淡紫擬青霉致皮膚透明絲孢霉病1例

付曉蕊，周 磊，劉 昊，張鵬亮(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科，全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院疾病預(yù)防控制科，陜西 西安 7003)

淡紫擬青霉致皮膚透明絲孢霉病是一種罕見(jiàn)但潛在發(fā)生的嚴(yán)重感染疾病。淡紫擬青霉屬于半知菌綱、絲孢菌目、絲孢菌科、擬青霉屬的一種絲狀真菌，是一種寄主范圍較廣的真菌[1]。存在于空氣、土壤、木材和儲(chǔ)存的食物中，常為醫(yī)源性感染、免疫功能低下[2-3]或創(chuàng)傷后的患者感染。本例患者全身紅斑、水皰及口腔糜爛反復(fù)多年，左前臂、右耳浸潤(rùn)性紅斑上出現(xiàn)疣狀增生，左膝腫脹變形、多發(fā)膿腫，在一次右膝關(guān)節(jié)分泌物及組織進(jìn)行真菌培養(yǎng)時(shí)，平板培養(yǎng)3 d后長(zhǎng)出白色菌落，產(chǎn)孢后逐漸變成淺粉紅色，培養(yǎng)7 d后，菌落呈紫紅色、圓形、隆起、粉狀菌落。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)病原學(xué)檢查，最終鑒定為淡紫擬青霉菌感染。改為靜脈滴注利奈唑胺、頭孢呋辛，口服伏立康唑和鹽酸特比萘芬片，半月后患者情況好轉(zhuǎn)出院。

1 臨床資料

患者，女，57歲。8年高血壓史，2年糖尿病史，自述吃藥不規(guī)律。2016年4月主因口腔水皰、糜爛伴疼痛1個(gè)月，全身紅斑、水皰1周住院治療。皮膚組織病理提示為副腫瘤性天皰瘡，分泌物培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌。入院期間給予靜脈滴注甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液，外用鹵米松乳膏1個(gè)月后好轉(zhuǎn)出院。出院后口服甲潑尼龍片規(guī)律治療，皮損穩(wěn)定性逐漸好轉(zhuǎn)。2016年12月，患者自行減半口服甲潑尼龍片劑量。2017年3月主因全身紅斑、水皰及口腔糜爛伴疼痛加重再次入院。治療繼續(xù)給予靜脈滴注甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液，外用鹵米松乳膏，皮膚糜爛處外用百克瑞、潰瘍油及夫西地酸軟膏，20余日后好轉(zhuǎn)出院，出院后改為口服甲潑尼龍片。2021年4月主因全身紅斑、水皰及口腔糜爛反復(fù)多年，左前臂、右耳浸潤(rùn)性紅斑上出現(xiàn)疣狀增生1年半，左膝腫脹變形、多發(fā)膿腫半年，再次入院。

?？茩z查：口腔黏膜、舌、右側(cè)大陰唇數(shù)個(gè)小潰瘍，直徑0.2～0.3 cm；軀干、四肢散在大小不等紅色、褐色斑片，局部萎縮性瘢痕，未見(jiàn)糜爛和結(jié)痂，少許鱗屑；左前臂、右耳浸潤(rùn)性紅斑，其上見(jiàn)數(shù)個(gè)疣狀增生物，表面粗糙；右膝關(guān)節(jié)明顯腫脹、變形，多發(fā)膿腫，皮膚暗紅色，有波動(dòng)感；軀干、雙上肢散在大小不等瘀斑。皮膚出現(xiàn)疣狀、紅斑可考慮皮膚真菌病(六胺銀染色可見(jiàn)菌絲和孢子，抗酸染色為陰性)。腹部包塊穿刺活檢結(jié)果，送檢大部分為胰腺組織，周邊少許纖維組織增生伴較多淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)。PET/CT示，胸12～腰3椎體水平胰腺腹主動(dòng)脈間隙不規(guī)則片狀軟組織病變，病變包繞腹腔干，于胰腺及腹主動(dòng)脈分界不清，呈葡萄糖代謝輕度異常增高，多考慮為良性病變，腹膜后纖維化可能性大；體部多處皮膚局限性輕度增厚，呈葡萄糖代謝輕度異常增高，多考慮為感染性疾?。蛔訉m缺如，骨質(zhì)疏松，脊柱多個(gè)椎體退行性改變。

微生物檢測(cè)：大陰唇分泌物培養(yǎng)出無(wú)乳鏈球菌；組織需氧、厭氧培養(yǎng)出無(wú)乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌；分枝桿菌培養(yǎng)和尿培養(yǎng)顯示陰性；組織真菌鏡檢查見(jiàn)真菌菌絲；病灶組織、左膝囊腫內(nèi)容物、膿液真菌培養(yǎng)為擬青霉菌。

血液化驗(yàn)：1, 3-β-D葡聚糖282.31 ng/L，內(nèi)毒素<5 ng/L，半乳甘露聚糖0.56 ng/L，T-SPOT.TB陰性，白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、白蛋白、免疫球蛋白長(zhǎng)期偏低。

實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查。①菌落培養(yǎng)：將患者組織樣本碾磨接種在沙保弱平板上，在25 ℃的條件下進(jìn)行真菌培養(yǎng)，3 d后平板上可見(jiàn)清晰白色柔軟羊毛樣小菌落；馬鈴薯平板點(diǎn)種，4 d后菌落中間逐漸出現(xiàn)淡紫色(圖1A)，菌落平坦擴(kuò)展，布滿絨毛狀氣生菌絲，表面有似蛛網(wǎng)狀紋理；1周左右菌落正面周邊均為淡紫色(圖1B)，菌落背面呈暗橘黃色，有褶皺形成(圖1C)。乳酸棉酚藍(lán)染色，3 d后鏡下為有橫隔的透明菌絲，未見(jiàn)瓶梗樣結(jié)構(gòu)；1周左右鏡下可見(jiàn)稀疏的帚狀枝，分生孢子橢圓形，長(zhǎng)鏈狀排列(圖1D)。②小培養(yǎng)：在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上挖出1個(gè)矩形并加熱溶解，填充鋼圈進(jìn)行小培養(yǎng)接種，25 ℃，1周左右觀察乳酸棉酚藍(lán)染色。鏡下可清晰地觀察到有隔透明菌絲，分生孢子梗直立，其頂端為稀疏帚狀枝(圖1D)。小梗基部膨大，頂端尖細(xì)，形成細(xì)長(zhǎng)的產(chǎn)分生孢子的管狀小體，是鑒定該菌的重要依據(jù)。

A：馬鈴薯平板點(diǎn)種4 d后菌落逐漸出現(xiàn)淡紫色；B：點(diǎn)種1周后菌落正面周邊均為淡紫色；C：點(diǎn)種1周后菌落背面褶皺形成，呈暗橘黃色；D：乳酸棉酚藍(lán)染色后，顯微鏡下(×1 000)可見(jiàn)稀疏的帚狀枝，分生孢子橢圓形，長(zhǎng)鏈狀排列。圖1 淡紫擬青霉菌落及鏡下形態(tài)

分子生物學(xué)鑒定：取馬鈴薯平板上點(diǎn)種的單個(gè)菌落進(jìn)行分子鑒定。①DNA提?。翰捎蒙ど锕镜闹秸婢蚪MDNA抽提試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行測(cè)序。②PCR擴(kuò)增：選用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和真菌通用引物ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增部分為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和4，約600 bp左右，PCR反應(yīng)體系25 μL，包括Premix Tap緩沖液12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，基因組DNA 1.0 μL，蒸餾水9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變形30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循環(huán)30次；結(jié)束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化和基因測(cè)序。③測(cè)序結(jié)果：該菌株擴(kuò)增片段大小為571 bp，將測(cè)序結(jié)果通過(guò)對(duì)比，與基因庫(kù)中淡紫擬青霉序列同源性為99.5%。

質(zhì)譜鑒定：取馬鈴薯平板上點(diǎn)種的新鮮單個(gè)菌落，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為淡紫擬青霉，準(zhǔn)確率為99.5%。

電鏡觀察：取鋼圈小培養(yǎng)蓋玻片進(jìn)行掃描電鏡觀察，菌絲、分生孢子梗、瓶梗和分生孢子形態(tài)與光鏡下大致相同，可見(jiàn)稀疏的帚狀枝，分生孢子橢圓形，長(zhǎng)鏈狀排列，小?；颗虼?，頂端尖細(xì)，形成細(xì)長(zhǎng)的產(chǎn)分生孢子的管狀小體(圖2)。

圖2 淡紫擬青霉電鏡下形態(tài)(×2 500)

綜合培養(yǎng)平板上菌落形態(tài)、顯微鏡下菌株結(jié)構(gòu)特征、質(zhì)譜鑒定以及測(cè)序結(jié)果，鑒定為淡紫擬青霉。依據(jù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果及臨床癥狀，最終診斷為皮膚透明絲孢霉病。靜脈滴注利奈唑胺葡萄糖注射液0.6 g/次，2次/d，注射頭孢呋辛鈉0.75 g/次，3次/d，口服伏立康唑0.1 g/次，2次/d，鹽酸特比萘芬片250 mg/次，1次/d。半月后患者情況好轉(zhuǎn)出院。

2 討論

淡紫擬青霉廣泛分布于世界各地，具有功效高、寄主廣、易培養(yǎng)等特點(diǎn)，近幾年的研究主要集中在控制植物病原線蟲(chóng)方面，其菌劑是純微生物活孢子制劑，具有高效、光譜、長(zhǎng)效、安全、無(wú)污染、無(wú)殘留等特點(diǎn)，可明顯刺激作物生長(zhǎng)。本例患者發(fā)病進(jìn)展較緩慢，且近幾年持續(xù)發(fā)病，入院后實(shí)驗(yàn)室檢查提示存在多種基礎(chǔ)疾病，包括低蛋白血癥、貧血、2型糖尿病、高血壓2級(jí)等，這些都是患者免疫力低下易感病菌的主要因素。電話回訪患者常年體弱易生病，家住農(nóng)村，提示我們近些年的生物制劑高效復(fù)合肥料等農(nóng)作物輔助菌劑也有可能是患者感染罕見(jiàn)病菌的一個(gè)重要途徑。且近年來(lái)，免疫正常人群中感染病例的報(bào)道也逐漸增多，淡紫擬青霉對(duì)人類具有致病作用，有報(bào)道稱該菌屬可引起人類眼、心內(nèi)膜、副鼻竇及皮膚的感染。淡紫擬青霉的皮膚感染通常進(jìn)展緩慢，曾報(bào)道1例患者病史長(zhǎng)達(dá)15年，其皮損仍局限于發(fā)病部位，僅擴(kuò)展至手掌大[4]。

根據(jù)最初的顯微鏡檢查結(jié)果，淡紫擬青霉菌往往鏡下形態(tài)不典型，需要延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，鏡下形態(tài)才會(huì)逐步明顯，加之菌落形態(tài)及淡紫色出現(xiàn)，才會(huì)很快被確定為擬青霉菌的感染。除此之外，新的檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，如基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)能更快地鑒定到種，為淡紫擬青霉的快速診斷提供很大幫助。在二次傳代培養(yǎng)中淡紫擬青霉菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，菌落淡紫色出現(xiàn)也較原代培養(yǎng)要出現(xiàn)得快。淡紫擬青霉鏡下主要觀察點(diǎn)是菌絲、逐漸變細(xì)的球莖和分生孢子鏈產(chǎn)生的長(zhǎng)分生孢子，這些特征與本例顯微鏡觀察結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行小培養(yǎng)傳代，更加立體地觀察菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并通過(guò)掃描電子顯微鏡制片觀察，看到高倍鏡下更加清晰明確的菌絲形態(tài)，瓶梗頂部錐形變細(xì)的瓶頸清晰可見(jiàn)，部分瓶頸有偏離主軸而呈彎曲的特征。

淡紫擬青霉對(duì)許多抗真菌藥物具有耐藥性，有研究顯示淡紫擬青霉藥敏實(shí)驗(yàn)對(duì)伏立康唑[5]、泊沙康唑和特比萘芬有較好的敏感性[6-7]，其中泊沙康唑的敏感性最高。我們對(duì)該菌進(jìn)行的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株對(duì)伏立康唑、泊沙康唑敏感，與以往文獻(xiàn)報(bào)道的藥敏結(jié)果一致[8]。另外有學(xué)者認(rèn)為該菌在37 ℃時(shí)生長(zhǎng)緩慢，40 ℃時(shí)生長(zhǎng)完全受抑，因此局部溫?zé)岑煼ㄒ嗫赡苡行?，但很難將病原體徹底清除?？诜舾锌拐婢幬锱c溫?zé)岑煼ǖ穆?lián)合應(yīng)用可能是該病的適宜治療方案。這一點(diǎn)在臨床治療中值得借鑒。

真菌性皮膚感染的臨床癥狀常常不典型，不同真菌感染后的表現(xiàn)也不一致，發(fā)病初期癥狀與細(xì)菌性感染難以鑒別，以致延誤治療時(shí)機(jī)。所以，實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查對(duì)于臨床早期診斷和及時(shí)治療具有重大指導(dǎo)意義，是提高真菌性感染治療成功率的關(guān)鍵。臨床醫(yī)生需重視真菌病原學(xué)送檢，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)熟知各種真菌特點(diǎn)并提高診斷技術(shù)，互相溝通協(xié)作是做好真菌感染診療的重要環(huán)節(jié)。