脊髓背角UCP4調(diào)節(jié)線粒體膜電位參與神經(jīng)病理性痛機(jī)制研究

吳菲菲，黃云強(qiáng)，夏雨露，劉勃志，張昆龍，鄭 杰，拜云虎，朱昌磊，楊雁靈，王亞云(空軍軍醫(yī)大學(xué)：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，西京醫(yī)院康復(fù)理療科，西京醫(yī)院肝膽胰脾外科，陜西 西安 700)

近20年來(lái)，神經(jīng)病理性痛(neuropathic pain，NP)已成為最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的臨床慢性癥狀[1]。一項(xiàng)流行病學(xué)研究揭示NP的患病率為6.9%～10.0%，并呈逐年上升趨勢(shì)[2]，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。NP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療效果較差，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前臨床治療中使用的阿片類(lèi)藥物和非甾體抗炎藥僅對(duì)少數(shù)患者有效，因此，進(jìn)一步研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)于研發(fā)新的治療藥物，改善臨床治療效果具有重要意義。脊髓背角作為疼痛信息整合的初級(jí)中樞，外周損傷可能引起抑制性背角神經(jīng)元的功能障礙，導(dǎo)致投射神經(jīng)元的敏化和興奮性的增加[3]，可作為研究NP的主要突破口。

線粒體作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)供能的重要細(xì)胞器[4]，在疼痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。線粒體解偶聯(lián)蛋白4(uncoupling protein 4，UCP4)定位于線粒體內(nèi)膜，是一種介導(dǎo)H+內(nèi)流的跨膜蛋白質(zhì)，介導(dǎo)質(zhì)子重新進(jìn)入線粒體基質(zhì)，使得流經(jīng)ATP合酶的質(zhì)子減少，進(jìn)而降低合成ATP的驅(qū)動(dòng)力，即形成“質(zhì)子漏”[5]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，NP狀態(tài)下脊髓背角UCP4表達(dá)量降低，提示UCP4可能參與NP的中樞敏化過(guò)程并發(fā)揮重要作用[6]，但是其鎮(zhèn)痛作用和機(jī)制不清。本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究，旨在闡明UCP4參與NP中樞敏化過(guò)程的機(jī)制。首先使用立體定位儀在脊髓背角注射病毒，靶向調(diào)控脊髓背角UCP4的表達(dá)，然后構(gòu)建坐骨神經(jīng)選擇性損傷(spared nerve injury，SNI)模型，模擬NP，通過(guò)檢測(cè)機(jī)械性痛敏、熱痛敏、線粒體超微結(jié)構(gòu)、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)及腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)含量等指標(biāo)變化，闡明UCP4參與NP的作用機(jī)制，為研究NP提供新的分子靶標(biāo)，為治療NP和開(kāi)發(fā)鎮(zhèn)痛新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用8～10周齡的健康雄性C57BL/6J小鼠45只，體質(zhì)量20～25 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)全部方法和操作遵守國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)指南進(jìn)行。RNA提取試劑盒(DP451)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；MMP檢測(cè)試劑盒(C2006)、SOD檢測(cè)試劑盒(S0101S)、總谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒(S0052)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；UCP4的AAV病毒購(gòu)自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脊髓背角定位注射病毒 將UCP4過(guò)表達(dá)和干擾AAV病毒分別定位注射到小鼠的脊髓背角中。小鼠使用水合氯醛麻醉，切除L5-L6椎體上方的棘旁肌，并對(duì)靶側(cè)椎體進(jìn)行椎板部分切除術(shù)。使用微量注射器(79013，深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中國(guó))注射，注射量為300 nL，注射速度為50 nL/min，注射坐標(biāo)為X軸500 nm，Z軸300 nm。注射完成后，留置10～15 min后取出注射器。

1.2.2 NP模型的建立 SNI模型的制備按照DECOSTERD等[7]的方法：將小鼠用420 mmol/L水合氯醛腹腔麻醉；分離右后肢股二頭肌，暴露并雙重結(jié)扎脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，剪斷結(jié)扎的2～4 mm的神經(jīng)干。假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)干及其分支而不切斷，其余過(guò)程同手術(shù)組。

1.2.3 行為學(xué)檢測(cè) 機(jī)械痛檢測(cè)參照DIXON[8]的方法。首先將小鼠置于金屬網(wǎng)上的透明玻璃罩內(nèi)，適應(yīng)30 min；然后用不同壓力的纖維絲(從小到大)垂直刺激足底2、3跖趾間皮膚敏感處，觀察是否出現(xiàn)縮足反應(yīng)，每次刺激間隔5 s，連續(xù) 10次，誘發(fā)4～6次縮足反應(yīng)視為50%的反應(yīng)率，其壓力值即為閾值。熱板痛檢測(cè)按HARGREAVES等[9]方法。先將小鼠放在熱板儀(YLS-6B)上適應(yīng)5 min，溫度調(diào)整為(52.0±0.5)℃。記錄小鼠右后足手術(shù)側(cè)第一次出現(xiàn)舔、退縮或跳躍等反應(yīng)的時(shí)間，每次時(shí)間不超過(guò)30 s，同一只小鼠檢測(cè)時(shí)間間隔5 min。

1.2.4 RT-PCR 收集小鼠脊髓腰膨大組織，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR。UCP4上游引物：CTCAGAGCCAACCGAATAGC；下游引物：GGCTGACAGATGCAACAGAA；內(nèi)參為β-actin(擎科，西安)。

1.2.5 蛋白水平檢測(cè) 提取小鼠脊髓腰膨大組織的蛋白，采用BCA法蛋白定量，SDS-PAGE電泳后，孵育多克隆兔抗β-actin(1 ∶5 000)，鼠抗UCP4(1 ∶1 000)，4 ℃過(guò)夜孵育；次日加入HRP標(biāo)記的抗兔、抗鼠IgG二抗(1 ∶5 000)，加入ECL液發(fā)光檢測(cè)并拍照保存數(shù)據(jù)。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

1.2.6 線粒體功能指標(biāo)檢測(cè)(MMP/SOD/GSH/ATP)按照生產(chǎn)廠商說(shuō)明書(shū)，將脊髓背角組織勻漿，依次檢測(cè)SOD酶活性、GSH含量及ATP的含量。MMP檢測(cè)：制備脊髓背角單細(xì)胞懸液，負(fù)載染料JC-1，37 ℃避光孵育30 min，貝克曼流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm。

1.2.7 透射電鏡分析 腹腔注射麻醉小鼠，制樣，在JEM-1200EX型透射電鏡80 kV下觀察。觀察指標(biāo)：①單位面積線粒體分布密度；②單位面積線粒體長(zhǎng)/寬比；③單位面積線粒體內(nèi)空泡數(shù)量；④單位面積線粒體內(nèi)空泡周長(zhǎng)。

2 結(jié)果

2.1 NP小鼠表現(xiàn)出明顯的機(jī)械性痛敏和熱痛敏

手術(shù)前1 d將18只C57BL/6J小鼠進(jìn)行機(jī)械性痛和熱痛閾值檢測(cè)，次日，將小鼠制備成SNI模型，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、假手術(shù)組和SNI組，每組6只小鼠，分別于手術(shù)后1、3、5、7、10、14 d檢測(cè)小鼠機(jī)械性痛和熱痛閾值。結(jié)果顯示：與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，SNI組小鼠手術(shù)后3、5、7、10、14 d出現(xiàn)明顯的機(jī)械性痛敏(P<0.01，圖1A)，手術(shù)后1 d出現(xiàn)明顯的熱痛敏，并且持續(xù)到14 d(P<0.01，圖1B)。手術(shù)后14 d取小鼠脊髓腰膨大背角組織，每組3只，使用Western blotting和RT-PCR方法檢測(cè)出脊髓背角UCP4蛋白和mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.01，圖1C～E)。

A：使用Von Frey檢測(cè)小鼠機(jī)械性痛閾值變化(n=6)；B：使用熱板儀檢測(cè)小鼠熱痛閾值變化(n=6)；C：手術(shù)后14 d，取小鼠脊髓腰膨大背角組織，使用Western blotting法檢測(cè)脊髓背角UCP4蛋白變化(n=3)；D：ImageJ計(jì)算UCP4蛋白灰度值變化(n=3)；E：RT-PCR檢測(cè)脊髓背角UCP4基因mRNA水平表達(dá)(n=3)。SNI：坐骨神經(jīng)選擇性損傷。 bP<0.01 vs 對(duì)照組； dP<0.01 vs 假手術(shù)組。圖1 NP狀態(tài)下小鼠表現(xiàn)出明顯的痛敏行為

2.2 上調(diào)脊髓背角UCP4顯著緩解小鼠機(jī)械性痛敏和熱痛敏

在NP狀態(tài)下，脊髓背角UCP4顯著降低[10]。為了闡明UCP4與NP之間的關(guān)系，本研究構(gòu)建UCP4-AAV腺相關(guān)病毒，使用立體定位注射儀在脊髓背角分別上調(diào)和下調(diào)UCP4基因。實(shí)驗(yàn)另取18只小鼠分為3組：正常對(duì)照組(NC組)、UCP4過(guò)表達(dá)組(OE組)、UCP4干擾組(KD組)，每組6只小鼠。3組分別于注射病毒2周后構(gòu)建SNI模型，并于病毒注射15、17、19、21、24、28 d進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示：病毒注射17 d后，OE組與NC組相比，SNI小鼠機(jī)械性痛敏和熱痛敏得到顯著緩解，并且鎮(zhèn)痛效果一直持續(xù)到28 d(P<0.05)；而KD組小鼠機(jī)械性痛敏和熱痛敏癥狀，與NC組保持相同的變化趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2A～B)。病毒注射28 d后取小鼠脊髓腰膨大背角組織，每組3只，使用Western blotting和RT-PCR方法檢測(cè)UCP4蛋白和mRNA表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示：注射UCP4過(guò)表達(dá)病毒和干擾病毒后，脊髓背角UCP4蛋白和mRNA表達(dá)量相應(yīng)地升高和降低，證實(shí)了病毒的有效性(圖2C～E)。

A：使用Von Frey檢測(cè)小鼠機(jī)械性痛閾值變化(n=6)；B：使用熱板儀檢測(cè)小鼠熱痛閾值變化(n=6)；C：病毒注射后28 d，取小鼠脊髓腰膨大背角組織，使用Western blotting法檢測(cè)脊髓背角UCP4蛋白變化(n=3)；D：ImageJ計(jì)算蛋白灰度值變化(n=3)；E：RT-PCR檢測(cè)脊髓背角UCP4 mRNA水平表達(dá)(n=3)。NC組：正常對(duì)照組，OE組：UCP4過(guò)表達(dá)組，KD組：UCP4干擾組。 aP<0.05， bP<0.01。圖2 靶向調(diào)節(jié)UCP4小鼠行為學(xué)結(jié)果

2.3 上調(diào)脊髓背角UCP4改善線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，“空泡樣”結(jié)構(gòu)消失

由于UCP4定位在線粒體內(nèi)膜，為明確UCP4的改變是否影響線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變，本研究分別取假手術(shù)組、NC組、OE組及KD組病毒注射后28 d的脊髓腰膨大組織，使用電鏡專(zhuān)用固定液固定，通過(guò)透射電子顯微鏡觀察，研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，NC組小鼠脊髓背角線粒體出現(xiàn)大量的“空泡樣”結(jié)構(gòu)(圖3A～B)，單位面積線粒體“?！毙卧龆?P<0.01，圖3E)，密度增加(P<0.05，圖3F)，“空泡樣”結(jié)構(gòu)面積和周長(zhǎng)變大(圖3G～H)。過(guò)表達(dá)脊髓背角UCP4，線粒體內(nèi)膜恢復(fù)至正常(圖3C～H)，而下調(diào)UCP4，線粒體“空泡樣”結(jié)構(gòu)增多(圖3D～H)。線粒體包含雙層膜，內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴。線粒體內(nèi)部出現(xiàn)的“空泡樣”結(jié)構(gòu)，可能是由于線粒體內(nèi)膜之間空隙的改變導(dǎo)致，即嵴間距增加，提示線粒體嵴間距增加可能與UCP4的變化有關(guān)。

A～D：使用透射電子顯微鏡分別觀察假手術(shù)組、NC組、OE組、KD組小鼠脊髓背角線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化(標(biāo)尺為500 nm)；E：線粒體圓率；F：線粒體密度；G：空泡面積；H：空泡周長(zhǎng)。NC組：正常對(duì)照組，OE組：UCP4過(guò)表達(dá)組，KD組：UCP4干擾組。n=3， aP<0.05， bP<0.01。圖3 NP狀態(tài)下線粒體超微結(jié)構(gòu)變化

2.4 上調(diào)脊髓背角UCP4能夠穩(wěn)定MMP，抗氧化能力增強(qiáng)

線粒體功能異常是痛覺(jué)敏化的重要機(jī)制[11]，靶向上調(diào)UCP4，可以顯著緩解小鼠機(jī)械性痛敏和熱痛敏，線粒體功能是否有改善呢？為了闡明此問(wèn)題，本研究分別取假手術(shù)組、NC組、OE組和KD組病毒注射后28 d的脊髓腰膨大組織，檢測(cè)MMP、SOD、GSH及ATP的功能指標(biāo)變化。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，NC組小鼠脊髓背角MMP超極化(圖4A)，OE組小鼠脊髓背角MMP去極化至恢復(fù)正常；而KD組小鼠MMP依舊超極化，與NC組結(jié)果一致(圖4B)?？寡趸芰z測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，NC組小鼠脊髓背角SOD活性減弱(P<0.01，圖4C)，GSH含量降低(P<0.01，圖4D)，但不影響ATP的產(chǎn)生(圖4E)。過(guò)表達(dá)脊髓背角UCP4，小鼠脊髓背角SOD活性增強(qiáng)(P<0.01，圖4C)，GSH含量升高(P<0.01，圖4D)，ATP產(chǎn)生增加(P<0.01，圖4E)。而KD組小鼠SOD、GSH和ATP與NC組結(jié)果一致(圖4C～E)。結(jié)果提示UCP4可能通過(guò)穩(wěn)定MMP及增強(qiáng)抗氧化能力參與調(diào)節(jié)NP。

A：注射病毒28 d后分別取假手術(shù)組、NC組、OE組和KD組的脊髓腰膨大組織，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MMP變化；B：MMP量化結(jié)果；C：SOD活性檢測(cè)；D：GSH含量檢測(cè)；E：ATP含量檢測(cè)。MMP：線粒體膜電位，SOD：超氧化物歧化酶，GSH：谷胱甘肽，ATP：腺嘌呤核苷三磷酸，PE：藻紅蛋白，F(xiàn)ITC：異硫氰酸熒光素，NC組：正常對(duì)照組，OE組：UCP4過(guò)表達(dá)組，KD組：UCP4干擾組。n=3， bP<0.01。圖4 靶向調(diào)節(jié)UCP4小鼠脊髓背角線粒體功能變化

3 討論

神經(jīng)性痛的特征包括持續(xù)性痛覺(jué)過(guò)敏、異位性痛覺(jué)和由于軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)敏感而引起的情感反應(yīng)，是慢性痛的常見(jiàn)來(lái)源。慢性痛可在最初的損傷愈合后持續(xù)存在，因此與疼痛傳遞途徑的結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化有關(guān)，特別是在初級(jí)傳入神經(jīng)和脊髓的水平[12]。在本研究中，作者證實(shí)SNI后脊髓背角UCP4表達(dá)量下降，同時(shí)檢測(cè)到線粒體內(nèi)膜出現(xiàn)大量“空泡樣”結(jié)構(gòu)，膜電位超極化及抗氧化能力減弱，而靶向上調(diào)脊髓背角UCP4，顯著緩解小鼠機(jī)械性痛敏和熱痛敏，具有明顯的鎮(zhèn)痛效果。線粒體超微結(jié)構(gòu)“空泡樣”結(jié)構(gòu)減少甚至消失，MMP恢復(fù)正常，抗氧化能力增強(qiáng)。提示UCP4可能在NP的中樞敏化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。

解偶聯(lián)蛋白家族成員在疼痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13]。有研究報(bào)道解偶聯(lián)蛋白UCP1通過(guò)激活棕色脂肪中的腎上腺素能受體參與肌肉骨骼痛覺(jué)過(guò)敏[14]；UCP2參與紫杉醇誘發(fā)的NP機(jī)制的調(diào)節(jié)[15]；在咬合改變誘發(fā)的疼痛機(jī)制中，UCP3表達(dá)降低[16]。但是對(duì)于UCP4在NP中的研究尚且較少，目前僅有課題組前期的研究，結(jié)合本文靶向調(diào)控UCP4可以顯著改善SNI小鼠機(jī)械性痛敏和熱痛敏的結(jié)果，提示UCP4可能在NP的產(chǎn)生與調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，但是具體機(jī)制仍有待闡明。

UCP4定位于線粒體內(nèi)膜，可以跨越脂質(zhì)雙分子層，消除線粒體呼吸鏈電子傳輸過(guò)程中產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈的解偶聯(lián)，在調(diào)控MMP變化、氧化應(yīng)激等功能中起著關(guān)鍵作用[17]。有文獻(xiàn)報(bào)道哺乳動(dòng)物細(xì)胞UCP4過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致MMP降低，從而減弱細(xì)胞的氧化應(yīng)激[18]。利用TMRE熒光染色法證明，人UCP4基因在PC12細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可降低MMP[19]。在SH-SY5Y細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)UCP4，保留了ATP合成水平和MMP穩(wěn)定，且呼吸速率增加[20]。綜上所述，UCP4可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜穩(wěn)定性進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)元的保護(hù)作用。本文作者發(fā)現(xiàn)SNI后線粒體內(nèi)膜出現(xiàn)大量“空泡樣”結(jié)構(gòu)，膜電位超極化；而靶向上調(diào)脊髓背角UCP4，線粒體超微結(jié)構(gòu)“空泡樣”結(jié)構(gòu)減少甚至消失，MMP恢復(fù)正常，SNI小鼠表現(xiàn)出明顯的痛閾增加，疼痛緩解。提示UCP4可能通過(guò)調(diào)控線粒體膜穩(wěn)定性，增強(qiáng)脊髓背角神經(jīng)元功能，從而參與NP的調(diào)節(jié)。

研究證實(shí)，在1-甲基-4-苯基吡啶離子毒性介導(dǎo)72 h后的兒茶酚胺能神經(jīng)元中，UCP4的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，ROS產(chǎn)量減少，UCP4的抑制顯著增加了超氧化物水平，減少了降低的GSH含量[21]。本文中SNI小鼠脊髓背角SOD活性減弱和GSH含量減少，而靶向上調(diào)脊髓背角UCP4，抗氧化能力恢復(fù)至正常水平，證實(shí)了這一結(jié)論，提示UCP4可能通過(guò)改善線粒體抗氧化能力發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

NP小鼠上調(diào)脊髓背角UCP4，可糾正MMP超極化，并顯著恢復(fù)線粒體抗氧化功能，可進(jìn)一步緩解NP，UCP4有望成為治療NP的新靶點(diǎn)，具有一定的臨床意義。目前線粒體及其解偶聯(lián)蛋白已成為研究疼痛的潛在治療靶點(diǎn)，但是UCP4具體在脊髓背角的哪類(lèi)細(xì)胞中發(fā)揮作用，仍需進(jìn)一步探究，這也是本課題組下一步的研究計(jì)劃。