AGTR1拮抗劑奧美沙坦對HTF凋亡的促進(jìn)作用及其機(jī)制

王麗君 李宏松 張文怡 邵美琳 任梅梅 王建明

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科，西安 710004

青光眼是全球主要的不可逆性致盲眼病[1]，青光眼濾過術(shù)(glaucoma filtration surgery，GFS)是藥物無法控制青光眼的主要治療手段，濾過道纖維化瘢痕是導(dǎo)致GFS手術(shù)失敗的主要原因[2-3]。目前臨床上使用的抑制GFS術(shù)后纖維化的藥物5-氟尿嘧啶和絲裂霉素C可能發(fā)生角膜失代償、濾過泡滲漏、低眼壓、低眼壓性黃斑病變等嚴(yán)重并發(fā)癥[4]。因此，亟需進(jìn)一步研究防治GFS術(shù)后纖維化的可行性靶點(diǎn)及藥物。GFS術(shù)后轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)在局部術(shù)區(qū)組織表達(dá)增加，TGF-β2是引發(fā)GFS術(shù)后結(jié)膜纖維化的有力刺激，TGF-β2誘導(dǎo)也是建立人Tenon囊成纖維細(xì)胞(human Tenon capsule fibroblasts，HTF)纖維化的經(jīng)典方法[5-6]。在TGF-β2刺激下，HTF轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞參與組織愈合，而肌成纖維細(xì)胞的增生激活、凋亡受抑制是導(dǎo)致GFS術(shù)后組織纖維化瘢痕形成的關(guān)鍵因素[6-8]。因此，HTF細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制是GFS術(shù)后纖維化瘢痕的研究重點(diǎn)。其次，研究已證實(shí)血管緊張素1型受體(angiotensin type 1 receptor，AGTR1)拮抗劑可以有效抑制心臟、肝臟、血管、皮膚等組織纖維化的發(fā)展[9-10]。奧美沙坦(olmesartan，OMS)是AGTR1拮抗劑家族成員之一，可以調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的凋亡[11-12]。研究證實(shí)，OMS可以增加頸動(dòng)脈內(nèi)膜凋亡細(xì)胞的數(shù)量，即可促進(jìn)內(nèi)膜細(xì)胞凋亡[11]。OMS可通過增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)，增加凋亡蛋白bax、caspase-3的表達(dá)，干預(yù)HeLa和MCF-7細(xì)胞的活性[12]，說明OMS可以調(diào)控組織細(xì)胞的凋亡。然而，OMS能否促進(jìn)HTF凋亡及其作用的分子調(diào)控機(jī)制目前尚未見報(bào)道。本研究采用TGF-β2誘導(dǎo)HTF纖維化，在細(xì)胞水平模擬GFS術(shù)后HTF的生物學(xué)變化，觀察OMS對HTF凋亡的作用，并探討其作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織來源 收集于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科行斜視手術(shù)的患者Tenon囊組織，患者年齡<18歲，無全身及其他眼部疾病史，既往無眼部手術(shù)史。研究方案經(jīng)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會審批[批文號：(2019)倫審一研第(014)號]。

1.1.2主要試劑及儀器 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；TGF-β2(美國PeproTech公司)；OMS、MTT(美國Sigma公司)；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)比色分析試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)分析試劑盒(武漢Elabscience公司)；兔源bax單克隆抗體(50599-2-Ig)、鼠源caspase-9/p35/p10單克隆抗體(66169-1-Ig)、鼠源GAPDH單克隆抗體(60004-1-Ig)、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(SA00001-1)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(SA00001-2)(美國Proteintech公司)；鼠源bcl-2單克隆抗體(BF9103)(美國Affinity公司)；鼠源vimentin單克隆抗體(sc-6260)(美國Santa Cruz公司)；DyLigh649標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(A23620)(美國Abbkine公司)。熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(德國BMG LABTECH公司)；流式細(xì)胞儀(美國ACEA Biosciences公司)。

1.2 方法

1.2.1原代HTF的離體培養(yǎng) 超凈臺內(nèi)無菌DMEM液沖洗組織塊，將組織剪成1～2 mm3組織塊，用含體積分?jǐn)?shù)20% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸組織塊，使組織塊自然、均勻地平鋪于培養(yǎng)皿，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞爬出至細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%時(shí)傳代。采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行HTF常規(guī)培養(yǎng)，取第3～7代HTF進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫熒光染色法鑒定原代HTF HTF為間質(zhì)來源細(xì)胞，vimentin為間質(zhì)來源細(xì)胞標(biāo)志物[13]，因此采用vimentin免疫熒光染色鑒定原代HTF。制作HTF細(xì)胞爬片，48 h后采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定15 min，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)潤洗爬片后采用體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton-X100通透細(xì)胞膜15 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%牛血清白蛋白封閉1 h，滴加vimentin一抗(1∶ 50)4 ℃過夜。次日，PBS潤洗細(xì)胞爬片后避光加入DyLigh649標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶ 200)，室溫放置1 h，DAPI染細(xì)胞核，抗熒光淬滅封片劑封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)鑒定原代HTF 將細(xì)胞分為對照組和vimentin標(biāo)記組。正常生長的HTF通過4%多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton X-100滲透15 min，體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清封閉30 min，vimentin標(biāo)記組加入vimentin一抗(1 μg/1×106cells)，對照組細(xì)胞用PBS代替vimentin一抗，室溫孵育2 h，避光加入DyLigh649標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶ 100)，室溫孵育30 min。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，根據(jù)對照組細(xì)胞設(shè)立M1區(qū)間，檢測vimentin標(biāo)記組細(xì)胞的M1峰，M1峰代表vimentin陽性細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)vimentin陽性細(xì)胞所占比例，評估所培養(yǎng)原代HTF的純度。

1.2.4MTT法檢測細(xì)胞增生率 MTT檢測0、10、20、40、80 μmol/L OMS干預(yù)48 h后HTF的增生活性。將HTF以3×103個(gè)/200 μl接種至96孔板中，每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，干預(yù)結(jié)束后，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO。酶標(biāo)儀測定波長490 nm處吸光度(absorbance，A)值。細(xì)胞相對增生率=處理組A值/對照組A值×100%。

1.2.5細(xì)胞分組及給藥 將細(xì)胞分為正常對照組、TGF-β2組、TGF-β2+OMS組和OMS組，其中正常對照組采用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HTF 48 h；TGF-β2組參照前期研究結(jié)果[14]，采用含10 ng/ml TGF-β2的2% FBS DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h；TGF-β2+OMS組采用含10 ng/ml TGF-β2和40 μmol/L OMS的2% FBS DMEM培養(yǎng)液共處理HTF 48 h；OMS組采用含40 μmol/L OMS的2% FBS DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HTF 48 h。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI染色檢測細(xì)胞凋亡情況 待細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化HTF，收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液于EP管中，1 000×g離心5 min，PBS重懸洗滌HTF；1 000×g離心5 min，每份樣品加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液、5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色液，室溫避光孵育20 min，4 ℃避光保存。流式細(xì)胞儀檢測HTF細(xì)胞凋亡率，Annexin V-FITC陽性為綠色熒光，PI陽性為紅色熒光，通過流式細(xì)胞儀檢測分析HTF早期及晚期細(xì)胞凋亡(壞死)率。Annexin V-FITC單陽性提示細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，Annexin V-FITC和PI雙陽性提示細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡(壞死)。

1.2.7Western blot法檢測目的蛋白相對表達(dá)量 細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后PBS輕柔沖洗3次，RIPA裂解液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% PMSF和磷酸酶抑制劑)冰上裂解細(xì)胞20 min后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。以蛋白裂解液樣品與5倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液體積比為4∶ 1混勻后100 ℃水浴加熱5 min。各組取20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80 V電泳約30 min，110 V電泳約120 min。采用200 mA恒流濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，根據(jù)目的蛋白相對分子質(zhì)量確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，孵育一抗[GAPDH(1∶ 50 000)、procaspase-9(1∶ 1 000)、cleaved caspase-9(1∶ 1 000)、bax(1∶ 2 000)、bcl-2(1∶ 1 000)]，4 ℃過夜；室溫孵育二抗(1∶ 5 000)1 h。ECL發(fā)光液觀察目的蛋白條帶，BioRad凝膠成像系統(tǒng)成像。采用ImageJ軟件分析目的蛋白灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.2.8比色法檢測LDH活性 干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞于EP管中，持續(xù)冰浴下超聲波破碎細(xì)胞(設(shè)置條件為：200 W，2 s/次，間隔3 s，總時(shí)間為5 min)，4 ℃條件下10 000×g離心10 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。96孔板中按照分組分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔和對照孔，根據(jù)LDH活性檢測說明，空白孔加入25 μl ddH2O，標(biāo)準(zhǔn)孔加入5 μl ddH2O和20 μl 0.2 μmol/mL丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品，測定孔加入20 μl待測樣本，對照孔加入5 μl ddH2O和20 μl待測樣本；各孔加入25 μl基質(zhì)液；測定孔加入5 μl輔酶I應(yīng)用液；37 ℃孵育15 min；各孔加入25 μl顯色劑，37 ℃孵育15 min；各孔加入250 μl堿溶液應(yīng)用液，靜置5 min。酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm處的A值，并計(jì)算LDH活性值。LDH活性值[μmol/(min·L)]=(測定孔A值-對照孔A值)/(標(biāo)準(zhǔn)孔A值-空白孔A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣本稀釋倍數(shù)/樣本蛋白濃度×1 000。

1.2.9比色法檢測SOD活性 樣品準(zhǔn)備同1.2.7，根據(jù)SOD活性檢測說明，96孔板中按照分組分別設(shè)置對照孔、對照空白孔、測定孔和測定空白孔，對照孔加入20 μl ddH2O和20 μl酶工作液，對照空白孔加入20 μl ddH2O和20 μl酶稀釋液，測定孔加入20 μl待測樣本和20 μl酶工作液，測定空白孔加入20 μl待測樣本和20 μl酶稀釋液；各孔加入200 μl底物應(yīng)用液，混勻；37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min。酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm處的A值，計(jì)算SOD活性值。SOD活性值[μmol/(min·L)]=[(對照孔A值-對照空白孔A值)-(測定孔A值-測定空白孔A值)]/(對照孔A值-對照空白孔A值)×100%/50%×(反應(yīng)液總體積/樣本體積)×樣本稀釋倍數(shù)/樣本蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 原代HTF的培養(yǎng)及鑒定

人Tenon囊組織塊貼壁后4～7 d,可見長梭形細(xì)胞從組織塊的周圍爬出，呈放射狀排列(圖1A)。Vimentin免疫熒光染色陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見與細(xì)胞長軸方向一致的紅色(DyLigh649標(biāo)記)束狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1B)，此結(jié)果符合HTF特性。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，原代細(xì)胞中vimentin表達(dá)陽性率大于99%(圖1C，D)，提示所培養(yǎng)的原代HTF純度較高。

圖1 原代HTF的培養(yǎng)及鑒定 A：HTF從組織塊周圍爬出(×40，標(biāo)尺=1 μm) B：原代細(xì)胞的vimentin免疫熒光鑒定(×200，標(biāo)尺=50 μm) Vimentin陽性呈紅色(DyLigh649標(biāo)記)，主要分布在細(xì)胞質(zhì)；細(xì)胞核由DAPI染色，呈藍(lán)色 C、D：流式細(xì)胞術(shù)檢測原代細(xì)胞中vimentin表達(dá)的陽性率(C：對照組；D：Vimentin標(biāo)記組)

2.2 不同濃度OMS作用于HTF細(xì)胞相對增生率比較

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對于0 μmol/L，10、20、40、80 μmol/L OMS干預(yù)HTF后48 h，HTF細(xì)胞相對增生率分別為(91.40±2.44)%、(92.31±2.94)%、(76.19±5.21)%和(78.33±3.71)%，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.22，P<0.05)，其中與0 μmol/L相比，10 μmol/L和20 μmol/L OMS作用于HTF細(xì)胞相對增生率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；40 μmol/L和80 μmol/L OMS作用于HTF細(xì)胞相對增生率明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)；40 μmol/L和80 μmol/L OMS作用于HTF細(xì)胞相對增生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用40 μmol/L OMS干預(yù)細(xì)胞(圖2)。

圖2 不同濃度AGTR1拮抗劑OMS作用于HTF細(xì)胞相對增生率比較 F=11.22，P<0.05.與0 μmol/L比較，aP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=6) OMS：奧美沙坦

2.3 各組細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率比較

正常對照組、TGF-β2組、TGF-β2+OMS組和OMS組細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.92、3.96、41.82，均P<0.05)，其中TGF-β2+OMS組早期凋亡率和總凋亡率較正常對照組和TGF-β2組明顯升高，TGF-β2+OMS組晚期凋亡率較正常對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖3，表1)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況 Annexin V-FITC單陽性為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI雙陽性為晚期凋亡(壞死)細(xì)胞 Q2-1：死亡細(xì)胞；Q2-2：晚期凋亡細(xì)胞；Q2-3：正常細(xì)胞；Q2-4：早期凋亡細(xì)胞 TGF：轉(zhuǎn)化生長因子；OMS：奧美沙坦

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較(x±s,%)Table 1 Comparison of apoptosis rate among four groups (x±s,%)組別樣本量早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率正常對照組184.65±0.791.59±0.246.24±0.77TGF-β2組185.96±0.433.91±0.519.87±0.45TGF-β2+OMS組1811.54±0.98ab4.28±1.16a15.82±1.09abOMS組184.43±0.402.34±0.336.77±0.28F值24.923.9641.82P值<0.05<0.05<0.05 注:與正常對照組比較,aP<0.05;與TGF-β2組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) TGF:轉(zhuǎn)化生長因子;OMS:奧美沙坦 Note:Compared with respective normal control group,aP<0.05;compared with respective TGF-β2 group,bP<0.05 (One-way ANO-VA,LSD-t test) TGF:transforming growth factor;OMS:olmesartan

2.4 各組細(xì)胞凋亡指標(biāo)caspase-9、bax和bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較

正常對照組、TGF-β2組、TGF-β2+OMS組和OMS組cleaved caspase-9/procaspase-9、bax、bax/bcl-2總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.40、7.98、4.61，均P<0.05)，其中TGF-β2+OMS組bax/bcl-2較正常對照組明顯升高，TGF-β2+OMS組cleaved caspase-9/procaspase-9、bax、bax/bcl-2較TGF-β2組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖4，表2)。

圖4 各組細(xì)胞凋亡指標(biāo)caspase-9、bax和bcl-2蛋白表達(dá)電泳圖 與TGF-β2組比較，TGF-β2+OMS組bax、cleaved caspase-9蛋白表達(dá)條帶增強(qiáng);各組procaspase-9、bcl-2蛋白表達(dá)條帶無明顯差異 1：正常對照組；2：TGF-β2組；3：TGF-β2+OMS組；4：OMS組 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶

表2 各組細(xì)胞凋亡指標(biāo)caspase-9、bax和bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of expression levels of caspase-9,bax and bcl-2 proteins in HTF among four groups (x±s)組別樣本量不同蛋白相對表達(dá)量procaspase-9cleaved caspase-9baxbcl-2cleaved caspase-9/procaspase-9bax/bcl-2正常對照組31.26±0.030.97±0.101.14±0.021.13±0.071.00±0.001.00±0.00TGF-β2組31.11±0.080.75±0.180.93±0.040.93±0.070.84±0.101.04±0.07TGF-β2+OMS組31.04±0.080.99±0.121.29±0.09b0.83±0.151.25±0.04b1.83±0.34abOMS組31.09±0.140.84±0.111.08±0.020.93±0.071.03±0.111.36±0.11F值1.090.767.981.654.404.61P值0.410.55<0.050.25<0.05<0.05 注:與正常對照組比較,aP<0.05;與TGF-β2組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) TGF:轉(zhuǎn)化生長因子;OMS:奧美沙坦 Note:Compared with respective normal control group,aP<0.05;compared with respective TGF-β2 group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) TGF:transforming growth factor;OMS:olmesartan

2.5 各組細(xì)胞LDH和SOD活性比較

LDH活性分析結(jié)果顯示，正常對照組、TGF-β2組、TGF-β2+OMS組、OMS組細(xì)胞LDH活性值分別為(783.99±79.97)、(913.16±196.86)、(2 529.06±240.21)、(2 134.29±138.96)μmol/(min·L)，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.95，P<0.05)，其中與正常對照組和TGF-β2組比較，TGF-β2+OMS組和OMS組LDH活性值明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。SOD活性分析結(jié)果顯示，正常對照組、TGF-β2組、TGF-β2+OMS組、OMS組細(xì)胞SOD活性值分別為(50.35±0.97)、(41.61±4.56)、(28.88±3.26)、(37.61±4.83)μmol/(min·L)，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.71，P<0.05)，其中TGF-β2+OMS組SOD活性值明顯低于正常對照組和TGF-β2組，OMS組SOD活性值明顯低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖5)。

圖5 各組細(xì)胞LDH和SOD活性值比較 A：各組LDH活性值比較 F=24.95，P<0.05.與正常對照組比較，aP<0.05；與TGF-β2組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=4) B：各組SOD活性值比較 F=5.71，P<0.05.與正常對照組比較，aP<0.05；與TGF-β2組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) 1：正常對照組；2：TGF-β2組；3：TGF-β2+OMS組；4：OMS組 LDH：乳酸脫氫酶；SOD：超氧化物歧化酶

3 討論

GFS失敗的機(jī)制較為復(fù)雜，濾過道纖維化是導(dǎo)致GFS失敗的主要原因[2,15]。在TGF-β2刺激下，HTF轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞參與組織愈合，而肌成纖維細(xì)胞的增生激活及凋亡受抑制是導(dǎo)致GFS術(shù)后纖維化的關(guān)鍵因素[6-8]。促進(jìn)HTF細(xì)胞凋亡是減輕GFS術(shù)后纖維化瘢痕的研究要點(diǎn)之一[16-17]。TGF-β2誘導(dǎo)是建立HTF細(xì)胞纖維化的經(jīng)典方法，本研究采用TGF-β2誘導(dǎo)HTF建立細(xì)胞纖維化模型，觀察AGTR1拮抗劑OMS對HTF凋亡的作用及其途徑。研究證明，OMS通過調(diào)控bax/bcl-2/caspase-9及氧化應(yīng)激途徑促進(jìn)HTF凋亡，為以AGTR1為靶點(diǎn)抑制GFS術(shù)后纖維化瘢痕提供了理論基礎(chǔ)。

既往研究中OMS作用于細(xì)胞的藥物濃度范圍在0.5～5 000 μmol/L[18-20]，考慮可能是不同組織、不同細(xì)胞中AGTR1表達(dá)差異較大導(dǎo)致藥物作用的有效濃度差異較大。本研究中為了篩選合適的OMS濃度，首先采用不同濃度OMS作用于HTF后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，檢測其對HTF細(xì)胞增生活性的影響，最終采用最小有效濃度為40 μmol/L的OMS干預(yù)HTF。

斜視手術(shù)患者的Tenon囊組織是研究中廣泛選擇的HTF原代細(xì)胞培養(yǎng)的組織來源[21-22]，主要原因是斜視手術(shù)患者年齡普遍偏小，相對于白內(nèi)障、青光眼等患者的Tenon囊組織進(jìn)行原代HTF細(xì)胞培養(yǎng)的成功率較高；其次，青光眼患者由于在術(shù)前常使用降眼壓類藥物，且不同患者術(shù)前的治療方案存在差異，使此類患者Tenon囊組織的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞特性均存在較大差異。本研究中選擇的是既往無眼部手術(shù)史、無全身及其他眼部疾病史的斜視患者，所選患者的基線情況一致，患者Tenon囊組織的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞特性一致性較高，從而保證研究的可重復(fù)性。

肌成纖維細(xì)胞凋亡受抑制是導(dǎo)致GFS術(shù)后組織纖維化瘢痕形成的關(guān)鍵因素[8]。手術(shù)傷口愈合過程中，局部組織釋放的TGF-β、血管內(nèi)皮生長因子、結(jié)締組織生長因子等細(xì)胞因子誘導(dǎo)HTF轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞參與組織愈合，多種細(xì)胞因子共同作用促進(jìn)組織細(xì)胞的增生及細(xì)胞外基質(zhì)的過度合成、分泌，肌成纖維細(xì)胞持續(xù)存在會導(dǎo)致組織收縮及纖維化瘢痕[8]，肌成纖維細(xì)胞的增生激活及凋亡減少是GFS術(shù)后組織纖維化瘢痕形成的關(guān)鍵因素[6-7]。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞質(zhì)和染色質(zhì)濃縮、核碎裂，并產(chǎn)生凋亡小體。細(xì)胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸會從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，Annexin V染色陽性提示磷脂酰絲氨酸外翻這一重要的細(xì)胞早期凋亡特征，而凋亡晚期細(xì)胞(壞死細(xì)胞)會喪失細(xì)胞膜的完整性，PI進(jìn)入細(xì)胞呈陽性染色，利用該特點(diǎn)可采用Annexin V/PI熒光染色檢測細(xì)胞早期及晚期凋亡率。本研究中OMS通過誘導(dǎo)HTF早期凋亡來促進(jìn)HTF凋亡。其次，OMS干預(yù)使HTF纖維化模型細(xì)胞的早期凋亡率及總凋亡率升高，而OMS干預(yù)對正常HTF細(xì)胞的凋亡率無明顯影響，提示OMS可以促進(jìn)模型細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞凋亡的作用不顯著，即OMS可能僅作用于已纖維化的HTF，但其局部應(yīng)用的組織安全性有待進(jìn)一步行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

細(xì)胞凋亡主要由線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路介導(dǎo)，其中脊椎動(dòng)物細(xì)胞凋亡過程主要由線粒體通路介導(dǎo)。細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因子(如細(xì)胞超氧化物損傷等)刺激后激活bax，使其發(fā)生寡聚化并插入線粒體膜，引起線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)，Cyt C與凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)形成多聚復(fù)合體，該復(fù)合物可以募集胞質(zhì)中的procaspase-9，使其剪切活化為cleaved caspase-9，然后激活下游的caspase-3、caspase-7，引起細(xì)胞凋亡。Caspase-9是caspase順序激活級聯(lián)反應(yīng)中最早的一步，因此cleaved caspase-9是細(xì)胞凋亡線粒體途徑的起動(dòng)分子。Bcl-2表達(dá)于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，通過阻止Cyt C從線粒體釋放，或通過與Apaf-1結(jié)合來抑制caspase活性，對細(xì)胞凋亡起到抑制作用。Bax/bcl-2的比值及cleaved caspase-9/procaspase-9的比值增加起到正向促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[23]。HTF細(xì)胞凋亡受抑制是GFS術(shù)后組織瘢痕化的重要機(jī)制，有研究者通過分析HTF細(xì)胞中caspase-3/caspase-9/Apaf-1信號通路、ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及線粒體膜電位的變化研究氧化鋅納米顆粒對HTF細(xì)胞凋亡的影響[16]。一項(xiàng)關(guān)于人GFS術(shù)后濾過泡細(xì)胞學(xué)和免疫學(xué)的研究表明，GFS術(shù)后局部組織細(xì)胞凋亡與組織基質(zhì)的分解和促凋亡信號的釋放有關(guān)，這些信號可以通過誘導(dǎo)代謝活性細(xì)胞的凋亡來抑制膠原合成[17]。本研究中，OMS增加了HTF纖維化模型細(xì)胞cleaved caspase-9/procaspase-9、bax/bcl-2的比值，提示OMS可能通過干預(yù)bax/bcl-2/caspase-9介導(dǎo)的線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

氧化-抗氧化系統(tǒng)作為細(xì)胞凋亡線粒體途徑激活的上游，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。多種組織細(xì)胞的研究結(jié)果表明，氧化-抗氧化系統(tǒng)參與細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，介導(dǎo)組織細(xì)胞損傷、修復(fù)及凋亡的發(fā)生和發(fā)展，氧化-抗氧化系統(tǒng)是研究已明確的細(xì)胞凋亡線粒體途徑激活的上游機(jī)制[24-27]。ROS、LDH、SOD、谷胱甘肽參與的氧化應(yīng)激介導(dǎo)了硅殼納米顆粒誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性[25]。ROS及SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶在內(nèi)的抗氧化酶活性與H2O2誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中caspase-3活化、LDH釋放和細(xì)胞凋亡有關(guān)[26]。LDH是一種氧化還原酶，在組織細(xì)胞損傷后活性增加。SOD可以保護(hù)細(xì)胞免受過量超氧化物的損害[23]。因此，LDH和SOD是評價(jià)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的重要指標(biāo)。本研究中，OMS增加了HTF纖維化模型細(xì)胞的LDH活性，抑制了SOD活性，提示OMS可能通過干預(yù)細(xì)胞氧化應(yīng)激系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

OMS目前作為一線降壓藥物廣泛應(yīng)用于臨床，具有較高的人體組織安全性。其次，臨床及基礎(chǔ)研究已證實(shí)OMS可以有效抑制心臟、肝臟、血管、皮膚等組織的纖維化發(fā)展[9-10]。并且，OMS可以調(diào)控組織細(xì)胞凋亡。OMS也可以增加頸動(dòng)脈內(nèi)膜TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量，即可促進(jìn)內(nèi)膜細(xì)胞凋亡[11]。OMS通過增加ROS和凋亡蛋白bax、caspase-3的表達(dá)干預(yù)HeLa和MCF-7細(xì)胞的活性[12]。本研究中，OMS可以呈濃度依賴性地抑制HTF的增生活性，通過誘導(dǎo)HTF早期凋亡來促進(jìn)HTF纖維化模型細(xì)胞的凋亡，但OMS在局部組織應(yīng)用的有效性仍有待進(jìn)一步進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本研究聚焦于細(xì)胞水平開展實(shí)驗(yàn)，缺乏在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，下一步將在動(dòng)物水平探討OMS局部應(yīng)用的組織安全性及在GFS術(shù)后局部組織應(yīng)用促進(jìn)組織細(xì)胞凋亡的有效性。另外，本研究僅探索了OMS促進(jìn)HTF細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制，下一步將深入探討OMS促進(jìn)HTF細(xì)胞凋亡過程中bax、bcl-2、caspase-9的具體分子調(diào)控機(jī)制及其促進(jìn)HTF細(xì)胞凋亡的其他機(jī)制。局部炎癥反應(yīng)、炎癥因子的表達(dá)變化也是GFS術(shù)后瘢痕形成的重要因素之一，并且局部炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡存在明確的信號交互作用，未來我們將進(jìn)一步開展這方面的研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示AGTR1拮抗劑OMS可以有效促進(jìn)HTF纖維化模型細(xì)胞的凋亡，線粒體凋亡途徑及氧化應(yīng)激途徑可能是OMS調(diào)控細(xì)胞凋亡過程的潛在機(jī)制。本研究創(chuàng)新性地探索了OMS促進(jìn)HTF細(xì)胞凋亡的作用途徑，闡釋了bax/bcl-2/caspase-9途徑在OMS調(diào)節(jié)HTF凋亡中的作用，為干預(yù)HTF凋亡介導(dǎo)的GFS術(shù)后纖維化瘢痕形成提供了新思路，同時(shí)為OMS作為潛在防治GFS術(shù)后瘢痕化的新方式提供了分子理論依據(jù)。本研究結(jié)果為以AGTR1為靶點(diǎn)抑制GFS術(shù)后纖維化提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，但該作用在GFS術(shù)后的實(shí)際效果仍需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)論證。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明王建明：參與選題、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、指導(dǎo)研究過程、文章主要內(nèi)容修改和定稿；王麗君：參與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫及修改和定稿；李宏松、張文怡、邵美琳、任梅梅：參與實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析和起草文章