關的核心基因有LMOD1、TAGLN;與細胞溶質(zhì)相關的核心基因有LMOD1、ACTA2、MYL9;與血管平滑肌收縮相關的核心基因有ACTA2、MYL9(表2，圖4)。

2.5 與BDKRB1、NID1、MFGE8和TAGLN相關的轉(zhuǎn)錄因子

在UCSC上找到基因的啟動序列，結(jié)合JASPAR找到BDKRB1、NID1、MFGE8和TAGLN的共同轉(zhuǎn)錄因子為SP1以及預測結(jié)合序列(表3)。

2.6 各組小梁細胞中BDKRB1、TAGLN和LMOD1蛋白表達量比較

Western blot分析顯示，地塞米松組BDKRB1和TAGLN蛋白條帶較對照組明顯增強。地塞米松組BDKRB1和TAGLN蛋白相對表達量為1.32±0.14和0.44±0.09，高于對照組的1.00±0.00和0.20±0.10，差異均有統(tǒng)計學意義(t=-3.61、2.89，均P<0.05)。地塞米松組和對照組LMOD1蛋白相對表達量分別為0.56±0.02和0.49±0.07，差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.71,P>0.05)(圖5，6)。

表2 STRING分析得到的關鍵基因Table 2 STRING analysis of key genes among GSE16643,GSE37474 and GSE124114 datasets分類功能數(shù)目P值FDR核心基因GOTERM_BP_DIRECT肌肉收縮30.000 120.086 980 929LMOD1、ACTA2、MYL9GOTERM_MF_DIRECT肌動蛋白結(jié)合20.048 598 34723.870 702 52LMOD1、TAGLNGOTERM_CC_DIRECT細胞溶質(zhì)30.087 212 63648.964 153 44LMOD1、ACTA2、MYL9KEGG_PATHWAY血管平滑肌收縮20.017 008 2868.463 993 952ACTA2、MYL9 注:FDR:錯誤發(fā)現(xiàn)率 Note:FDR:false discovery rate

表3 BDKRB1、NID1、MFGE8和TAGLN基因相關的轉(zhuǎn)錄因子SP1及相關結(jié)合位點信息Table 3 Transcription factor SP1 and binding sites in BDKRB1,NID1,MFGE8 and TAGLN基因矩陣ID名稱得分相對得分序列ID首端末端鏈預測序列BDKRB1MA0079.1MA0079.1.SP18.270.87Hg38_refGene_NM_000710783792+tgggcaggatNID1MA0079.1MA0079.1.SP18.890.89Hg38_refGene_NM_002508203212+gggggatggtMFGE8MA0079.1MA0079.1.SP18.780.89Hg38_refGene_NM_001310319109118_ttggctgggtTAGLNMA0079.1MA0079.1.SP19.740.93Hg38_refGene_NM_003186217226_ggggctggga

圖5 地塞米松處理小梁細胞對BDKRB1蛋白表達影響 A：對照組和地塞米松組BDKRB1蛋白表達電泳圖 B：對照組和地塞米松組BDKRB1蛋白相對表達量比較 與對照組比較，aP<0.05(獨立樣本t檢驗，n=3) GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖6 地塞米松處理小梁細胞對LMOD1和TAGLN蛋白表達影響 A：對照組和地塞米松組LMOD1和TAGLN蛋白表達電泳圖 B：對照組和地塞米松組TAGLN蛋白相對表達量比較 與對照組比較，aP<0.05(獨立樣本t檢驗，n=3) β-actin:β-肌動蛋白

3 討論

由于糖皮質(zhì)激素在臨床治療中不可或缺，其產(chǎn)生的不良反應日益引起許多研究者的關注，其中研究較多的是地塞米松對眼房水流出通道的影響。本研究選取的GSE37474來自平均年齡65歲老年人群，而GSE124114是來自平均年齡為25歲青年人，但GSEA結(jié)果顯示2個組的基因富集變化有相似結(jié)果。本研究選擇富集分析中排名靠前的補體和凝血級聯(lián)通路的BDKRB1蛋白表達進行分析，結(jié)果顯示地塞米松會引起其表達增加。BDKRB1屬于激肽激酶-激肽系統(tǒng)的組成部分，激肽是小分子多肽，當機體受到損傷時激肽能作為炎癥和疼痛的調(diào)節(jié)分子。緩激肽(bradykinin，BK)、lys-BK、desArg9-BK和lys-desArg9-BK通過BDKRB1和BDKRB2 2個不同的受體發(fā)揮作用。lys-BK、desArg9-BK多肽能激活BDKRB1，而BK、lys-BK則激活BDKRB2。BDKRB1和BDKRB2均屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族的7個跨膜結(jié)構(gòu)域，具有7個跨膜結(jié)構(gòu)、1個胞外氨基末端和1個胞質(zhì)羧基末端的共同結(jié)構(gòu)[17]。BDKRB2分布廣泛并調(diào)節(jié)大部分緩激肽的生物活動，然而BDKRB1在腦和脊髓正常的生理狀態(tài)很難被檢測到，在炎癥或組織損傷時顯著上調(diào)[18]。目前暫未見BDKRB1在眼小梁細胞中檢出的報道，本研究結(jié)果顯示地塞米松處理后該蛋白表達上調(diào)，可以監(jiān)測其炎癥反應活動的程度。

本研究中聯(lián)合3個數(shù)據(jù)集GSE37474、GSE124114和GSE16643的差異基因的交集分析，在STRING蛋白互作分析中發(fā)現(xiàn)2個與骨架變化相關新的基因，即TAGLN和LOMD1。Leung等[19]研究顯示，在地塞米松作用小梁細胞后經(jīng)芯片測序檢測出的TAGLN比正常對照組顯著升高。TAGLN屬于鈣蛋白家族，編碼一種對形狀變化敏感的激動蛋白結(jié)合蛋白，但其具體作用仍需進一步研究。Leiomodin 1(LMOD1)是一種控制血管或內(nèi)臟平滑肌收縮的蛋白，主要在甲狀腺中高表達，同時也存在于眼部肌肉、骨骼肌和卵巢等組織中，主要在Graves甲狀腺疾病和甲狀腺相關眼部疾病中有報道[20]，目前尚未見該基因參與青光眼發(fā)病的報道。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過地塞米松處理體外小梁細胞，TAGLN蛋白相對表達量較對照組增加，但LOMD1蛋白未見顯著增加。從STRING蛋白互作圖可以看出，TAGLN與ACTA2相關，提示TAGLN參與小梁細胞在地塞米松作用下細胞骨架的變化。

GO富集分析部分主要集中在含有膠原的細胞外基質(zhì)，過多的膠原堆積在小梁網(wǎng)會阻塞房水的流出，最終導致眼壓升高[21]。本研究把GO富集分析得分最高的相關基因在GTEx Portal數(shù)據(jù)庫中比對正常成纖維細胞表達，發(fā)現(xiàn)在成纖維細胞中也有這幾個基因的表達。地塞米松處理的小梁細胞轉(zhuǎn)化生長因子β產(chǎn)生增加，該細胞因子會促使小梁細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞[22]，而后者在膠原產(chǎn)生上起到關鍵作用。正常情況下，在組織受傷時肌成纖維細胞能一定程度修復缺失或損害細胞外基質(zhì)，促進膠原的產(chǎn)生、分泌及收縮，進而產(chǎn)生瘢痕，如果失調(diào)會發(fā)生纖維化的可能。此結(jié)果提示地塞米松處理后可能存在小梁細胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。

本研究嘗試尋找相關的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)BDKRB1、NID1、MFGE8和TAGLN這4個基因與SP1有關。SP1基因編碼的蛋白是含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞分化、轉(zhuǎn)化、生長和凋亡，免疫反應，對DNA損傷的反應和染色質(zhì)重塑[23]。ACTA2是肌成纖維細胞的標志物，Vimentin是肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物，本研究發(fā)現(xiàn)SP1同時也是這兩者的轉(zhuǎn)錄因子。雖然SP1在嚙齒類動物和人類胚胎的發(fā)育上起到關鍵作用，在正常組織中一般隨年齡增長下調(diào)，但在某些疾病，特別是腫瘤中發(fā)現(xiàn)SP1升高[24]。研究發(fā)現(xiàn)在無胸腺的小鼠中下調(diào)SP1能降低纖維肉瘤轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維瘤的風險[25]，另外，Jin等[26]發(fā)現(xiàn)SP1介導的微小RNA(microRNA，miR)-4295可靶向腫瘤抑制因子p63a mRNA的3'非翻譯區(qū)，抑制p63a翻譯，進而促進正常尿道上皮細胞往上皮腫瘤發(fā)展；致癌基因KRAS誘導MCF10a乳腺細胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是通過SP1介導對miR-200家族的抑制作用[27]，miR-200家族具有抑制Kras體外細胞轉(zhuǎn)化和體內(nèi)腫瘤形成的作用；在對葉酸抑制藥物培美曲塞耐藥的非小細胞肺癌A400細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，BMI1和SP1表達量較A549細胞上調(diào)，同時miR-145-5p下調(diào)，而SP1能促進間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生[28]。鑒于SP1在上述研究中具有間充質(zhì)轉(zhuǎn)化功能，提示SP1可能參與了地塞米松處理后小梁細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞的過程。

綜上所述，本研究通過一系列的生信工具找到地塞米松作用于小梁細胞后發(fā)生的變化，選取之前文獻未報道的結(jié)果綜合分析并關聯(lián)其上游新靶點，為地塞米松導致的激素性青光眼的治療提供了新的思路。然而生信分析的結(jié)果只是預測手段，仍需要更多實驗驗證該靶點的正確性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明劉麗玲：直接參與選題、醞釀和設計實驗、起草文章；李德玲：實施研究、采集數(shù)據(jù)；曾偉婷、張心怡：分析/解釋數(shù)據(jù)；徐建剛：修改文章；余敏斌：對文章知識性內(nèi)容的審閱和智力性內(nèi)容的修改及定稿等