敲低NLRP12對高眼壓大鼠RGCs的保護(hù)作用及其抑制細(xì)胞焦亡的機(jī)制

宋偉瓊 何芳 杜玲芳 譚華霞 劉丹

1湖南省郴州市第一人民醫(yī)院眼科，郴州423000；2中南大學(xué)湘雅醫(yī)院眼科，長沙410078

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)死亡是青光眼致盲或視野缺損的潛在病理機(jī)制[1]。年齡是青光眼的主要危險因素，而目前認(rèn)為眼壓升高是關(guān)鍵的可變危險因素[2-3]。而且，通過手術(shù)或藥物降低眼壓可將視網(wǎng)膜損傷和漸進(jìn)性視野喪失的發(fā)生率降低近一半[3]，從而確立了降低眼壓是治療青光眼的有效方法。高眼壓會導(dǎo)致細(xì)胞毒性因子和退化因子的產(chǎn)生。其中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一種促炎細(xì)胞因子，在青光眼患者和青光眼模型大鼠的視盤中檢測到TNF-α及其受體表達(dá)升高，而且TNF-α介導(dǎo)了高眼壓對RGCs的細(xì)胞毒性作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域12(NOD-like receptors family pyrin domain containing 12，NLRP12)在調(diào)節(jié)自身炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[5-6]。Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在促進(jìn)促炎細(xì)胞因子表達(dá)方面具有關(guān)鍵作用[7]。NLRP12可以通過激活caspase-1誘發(fā)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞焦亡和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)成熟，促進(jìn)青光眼的RGCs死亡和神經(jīng)炎癥[7]。然而，在高眼壓中NLRP12能否通過激活caspase-1調(diào)控RGCs炎癥及阻斷NLRP12/caspase-1信號對高眼壓環(huán)境下視網(wǎng)膜損傷是否具有改善作用尚不清楚。本研究擬探討高眼壓造成大鼠RGCs損傷的炎性機(jī)制，研究敲低NLRP12對RGCs的影響及其作用機(jī)制，為青光眼視神經(jīng)損傷的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細(xì)胞來源 8～10周齡成年雄性SPF級SD大鼠70只，體質(zhì)量200～300 g，購自西安交通大學(xué)動物實驗中心。大鼠在12 h光/暗循環(huán)中飼養(yǎng)，可自由獲取水和食物。所有動物實驗均遵循視覺與眼科研究協(xié)會關(guān)于在眼科和視力研究中使用動物的聲明，并獲得湖南省郴州市第一人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(批文號：2020086)。大鼠RGCs(CP-R122)購于武漢普諾賽公司。

1.1.2主要試劑及儀器 兔抗大鼠NLRP12抗體(#A6671)、兔抗大鼠caspase-1抗體(#A0964)(美國ABclonal Biotech公司)；兔抗大鼠cleaved-caspase-1抗體(YC0002)、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(YM3029)(美國Immunoway公司)；山羊抗兔二抗(美國Bioworld Technology公司)；兔抗大鼠β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)抗體(ab18207)，Alexa Fluor 488偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(ab150077)，IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國Abcam公司)；靶向大鼠NLRP12的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)(上海吉瑪公司)；Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)；活性重組大鼠caspase-1(rat recombinant caspase-1,rrcaspase-1)(7524-100)(美國Biovision公司)；氯胺酮、甲苯噻嗪(美國Phoenix Scientific公司)；蘇木精-伊紅染色試劑盒、RIPA裂解液(上海碧云天公司)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(美國eBioscience公司)。眼科燒灼器(美國Rumex國際公司)；眼壓計(TV02，芬蘭TonoLab公司)；RM2235型石蠟切片機(jī)、Leica DM2000生物顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1常規(guī)培養(yǎng)大鼠RGCs及分組處理 采用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RGCs，將細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)5～7 d。RGCs到達(dá)對數(shù)生長期后，將其分為對照組、rrcaspase-1組、siRNA陰性對照(siRNA negative control，siNC)+rrcaspase-1組、siNLRP12+rrcaspase-1組，其中rrcaspase-1組、siNC+rrcaspase-1組、siNLRP12+rrcaspase-1組分別采用加入rrcaspase-1(2 μg/ml)、siNC+rrcaspase-1(2 μg/ml)和siNLRP12(20 μmol/L)+rrcaspase-1(2 μg/ml)試劑的含Lipofectamine 3000的DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，對照組不予處理。去除各組細(xì)胞培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次，免疫固定液室溫固定15 min，PBS洗滌5次，每次10 min；室溫下用免疫染色封閉緩沖液將RGCs封閉1 h，并在4 ℃下用以1∶ 500稀釋的抗β-tubulin Ⅲ一抗孵育過夜。用PBS洗滌3次，每次5 min，將細(xì)胞用熒光二抗(1∶ 1 000)在室溫下孵育2 h。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

1.2.2大鼠高眼壓模型建立及分組處理 采用氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)肌內(nèi)注射全身麻醉大鼠。采用隨機(jī)數(shù)字表法將70只大鼠分為對照組、高眼壓組、高眼壓+siNC組、高眼壓+siNLRP12組和高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組，每組14只。于右眼建模，參照文獻(xiàn)[8-9]的方法通過鞏膜外靜脈燒灼術(shù)誘發(fā)高眼壓模型。通過角膜緣周邊的結(jié)膜和Tenon囊做1個切口。右眼鞏膜外靜脈通過其相對于眼外肌的位置來識別，其中2條背靜脈和1條顳腹靜脈在手術(shù)顯微鏡下用手持眼科燒灼器進(jìn)行燒灼。對照組大鼠僅接受右眼結(jié)膜切口處理，不進(jìn)行燒灼。成功的高眼壓模型被定義為眼壓升高大于基線眼壓的30%，并且鞏膜外靜脈燒灼術(shù)后沒有與燒灼相關(guān)的并發(fā)癥。高眼壓+siNC組、高眼壓+siNLRP12組和高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組建立高眼壓模型后立即分別給予尾靜脈注射0.2 ml siNC、siNLRP12(20 μmol/L)和siNLRP12(20 μmol/L)+rrcaspase-1(2 μg/ml)試劑。

1.2.3siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染 通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得NLRP12的基因序列CCAAATGGAGACCCTCTTT。RGCs接種至6孔板，待RGCs長至70%融合后，將siRNA加入含Lipofectamine 3000的DMEM培養(yǎng)基并替換原來的培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞24 h。隨后收集細(xì)胞抽提細(xì)胞總蛋白，采用Western blot法檢測NLRP12的表達(dá)量評估轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4大鼠眼壓測量 鞏膜外靜脈燒灼術(shù)后1 d、1周、2周、3周，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%鹽酸丙胺卡因滴眼液局部麻醉大鼠，測量大鼠右眼眼壓，若峰值眼壓高于基線或<6 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或發(fā)生角膜潰瘍、前房積血及其他眼部病變，則將大鼠排除，同時補(bǔ)充大鼠至基線數(shù)量。

1.2.5蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu) 造模后3周，采用隨機(jī)數(shù)字表法每組選擇3只大鼠，腹腔內(nèi)注射3倍麻醉劑量的巴比妥鈉進(jìn)行安樂死。左手抓住小鼠頸部皮膚，輕壓在實驗臺上，取側(cè)臥位，左手食指盡量將小鼠眼周皮膚往頸后壓，使眼球突出。用眼科彎鑷迅速夾出完整眼球，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定10 min，沿角鞏膜剪開眼球，去除角膜和晶狀體，用2把顯微鑷夾住鞏膜緣，并用鑷子蛻去鞏膜，用濾紙吸干房水和殘余玻璃體，輕輕保留視網(wǎng)膜。視網(wǎng)膜組織用石蠟包埋保存。沿矢狀面切片，每個組織制備3個視網(wǎng)膜組織切片，厚度為5 μm，用蘇木精-伊紅染色試劑盒進(jìn)行染色。使用Leica DM2000生物顯微鏡觀察切片，觀察區(qū)域為內(nèi)界膜至外界膜且距離視神經(jīng)1 mm內(nèi)，并獲取該區(qū)域圖片。由2名獨(dú)立的觀察者利用ImageJ 1.8.0軟件中的計數(shù)模塊獲得各組圖片中細(xì)胞核(紫藍(lán)色)的數(shù)量即為視網(wǎng)膜細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6Western blot法檢測RGCs和視網(wǎng)膜組織中NLRP12、caspase-1、cleaved-caspase-1蛋白表達(dá)水平 大鼠造模后3周，采用隨機(jī)數(shù)字表法各組選取3只大鼠，參照1.2.5部分提取大鼠視網(wǎng)膜組織。提取1.2.1部分RGCs和視網(wǎng)膜組織總蛋白，其中RGCs在冰浴中超聲破碎10 s，共3次，4 ℃下離心半徑6.5 cm，12 000 r/min離心15 min，收集上清，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。采用RIPA裂解液(強(qiáng))裂解視網(wǎng)膜組織，離心收集上清液及蛋白定量方法同RGCs。將等量的蛋白質(zhì)(RGCs為50 μg，視網(wǎng)膜組織為100 μg)加樣到SDS-PAGE凝膠上并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用TBST稀釋的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃下兔抗大鼠NLRP12抗體(1∶ 200)、caspase-1抗體(1∶ 200)、cleaved-caspase-1抗體(1∶ 500)、GAPDH抗體(1∶ 1 000)孵育過夜；次日，洗膜后用相應(yīng)二抗(1∶ 5 000)在室溫下孵育1 h，用ECL試劑盒觀察條帶并用Image Lab成像系統(tǒng)記錄，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。目的蛋白相對表達(dá)水平=(處理組目標(biāo)灰度值/內(nèi)參灰度值)/(對照組目標(biāo)灰度值/內(nèi)參灰度值)。

1.2.7ELISA法檢測大鼠血清和RGCs培養(yǎng)物上清中TNF-α及IL-1β質(zhì)量濃度 收取各組培養(yǎng)RGCs的上清液和造模3周后14只大鼠靜脈血清，用預(yù)冷PBS洗滌，離心半徑15 cm，1 500 r/min離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新管中，分別使用TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒檢測TNF-α和IL-1β表達(dá)水平。使用96孔板分光光度計測量450 nm處的吸光度(A)值。通過與同時生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，將A值轉(zhuǎn)換為TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理(對照組數(shù)值化為1)得到TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度變化的相對值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組RGCs培養(yǎng)

對照組、rrcaspase-1組、siNC+rrcaspase-1組、siNLRP12+rrcaspase-1組RGCs均被帶有綠色熒光的β-tubulin Ⅲ抗體所標(biāo)記(圖1)。

圖1 各組β-tubulin Ⅲ標(biāo)記的RGCs(Alexa Fluor 488 ×200，標(biāo)尺=20 μm) 綠色熒光為β-tubulin Ⅲ標(biāo)記RGCs A：對照組 B：rrcaspase-1組 C：siNC+rrcaspase-1組 D：siNLRP12+rrcaspase-1組

2.2 對照組和高壓眼組大鼠術(shù)后不同時間點眼壓比較

對照組和高眼壓組術(shù)后不同時間點眼壓總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F分組=128.255，P<0.001；F時間=92.562，P<0.001)，其中與對照組比較，術(shù)后1、2、3周高眼壓組眼壓高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和RGCs數(shù)量比較

對照組視網(wǎng)膜各層組織清晰，RGCs呈單層排列，高眼壓組和高眼壓+siNC組RGCs層松散，視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層變薄。高眼壓+siNLRP12組視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層較高眼壓組增厚，高眼壓+siNLRP12組和高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組RGCs層松散(圖2)。

表1 術(shù)后不同時間點各組大鼠眼壓比較(x±s,mmHg)Table 1 Comparison of intraocular pressure of rats at different time points between control group and high IOP group (x±s,mmHg)組別樣本量1 d1周2周3周對照組1414.67±0.8414.63±1.2514.54±1.6214.42±0.30高眼壓組1414.84±0.7521.69±5.07a27.61±4.06a47.62±12.73a 注:F分組=128.255,P<0.001;F時間=92.562,P<0.001.與同時間點對照組比較,aP<0.05(重復(fù)測量兩因素方差分析,LSD-t檢驗) 1 mmHg=0.133 kPa Note:Fgroup=128.255,P<0.001;Ftime=92.562,P<0.001.Compared with control group at cor-responding time points,aP<0.05 (Repeated measures two-way ANOVA,LSD-t test) 1 mmHg=0.133 kPa

圖2 NLRP12敲低后各組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)(HE ×200，標(biāo)尺=50 μm) A：對照組視網(wǎng)膜各層組織清晰，RGCs呈單層排列 B：高眼壓組RGCs層松散，視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層變薄 C：高眼壓+siNC組RGCs層松散，視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層變薄 D：高眼壓+siNLRP12組RGCs層松散，內(nèi)叢狀層較高眼壓組變厚 E：高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組RGCs層松散

對照組、高眼壓組、高眼壓+siNC組、高眼壓+siNLRP12組和高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組RGCs數(shù)量分別為(119.31±23.25)、(89.19±16.98)、(88.87±13.92)、(109.33±10.25)、(92.89±12.58)個，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=201.932，P<0.001)，其中高眼壓組、高眼壓+siNC組、高眼壓+siNLRP12組和高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組RGCs數(shù)量少于對照組，高眼壓+siNLRP12組RGCs數(shù)量多于高眼壓+siNC組，高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組RGCs數(shù)量少于高眼壓+siNLRP12組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP12表達(dá)、caspase-1活化及炎癥因子表達(dá)水平比較

蛋白電泳結(jié)果顯示，與對照組比較，高眼壓組、高眼壓+siNC組高眼壓+siNLRP12組和高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白條帶表達(dá)強(qiáng)度增加高眼壓組、高眼壓+siNC組、高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組NLRP12蛋白條帶表達(dá)強(qiáng)度增加，高眼壓+siNLRP12組NLRP12蛋白條帶表達(dá)強(qiáng)度減弱；與高眼壓組比較，高眼壓+siNLRP12組和高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組NLRP12、caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白條帶表達(dá)強(qiáng)度減弱(圖3)。各組大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP12、caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相對表達(dá)量及TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度總體比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=139.022、36.981、69.587、96.065、103.223，均P<0.05)，其中高眼壓組、高眼壓+siNC組、高眼壓+siNLRP12組和高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相對表達(dá)量及TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度較對照組升高，高眼壓+siNLRP12組較高眼壓+siNC組降低，高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組較高眼壓+siNLRP12組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

圖3 Western blot法檢測術(shù)后3周大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP12、cleaved-caspase-1和caspase-1表達(dá) 1：對照組；2：高眼壓組；3：高眼壓+siNC組；4：高眼壓+siNLRP12組；5：高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組 NLRP：NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.5 各組RGCs中NLRP12表達(dá)、caspase-1活化及炎癥因子表達(dá)水平比較

蛋白電泳結(jié)果顯示，與對照組比較，rrcaspase-1組cleaved-caspase-1條帶表達(dá)強(qiáng)度明顯增加，NLRP12條帶表達(dá)強(qiáng)度變化不明顯。與siNC+rrcaspase-1組比較，siNLRP12+rrcaspase-1組cleaved-caspase-1及NLRP12蛋白條帶表達(dá)強(qiáng)度降低(圖4)。各組RGCs中NLRP12、caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相對表達(dá)量及TNF-α和IL-1β相對質(zhì)量濃度總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=56.302、106.286、108.629、95.305、68.207，均P<0.05)，其中rrcaspase-1組、siNC+rrcaspase-1組caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相對表達(dá)量較對照組升高，siNLRP12+rrcaspase-1組NLRP12、caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相對表達(dá)量較對照組降低，rrcaspase-1組、siNC+rrcaspase-1組、siNLRP12+rrcaspase-1組TNF-α和IL-1β相對質(zhì)量濃度較對照組升高，siNLRP12+rrcaspase-1組NLRP12、caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相對表達(dá)量及TNF-α和IL-1β相對質(zhì)量濃度較siNC+rrcaspase-1組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表3)。

圖4 Western blot法檢測RGCs中NLRP12、caspase-1和cleaved-caspase-1表達(dá) 1：對照組；2：rrcaspase-1組；3：siNC+rrcaspase-1組；4：siNLRP12+rrcaspase-1組 NLRP：NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP12、caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相對表達(dá)量及TNF-α和IL-1β相對表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of NLRP12,caspase-1 and cleaved-caspase-1 expressions and relative expression levels of TNF-α and IL-1β in rat retinal tissues among various groups (x±s)組別樣本量NLRP12caspase-1cleaved-caspase-1TNF-αIL-1β對照組31.00±0.011.00±0.001.00±0.021.00±0.021.00±0.03高眼壓組32.12±0.09a1.37±0.07a3.62±0.42a6.55±0.06a3.57±0.08a高眼壓+siNC組32.11±0.11a1.35±0.09a3.59±0.39a6.56±0.10a3.55±0.06a高眼壓+siNLRP12組30.73±0.02ab1.08±0.02ab1.53±0.07ab4.87±0.11ab2.48±0.02ab高眼壓+siNLRP12+rrcaspase-1組31.26±0.06ac1.25±0.10ac2.45±0.28ac6.24±0.06ac3.27±0.03acF值139.02236.98169.58796.065103.223P值<0.0010.0200.009<0.001<0.001 注:與對照組比較,aP<0.05;與高眼壓+siNC組比較,bP<0.05;與高眼壓+siNLRP12組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) NL-RP:NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域;TNF:腫瘤壞死因子;IL:白細(xì)胞介素;siNC:小干擾RNA陰性對照;rrcaspase-1:重組大鼠caspase-1 Note:Compared with control group,aP<0.05;compared with high IOP+siNC group, bP<0.05;compared with high IOP+siNLRP12 group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) NLRP:NOD-like receptors family pyrin domain containing;TNF:tumor necrosis factor;IL:interleukin;siNC:small interfering RNA negative control;rrcaspase-1:rat recombinant caspase-1

表3 各組RGCs中NLRP12、caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相對表達(dá)量及TNF-α和IL-1β相對表達(dá)量比較(x±s)Table 3 Comparison of NLRP12,caspase-1 and cleaved-caspase-1 expressions and relative expression levels of TNF-α and IL-1β in RGCs among various groups (x±s)組別樣本量NLRP12caspase-1cleaved-caspase-1TNF-αIL-1β對照組31.00±0.011.00±0.021.00±0.041.00±0.011.00±0.02rrcaspase-1組30.99±0.021.40±0.06a2.68±0.19a3.59±0.32a2.38±0.26asiNC+rrcaspase-1組31.01±0.011.45±0.07a2.75±0.13a3.64±0.25a2.45±0.34asiNLRP12+rrcaspase-1組30.01±0.00ab0.76±0.10ab0.51±0.14ab2.67±0.19ab1.80±0.29abF值56.302106.286108.62995.30568.207P值0.019<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與對照組比較,aP<0.05;與siNC+rrcaspase-1組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) NLRP:NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域;TNF:腫瘤壞死因子;IL:白細(xì)胞介素;rrcaspase-1:重組大鼠caspase-1;siNC:小干擾RNA陰性對照 Note:Compared with control group,aP<0.05;Compared with siNC+rrcaspase-1 group, bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) NLRP:NOD-like receptors family pyrin domain containing;TNF:tumor necrosis factor;IL:interleukin;rrcaspase-1:rat recombinant caspase-1;siNC:small interfering RNA negative control

3 討論

本研究證實，在RGCs中激活caspase-1對NLRP12表達(dá)的影響不明顯，但明顯增強(qiáng)RGCs的炎癥水平；敲低NLRP12可以通過下調(diào)NLRP12表達(dá)抑制caspase-1活化，并減輕高眼壓對視網(wǎng)膜的損傷和RGCs的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果鞏固了青光眼中RGCs損傷和炎癥與NLRP12/caspase-1信號的聯(lián)系。另外，國內(nèi)外通過高眼壓大鼠接受siRNA轉(zhuǎn)染改變目標(biāo)基因用于探討RGCs損傷和炎癥機(jī)制的研究尚不多見。本研究表明敲低NLRP12可抑制高眼壓大鼠血清TNF-α和IL-1β的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)和RGCs損失。本研究結(jié)果為青光眼疾病的治療提供了關(guān)鍵靶點。

青光眼是亞洲人群中常見的眼病，其特點是眼壓突然大幅升高、嚴(yán)重眼痛和不可逆性視力喪失，可發(fā)展為永久性盲[10-11]。眼壓的快速升高可導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷和RGCs死亡[12]。當(dāng)血管破裂引起的缺血/缺氧導(dǎo)致氧氣和葡萄糖缺乏時，視網(wǎng)膜變得脆弱，隨后引發(fā)一系列炎癥過程[13]。研究證實，高眼壓誘導(dǎo)的缺血會引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥，從而介導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷和RGCs死亡[14-17]。視網(wǎng)膜缺血不僅直接誘導(dǎo)RGCs死亡，還會通過觸發(fā)損傷相關(guān)分子模式誘導(dǎo)的Toll樣受體4炎癥小體依賴性神經(jīng)炎癥以激活小膠質(zhì)細(xì)胞，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)RGCs死亡[18-20]。盡管如此，目前仍缺乏對青光眼的有效治療方案。而且關(guān)于高眼壓中RGCs神經(jīng)炎癥發(fā)生機(jī)制的研究仍較少，因此需要更深入地了解潛在的神經(jīng)炎癥機(jī)制，以確定青光眼治療的關(guān)鍵目標(biāo)。

本研究通過鞏膜外靜脈燒灼術(shù)升高眼壓，導(dǎo)致視神經(jīng)軸突退化并最終喪失RGCs。研究表明，鞏膜外靜脈燒灼術(shù)誘導(dǎo)的眼壓升高導(dǎo)致TNF-α水平在3 d內(nèi)升高，7 d時水平比正常高17倍，并至少保持升高4周[21]。另外，多項研究證實青光眼患者視網(wǎng)膜和視盤中TNF-α水平升高[22-23]。本研究與這些研究的結(jié)果一致，通過ELISA法觀察到大鼠血清中TNF-α濃度明顯升高。另外，IL-1β是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要炎癥介質(zhì)[24]，而且成熟IL-1β和NLRP12之間發(fā)生相互作用，從而放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)[7]。另外，脂多糖誘導(dǎo)的實驗性炎性高眼壓青光眼模型中，TNF-α和IL-1β水平同樣升高[25]，因此，結(jié)合本研究通過蘇木精-伊紅染色觀察到的RGCs損傷可知本研究成功建立了高眼壓模型，其特征是導(dǎo)致明顯的視網(wǎng)膜炎癥和RGCs損失。

Caspase-1介導(dǎo)一種新的程序性裂解細(xì)胞死亡形式，即細(xì)胞焦亡，其特征是細(xì)胞腫脹、單層脂質(zhì)體中的孔形成、膜破裂和炎性細(xì)胞因子的釋放[26-29]。研究發(fā)現(xiàn)NLRP12是調(diào)控腸道微生物群紊亂導(dǎo)致炎癥疾病的關(guān)鍵[5-6]。NLRP12通過體內(nèi)和體外的caspase-1依賴性啟動細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致炎癥水平升高[7]。而且，Truax等[30]觀察到NLRP12可以激活核因子κB炎癥信號通路依賴的促炎癥因子加工。本研究觀察到rrcaspase-1處理的RGCs中炎癥因子水平上調(diào)，而敲低NLRP12后觀察到無論血清水平還是RGCs水平，TNF-α和IL-1β濃度均明顯降低，證實NLRP12在高眼壓大鼠中是促炎的關(guān)鍵原因之一。另外，NLRP12基因缺失顯著減輕了RGCs丟失和視網(wǎng)膜損傷的嚴(yán)重程度，證實NLRP12激活是青光眼視網(wǎng)膜缺血性損傷的觸發(fā)因素[7]。本研究使用siRNA敲低NLRP12，不僅觀察到其抑制了高眼壓大鼠的視網(wǎng)膜細(xì)胞損失，還觀察到caspase-1的活性模式cleaved-caspase-1的表達(dá)水平被明顯抑制，而當(dāng)重新補(bǔ)充rrcaspase-1后高眼壓大鼠的視網(wǎng)膜細(xì)胞損失和炎癥因子TNF-α和IL-1β質(zhì)量濃度均明顯升高。這表明減少NLRP12表達(dá)可能是治療高眼壓大鼠視網(wǎng)膜損傷的有效手段，其機(jī)制是通過抑制caspase-1的激活。

本研究鞏膜外靜脈燒灼術(shù)操作簡單，眼壓升高重復(fù)性好，盡管本實驗中成功造模，造模后未見異常，但不排除眼內(nèi)局部存在淤血及缺血的風(fēng)險。另外，盡管敲低NLRP12對高眼壓大鼠RGCs數(shù)量的保護(hù)作用以及對高眼壓中炎癥因子TNF-α和IL-1β表達(dá)有抑制作用，但是敲低NLRP12對RGCs數(shù)量的保護(hù)作用和對TNF-α和IL-1β表達(dá)的抑制作用似乎僅有部分作用效果，因此可能仍存在其他調(diào)控機(jī)制，需要進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本研究得出與高眼壓中視網(wǎng)膜損傷和RGCs炎癥相關(guān)的新機(jī)制。我們認(rèn)為，敲低NLRP12可抑制RGCs的缺失和炎癥反應(yīng)，減輕視網(wǎng)膜組織損傷的嚴(yán)重程度，而且敲低NLRP12對caspase-1激活的抑制作用是其核心機(jī)制。表明抑制NLRP12/caspase-1誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可能是治療青光眼的潛在策略，為青光眼治療提供新的治療靶點。本研究也為將來NLRP12/caspase-1抑制劑在治療青光眼方面的臨床應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明宋偉瓊：參與論文選題、研究設(shè)計、實驗實施、數(shù)據(jù)采集和分析、論文撰寫；何芳：參與論文選題、研究設(shè)計、實驗實施、數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計分析、文章內(nèi)容的審核和定稿；杜玲芳：參與論文選題、研究設(shè)計、實驗實施、對文章智力性內(nèi)容修改和定稿；譚華霞：參與數(shù)據(jù)采集；劉丹：參與數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計分析