Notch信號通路對骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖和軟骨基質合成的作用研究

林飛太 ，林煜 ，林鋇，陳賽楠，翁艷 ，馮爾宥

1 廈門大學附屬福州市第二醫(yī)院關節(jié)外科，福州 350007；2 福建醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院，福州 350122；3福建中醫(yī)藥研究院，福州 350003

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是當今中老年人慢性致殘的主要原因之一，是由年齡和創(chuàng)傷等多因素引起的關節(jié)軟骨及其整體結構漸進變性的退行性疾病，嚴重影響了我國中老年人的生活質量[1-2]。目前OA主要是通過非甾體抗炎藥消炎鎮(zhèn)痛和降低運動量等來緩解癥狀，但這些治療方法僅能延緩疾病進展，而無法逆轉軟骨退變。因此，探索OA的病理生理過程對該病的精準治療和靶向治療具有重要意義。

Notch信號通路在生物進化過程中高度保守，可介導細胞間的相互作用[3]。Notch配體與受體結合后，促使Notch受體發(fā)生蛋白水解，釋放細胞質中的Notch1受體胞內結構域（Notch1 IC或Notch1 ICD，NICD），Notch信號通路被激活。隨后，NICD轉移到細胞核，并誘導下游靶基因的表達[4]。Geogan等[5]提出Notch信號與關節(jié)軟骨內穩(wěn)態(tài)和OA的發(fā)病機制相關。RBPjκ基因敲除小鼠出現(xiàn)了進行性關節(jié)軟骨退化和與年齡相關的OA樣病理變化[6]，而小鼠關節(jié)中Notch信號的暫時抑制，使OA進展延遲[7]。因此提示Notch信號與OA的發(fā)病和進展有關。相關研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路與軟骨細胞的生長關系密切[8]，調控Notch信號通路可影響軟骨細胞凋亡[9]，軟骨持續(xù)過表達NICD的小鼠可出現(xiàn)OA進行性病理變化[10]，研究顯示，與正常軟骨細胞相比，OA小鼠軟骨細胞Notch1和Jagged1等表達顯著增強[11]。但筆者未見相關報道闡明Notch信號通路與OA軟骨細胞增殖和軟骨基質合成的相關性。本研究采用白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導C28/I2軟骨細胞系的NICD沉默和過表達，檢測OA軟骨細胞的活性和增殖細胞 核 抗 原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），并檢測其對軟骨基質Ⅱ型膠原蛋白（typeⅡ collagen，ColⅡ）和聚集蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）合成的影響，以期探討Notch信號通路在OA中的潛在分子機制。本研究采用體外細胞實驗，于2021年1～12月在福建省中醫(yī)藥科學院研究所完成?，F(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

標準級胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，賽業(yè)生物科技）；DMEM/F-12、青霉素-鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美國Gibco公司）；lipofectamine 2000、TRIzol（美國 Invitrogen 公司）；IL-1 β（美國 Sigma 公司）；Cell Counting Kit-8（Cck-8）試劑盒（MedChemExpress公司）；Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR II、SYBRGreen Premix Pro Taq HS qPCR Kit（艾科瑞生物）；RIPA裂解液（強）、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、QuickBlockTMWestern封閉液（上海碧云天生物技術有限公司）；蛋白酶抑制劑混合物（protease inhibitor cocktail，APExBIO 公司）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（SDS-PAGE loading buffer，康為世紀生物科技股份有限公司）；PCNA（ D3H8P）XPRabbit mAb（Cell Signaling Technology公司）；Anti-Aggrecan抗體、Anti-Collagen Ⅱ抗體（Abcam公司）；GAPDH Rabbit mAb（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

DMI8倒置熒光顯微鏡（Leica公司）；RT-6100酶標分析儀（Rayto公司）；7500 Fast Realtime PCR（ABI公司）；PowerPac通用電泳儀（BIORAD公司）；FluorChem M多色熒光/化學發(fā)光成像（Protein Simple公司）。

1.2 細胞與質粒

C28/I2人正常軟骨細胞系（ATCC細胞庫）；HBLV-h-NICD-3xflag-ZsGreen-PURQ、HBLV-ZsGreen-PURO過表達對照[漢恒生物科技（上海）有限公司]；NICD siRNA質粒、siRNA control[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.3 研究方法

1.3.1 軟骨細胞培養(yǎng)

C28/I2細胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，待細胞融合達到80%～90%時用胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 IL-1β誘導

細胞按1×104/ml密度接種于96孔板，置于含10ng/ml IL-1β的培養(yǎng)基中，C28/I2細胞分別培養(yǎng)24、48h和72h。CCK-8法檢測OA軟骨細胞抑制率，吸光度用A表示。細胞抑制率（%）=（AIL-1β誘導組-A空白組）/（A陰性對照組-A空白組）×100%，選取抑制率最低的細胞用于后續(xù)實驗。同時，采用Western Blot法檢測NICD、caspase3和caspase9的蛋白表達水平。

1.3.3 感染

選取NICD過表達組（Ad-NICD）對數(shù)生長期的誘導OA軟骨細胞，按1×106/ml密度接種于六孔板中，培養(yǎng)12h達到60%～70%的融合度，加入不同滴度[病毒感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）20、MOI40、MOI60、MOI80]的腺病毒培養(yǎng)48 h，根據(jù)綠色熒光的強弱確定其最佳MOI。采用最佳MOI的Ad-NICD感染C28I2細胞，平行設置空白對照組（NC）和陰性對照組（Ad-GFP），48h后檢測NICD的表達水平。

1.3.4 NICD敲低組（si-NICD）的沉默效率

選取si-NICD組對數(shù)生長期的誘導OA軟骨細胞，按1×106/ml密度接種于六孔板中，培養(yǎng)12h達到60%～70%的融合度。配制轉染稀釋液：50μl DMEM/F12培養(yǎng)基中加入4μl lipofectamine 2000，相溶后放置于室溫孵育5min。同理，用50μl DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋50nmol siRNA，相溶后置于室溫孵育5min；將稀釋后的lipofectamine 2000與稀釋后的siRNA輕輕混合，室溫靜置20min后緩緩加入細胞培養(yǎng)基中，輕輕搖晃孔板使其混勻；將六孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8h后，將原有培養(yǎng)基更換為DMEM/F12完全培養(yǎng)基。設計并合成3個si-NICD，48h后檢測NICD的表達水平，選取沉默效果最佳者用于后續(xù)實驗。

1.3.5 CCK-8檢測細胞活性

細胞分為5組：IL-1β誘導對照組、過表達陰性對照組（Ad-NC）、Ad-NICD、敲低陰性對照組（siRNA-NC，si-NC）和si-NICD。每組設置6個復孔，每孔接種1×104個細胞懸液。將96孔板置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48h和72h后，各孔加入10μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4h，使用酶標儀測定A450nm，判定細胞活性。

1.3.6 Real-time PCR 試驗

PBS沖洗細胞，TRIzol抽提總RNA，Nanodrop 2000測定A260/A280比值，總RNA采用Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR II試劑盒反轉錄為cDNA，-20℃保存；引物序列GAPDH-F 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，R5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'；PCNA-F 5'-AAGGGCTGAAGATAATGCTGATA-3'，R5'-CATATACGTGCAAATTCACCAGAT-3'；ColⅡ -F5'-AAGGATGTGTGGAAGCCGGA-3'，R5'-CTGAGGCAGTCTITCACGTCT-3'；Aggrecan-F 5'-CTTCTGCAACTGAAGTGCCCTC-3'，R5'-GCTCTTOCGAGGCTGATGGTT-3'；使用7500 Fast Real-time PCR儀，95℃、15s共1個循環(huán)，95℃、5s和60℃、30s共40個循環(huán)，以GAPDH為內參，2-△△CT計算PCNA、ColⅡ和ACAN的mRNA表達水平。

1.3.7 Western Blot 試驗

PBS沖洗細胞，加入RIPA裂解液300μl和蛋白酶抑制劑 Cocktail 3μl，細胞刮刀收集細胞置于EP管中，于冰上裂解30min， 12000r/min（4℃）離心20min；吸取上清液200 μ l加入5×loading buffer 50μl，98℃變性10min。BCA試劑盒測定濃度，每孔上樣30 μ g總蛋白；SDS-PAGE凝膠電泳，恒壓100V轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜；快速封閉液封閉15min，分別加入一抗4 ℃孵育過夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液+聚山梨酯-20（polysorbate-20）洗膜，加入對應的二抗1：1000室溫孵育1h，TBST洗膜，增強化學發(fā)光法（ECL）化學發(fā)光顯影。分析條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算PCNA、ColⅡ和Aggrecan的蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。實驗數(shù)值以x±s表示，正態(tài)分布的多組間計量資料采用單因素方差分析，非正態(tài)分布的多組間計量資料采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 IL-1β誘導C28/I2細胞凋亡的作用

與陰性對照組相比，IL-1β誘導后24、48h和72h C28/I2細胞活性均顯著降低（P＜0.001），72h時抑制率最低（表1），選用于后續(xù)實驗。Western Blot結果顯示，與陰性對照組相比，IL-1β誘導后NICD表達水平顯著提高（P＜0.001），且caspase3和caspase9的表達水平均顯著提高（P＜0.01）。見表2和圖1。

表1 IL-1β對C28/I2細胞的抑制率

表2 Western Blot檢測IL-1β誘導軟骨細胞的凋亡作用

圖1 Western Blot檢測IL-1β誘導軟骨細胞的蛋白表達

2.2 Ad-NICD的過表達效率

Ad-NICD感染IL-1β誘導后的C28/I2細胞 48h，MOI20、MOI40、MOI60、MOI80的倒置熒光顯微鏡圖見圖2。結果顯示，MOI為40時感染效果最佳。Real-time PCR和Western Blot法檢測細胞NICD mRNA和蛋白表達水平，結果表明Ad-NC組與NC組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；與Ad-NC組相比，Ad-NICD組感染后細胞NICD mRNA和蛋白表達水平顯著增加（P＜0.01）。見圖3。

圖2 Ad-NICD感染IL-1β誘導后的C28/I2細胞48h的MOI倒置熒光顯微鏡圖

圖3 Ad-NICD的過表達效率

2.3 si-NICD的沉默效率

si-NICD轉染IL-1β誘導后的C28/I2細胞48h，與si-NC組相比，3個si-NICD組的mRNA和蛋白表達水平均明顯下降（P＜0.01），其中以si-NICD3組下降最為顯著（圖4）。因此，選擇si-NICD3用于后續(xù)實驗。

圖4 si-NICD的沉默效率

2.4 CCK-8檢測細胞活性

與IL-1β誘導對照組相比，Ad-NC組和si-NC 組的A值無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；24、48h和72h后Ad-NICD組的A值均顯著降低（P＜0.001），24h和48h后si-NICD組的A值升高，72h呈上升趨勢但無統(tǒng)計學差異（表3）。提示Ad-NICD感染IL-1β誘導C28/I2可抑制其增殖，si-NICD3轉染可促進細胞增殖。

表3 CCK-8檢測細胞增殖

2.5 Real-time PCR法檢測軟骨細胞增殖和基質合成

與Ad-NC組相比，Ad-NICD組的PCNA、Col Ⅱ和ACAN mRNA表達水平呈現(xiàn)不同程度的降低（P＜0.05）；與si-NC相比，si-NICD的PCNA、Col Ⅱ和ACAN mRNA表達水平呈現(xiàn)不同程度的升高（P＜0.05，表4）。提示Ad-NICD感染IL-1β誘導C28/I2可抑制其增殖和基質分泌，si-NICD3轉染可促進細胞增殖和分泌。

表4 Real-time PCR檢測OA軟骨細胞增殖和基質合成

2.6 Western Blot檢測軟骨細胞增殖和基質合成

Western Blot法與Real-time PCR法檢測結果的變化趨勢相符；與Ad-NC組相比，Ad-NICD組的PCNA、Col Ⅱ和ACAN蛋白表達水平呈現(xiàn)不同程度的降低（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-NICD組的PCNA、Col Ⅱ和ACAN的蛋白表達水平呈現(xiàn)不同程度的升高（P＜0.05）。見圖5。提示Ad-NICD感染IL-1β誘導的C28/I2可抑制其增殖和基質分泌，si-NICD轉染可促進細胞增殖和分泌。

圖5 Western Blot檢測軟骨細胞增殖和基質合成

3 討論

OA是一種以異常軟骨細胞表型、軟骨退化、炎癥和纖維化為特征的退行性關節(jié)疾病。相關動物研究表明[12]，Notch 信號傳導是軟骨穩(wěn)態(tài)和關節(jié)維持的關鍵調節(jié)劑之一。然而，人們對OA的病因知之甚少。

Notch信號傳導是一種進化上非常保守的通路，通過鄰近細胞間傳導信號調節(jié)細胞各種生理過程，可決定細胞命運（細胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡、黏附等），是維持體內平衡的關鍵環(huán)節(jié)。Notch由5個配體（Dll1、3、4和Jagged1、 2）組成，與 4 個 Notch 受體（Notch1～4）相互作用[13]。配體結合后，Notch受體被切割， Notch NICD易位至細胞核，并最終激活下游基因的表達，從而影響細胞增殖和分化[13-16]。這些基因可在OA活檢中被大量檢測到[17]，尤其是在創(chuàng)傷后發(fā)生OA 時，人和小鼠關節(jié)組織的Notch通路被高度激活[18]。相關研究提示[7]，在疾病早期階段，OA增殖軟骨細胞簇的Notch1、Jag1和Hes5水平高于正常軟骨。Notch1和Notch2的NICD位于OA細胞核中，而非正常軟骨細胞中，這表明在受疾病影響的關節(jié)中 Notch 信號通路被激活[19]。但在正常的軟骨生長發(fā)育過程中，Notch 信號通常在早期軟骨形成過程中高度表達，并隨著軟骨細胞的分化而降低。因此，Notch信號在成人關節(jié)軟骨中表達，并且大部分存在于關節(jié)軟骨中的軟骨細胞表達Notch1[17，20]。Dong等[21]在 E11.5～12.0的整個肢芽間質中觀察到高水平的Notch1，并在血管組織周圍觀察到Notch1。Watanabe等[22]證明了在分化鼠軟骨細胞系（ATDC5細胞）中，隨著軟骨細胞的成熟，Notch受體和靶點的表達減弱并主要限制在軟骨凝聚物的外圍?；诖?，本研究推斷Notch信號通路在OA軟骨細胞與正常軟骨細胞中的機制可能不同，過表達NICD激活Notch通路可抑制OA軟骨細胞增殖和軟骨基質合成。與Watanabe 等[22]研究不同的是，本研究以PCNA、Col Ⅱ和ACAN作為細胞增殖指標，通過蛋白和基因水平檢測Ad-NICD轉染OA后的PCNA、Col Ⅱ和ACAN的表達水平，結果顯示有不同程度的降低。本研究結果提示，過表達NICD激活Notch通路可以抑制OA軟骨細胞增殖和軟骨基質合成，這與Watanabe 等[22]的研究結果本質相同而途徑不同。

關節(jié)軟骨是一種致密結締組織，其沒有神經(jīng)、血管及淋巴，在運動中發(fā)揮承重、緩沖和保護作用[23]。軟骨細胞是軟骨組織中的唯一細胞組分，其余均為細胞外基質，軟骨細胞通過分泌生長因子和酶來調節(jié)細胞外基質 （extracellular matrix，ECM）的合成并進一步嵌入 ECM中形成軟骨[24]。ECM的主要成份Ⅱ型膠原蛋白和ACAN是軟骨細胞表型的經(jīng)典標志物[25]。ECM網(wǎng)絡負責吸收關節(jié)軟骨的機械應力，促進軟骨細胞黏附和調節(jié)細胞內信號轉導。

軟骨的退化源于軟骨ECM的降解，其主要由Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖組成[26]。軟骨形成的 ECM由蛋白酶降解，包括用于降解膠原蛋白的基質金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinase，MMP）[27]，以及用于降解聚集蛋白聚糖的具有血小板反應蛋白基序的 Adamalysin （ADAMTS）[28]。相關研究發(fā)現(xiàn)，包括 MMP-1、MMP-9、MMP-13和MMP-14 在內的膠原酶對膠原蛋白的降解起著至關重要的作用[29]。MMP-13是 OA 中的主要膠原酶，其在 OA 軟骨中表達增加[30]。ADAMTS4 和ADAMTS5被認為是最關鍵的2種基質降解酶[31]。相關證據(jù)表明[31]，在OA小鼠模型和抗原誘導的關節(jié)炎模型中，敲除ADAMTS5導致不太嚴重的軟骨損傷。Cheung等[32]的研究表明，ADAMTS4在人類OA中起著至關重要的作用。除了MMP和ADAMTS外，解聯(lián)素和金屬蛋白酶（metalloprotease，ADAM） 家族也參與介導OA的ECM 降解[33]。Zack等[34]指出，ADAM8是人類OA軟骨細胞中的一種纖連蛋白酶，在氨基酸Ala處切割纖連蛋白。這種ADAM8介導的軟骨中纖連蛋白的降解可能直接導致OA進展。Notch信號通路已被確立為小鼠[35-36]和人類[37-38]骨骼發(fā)育和疾病的關鍵途徑。Dong等[21]和Kohn等[35]的研究確定了Notch信號通路是軟骨發(fā)育的中央調節(jié)器，這表明其可能更多地參與關節(jié)軟骨維護和OA等退行性疾病。雖然人OA軟骨樣本顯示表達Notch1和其他Notch途徑蛋白的細胞頻率增加[5，19]，但Notch在正常或病理狀態(tài)下關節(jié)軟骨中的功能仍不清楚。而本研究中，在分子水平上，持續(xù)的Notch信號傳導抑制ColⅡ和ACNA表達，證明Notch信號對重要軟骨分解代謝因子有特異性調節(jié)作用。

已有文獻報道[7]，Notch 信號有助于 OA 的發(fā)展。Notch受體Notch1和Notch2在OA軟骨細胞中上調，這些Notch受體被切割形成Notch細NICD并易位至細胞核，因此Notch信號通過與Rbpj蛋白結合形成轉錄激活因子而被激活， 并誘導Hes/Hey家族蛋白發(fā)揮調節(jié)功能[39]。敲除小鼠中Rbpj基因可抑制OA進展。Notch信號通路阻滯劑可緩解OA的病理變化[40]。相關研究表明[41]，Notch 信號的下游效應因子 Hes1在 OA軟骨細胞中高度表達。Hes1由激活的Notch受體NICD誘導，并誘導MMP13的強表達，從而催化軟骨形成的ECM的降解，導致軟骨退化[40]。因此，Notch-Hes1軸被認為是OA發(fā)展的重要機制。本研究中，雖然沒有以軟骨形成的各種蛋白酶及轉錄因子為研究對象，但是本研究以PCNA、ColⅡ和ACAN作為觀察指標，實驗結果表明過表達NICD激活Notch通路可抑制OA軟骨細胞基質合成，恰恰證實了這一觀點。

Yang等[42]發(fā)現(xiàn)軟骨特異性 Notch 信號的丟失或減少能夠減少小鼠關節(jié)內MMP13的含量，并在短期內延緩軟骨退化。因此，我們認為抑制Notch通路可促進OA軟骨細胞增殖和軟骨基質合成。此外，Liu等[10]的研究表明 Notch 信號傳導的病理增益導致IL6和STAT3增加以及 MAPK信號傳導，這有助于關節(jié)軟骨退化和纖維化。此外，其他一些信號通路，如受體酪氨酸激酶信號通路、GPCR 信號通路和 NO 信號通路，隨著 NICD1在軟骨細胞中的持續(xù)表達而顯著增加。因此，需要Notch 信號活動的良好時空平衡來維持關節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)和關節(jié)完整性[43-44]。現(xiàn)階段雖無逆轉OA病程進展的藥物，但通過OA的潛在靶點精準治療OA仍具有可能性。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達NICD激活Notch通路可抑制C28/I2細胞增殖和基質的合成能力；抑制Notch信號通路可提高C28/I2細胞增殖和基質的合成能力，在維持軟骨細胞功能上有保護作用，可能會成為OA治療中的潛在靶點之一。本研究僅為體外實驗，課題組后續(xù)將進一步展開對Notch信號通路的在體動物研究，為OA未來的靶向治療提供新的理論依據(jù)。