Panx1通道參與脈沖電磁場(chǎng)對(duì)三叉神經(jīng)痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)的研究

王 盼，司華興,，婁安新,，趙 菡，邢珂珂，劉小蝶，陳 濤(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，陜西 西安 700；西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 70069；延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 76099)

原發(fā)性三叉神經(jīng)痛(trigeminal neuralgia，TN)是一種發(fā)病原因不明的頭面部神經(jīng)病理性痛，可導(dǎo)致軀體傷害，引起負(fù)性情緒反應(yīng)和認(rèn)知損害，嚴(yán)重影響患者的身心健康及生活質(zhì)量[1]。卡馬西平是目前治療TN的首選藥物，僅有69%的患者能獲得疼痛緩解，部分患者應(yīng)用后治療效果不佳，并且可產(chǎn)生耐藥性，以及誘發(fā)藥物性皮疹、眩暈、復(fù)視和共濟(jì)失調(diào)等嚴(yán)重不良反應(yīng)[2-3]；而采用經(jīng)皮三叉神經(jīng)根切斷術(shù)、射頻熱凝術(shù)、微血管減壓術(shù)等外科方法治療后，除復(fù)發(fā)率較高的問(wèn)題外，還存在術(shù)后面部麻木、面神經(jīng)功能障礙及聽(tīng)力異常等風(fēng)險(xiǎn)[4]。脈沖電磁場(chǎng)(pulsed electromagnetic field，PEMF)作為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的一種無(wú)創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、安全的物理治療手段，最初主要用于治療骨不連及骨折延遲愈合[5]。近年來(lái)多項(xiàng)臨床研究證明，PEMF能夠明顯緩解骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)炎引起的各類慢性疼痛[6]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也揭示PEMF能夠明顯緩解骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)炎的疼痛，同時(shí)并未導(dǎo)致明顯的不良反應(yīng)[7]，然而PEMF是否能夠?qū)N產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛效果尚未見(jiàn)報(bào)道。

三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(trigeminal caudal subnucleus，Vc)是口面部痛溫覺(jué)信息傳遞及整合的關(guān)鍵核團(tuán)，在TN的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用[8]。Panx1通道在靜息狀態(tài)下保持關(guān)閉狀態(tài)，若開(kāi)放則與多種病理過(guò)程關(guān)系密切，如局部缺血時(shí)神經(jīng)元的死亡、NMDA受體的興奮性毒性、炎性小體的激活等[9]。近期有研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞中Panx1通道的開(kāi)放在慢性痛的發(fā)生及中樞敏化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，在脊髓背角的小膠質(zhì)細(xì)胞中通過(guò)抑制Panx1的表達(dá)可抑制IL-1β的釋放且不影響其上游P2X7R離子通道的功能，可顯著緩解慢性關(guān)節(jié)疼痛，為臨床上靶向Panx1治療關(guān)節(jié)炎引起的慢性痛提供了有力的理論支持[10]。神經(jīng)元內(nèi)NMDAR與Panx1關(guān)系密切，激活的NMDAR可引起Src激酶的升高，導(dǎo)致突觸后致密區(qū)大量分布的Panx1通道開(kāi)放，伴隨著腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)的釋放及Ca2+內(nèi)流等跨膜流動(dòng)。該機(jī)制在癲癇發(fā)作、局部缺血缺氧等中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理過(guò)程中起到重要作用[11]。近期有研究表明在下齒槽神經(jīng)損傷造成的口面部異常疼痛的SD大鼠中，三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)的NMDAR1(NR1)、p-Src及Panx1表達(dá)均顯著升高[12]。因此，筆者推測(cè)NMDAR1與Panx1是PEMF治療TN的重要作用靶點(diǎn)，在PEMF治療TN的病理生理過(guò)程中具有重要作用。綜上，本研究擬探索Vc神經(jīng)元內(nèi)Panx1參與PEMF對(duì)TN的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所使用的C57BL/6J小鼠均來(lái)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8～10周齡，體質(zhì)量22～26 g。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～26 ℃，濕度40%左右，飲食和飲水自由充足，光照自動(dòng)控制，晝夜交替節(jié)律為12 h，實(shí)驗(yàn)室正常通風(fēng)換氣。所有實(shí)驗(yàn)均按照空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理行政小組批準(zhǔn)的方案進(jìn)行(許可證號(hào)：IACUC-20210901)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、TN組和TN+PEMF組，每組10只小鼠。

1.2.2 TN動(dòng)物模型建立 采用眶下神經(jīng)結(jié)扎以建立TN模型鼠。C57小鼠注射20 g/L戊巴比妥鈉麻醉后仰臥位固定，手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。無(wú)菌操作，于鼠口腔內(nèi)沿左側(cè)齦頰邊緣，平第一磨牙水平向口鼻方向縱向切開(kāi)約0.5 cm長(zhǎng)切口，暴露眶下神經(jīng)并分離周圍組織，用兩根6-0鉻線疏松結(jié)扎，兩線相距2 mm。術(shù)后6-0絲線縫合切口并消毒。假手術(shù)組不進(jìn)行結(jié)扎，其他操作相同僅剝離眶下神經(jīng)。PEMF發(fā)生系統(tǒng)由信號(hào)發(fā)生器及HelmHoltz線圈構(gòu)成(GHY-III，F(xiàn)MMU，專利號(hào)ZL02224739.4)[13-14]。本研究中各組小鼠均被放入PEMF加載裝置線圈的中央，假手術(shù)組及TN組小鼠在加載過(guò)程中未開(kāi)啟信號(hào)發(fā)生器，而TN+PEMF組小鼠受到每日2 h，共計(jì)7 d的15 Hz、5 Gauss的PEMF刺激。

1.2.3 口面部機(jī)械痛測(cè)定 測(cè)試前將小鼠置于自制金屬網(wǎng)格籠中適應(yīng)30 min，用Von Frey絲測(cè)量小鼠觸須墊區(qū)域的機(jī)械刺激反應(yīng)。不同克重Von Frey絲分別為0.008、0.020、0.040、0.070、0.160、0.400、0.600、1.000、1.400、2.000 g。以出現(xiàn)頭部撤退反應(yīng)的最小刺激強(qiáng)度作為機(jī)械刺激強(qiáng)度閾值，每次刺激間隔最少為15 s。

1.2.4 自發(fā)痛行為測(cè)定 面部理毛行為是口面部自發(fā)性痛覺(jué)過(guò)敏的特征，因此在本研究中將統(tǒng)計(jì)小鼠口面部理毛時(shí)間評(píng)定自發(fā)痛行為。小鼠置于適應(yīng)測(cè)試籠中20 min后，用攝像機(jī)記錄小鼠行為10 min，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算單側(cè)不對(duì)稱理毛持續(xù)時(shí)間。

1.2.5 免疫熒光染色 7 d后常規(guī)麻醉固定取材，使用冰凍切片機(jī)切至30 μm。驢血清封閉后使用含Panx1抗體血清孵育切片4 ℃過(guò)夜，用PBS漂洗后加入熒光二抗室溫孵育4 h，裱片后使用熒光封片劑封片，在熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 Western blotting檢測(cè) 麻醉后切取對(duì)側(cè)的Vc腦組織，裂解后離心提取蛋白，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量，并將樣品煮沸使蛋白變性。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后利用恒流濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。封閉后孵育一抗于4 ℃冰箱過(guò)夜(鼠抗NR1，1 ∶1 000，Invitrogen公司；兔抗Panx1，1 ∶1 000，Invitrogen公司；兔抗p-Src，1 ∶1 000，CST公司)。二抗室溫孵育后進(jìn)行發(fā)光顯影并采集圖像，利用ImageJ軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 PEMF刺激緩解TN小鼠口面部機(jī)械痛及自發(fā)痛

本研究使用眶下神經(jīng)結(jié)扎模型進(jìn)行TN小鼠造模(圖1A)，以確定PEMF對(duì)于TN是否有鎮(zhèn)痛效應(yīng)。結(jié)果顯示，TN組小鼠的機(jī)械痛閾明顯降低、面部理毛活動(dòng)時(shí)間明顯增加(P<0.05，圖1B)，提示TN小鼠通過(guò)眶下神經(jīng)結(jié)扎后表現(xiàn)出明顯的口面部異常疼痛；而TN+PEMF組小鼠受到15 Hz、5 Gauss、2 h/d、7 d的PEMF刺激后，機(jī)械痛閾值上升及面部理毛時(shí)間明顯下降(P<0.05，圖1B)，以上結(jié)果表明PEMF刺激可顯著緩解機(jī)械痛及自發(fā)痛。

A：圖例顯示TN組小鼠行眶下神經(jīng)結(jié)扎步驟，平第一磨牙水平縱向切開(kāi)0.5 cm暴露眶下神經(jīng)后使用兩根鉻線疏松結(jié)扎；B：TN組小鼠機(jī)械痛及自發(fā)痛明顯異常，而PEMF刺激可顯著緩解機(jī)械痛及自發(fā)痛。TN組：三叉神經(jīng)痛組；TN+PEMF組：三叉神經(jīng)痛加脈沖電磁場(chǎng)治療組。n=6， aP<0.05。圖1 PEMF刺激對(duì)TN小鼠機(jī)械痛閾值及面部理毛時(shí)間的影響

2.2 PEMF刺激減少TN小鼠Vc內(nèi)Panx1的表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Panx1主要分布在Vc的Ⅲ層(圖2A)，而非Ⅰ～Ⅱ?qū)樱崾綪anx1可能與機(jī)械痛直接相關(guān)。染色結(jié)果顯示，TN組小鼠Vc內(nèi)Panx1、NeuN共同標(biāo)記的細(xì)胞明顯增多(圖2B)，提示TN組小鼠Vc神經(jīng)元內(nèi)Panx1的表達(dá)升高(P<0.05)；而TN+PEMF組與TN組相比則顯示出較少的Panx1及NeuN共標(biāo)細(xì)胞(P<0.05，圖2B)，表明神經(jīng)元內(nèi)Panx1的表達(dá)有所降低。

A：假手術(shù)組、TN組及TN+PEMF組小鼠Vc熒光染色圖及腦圖譜示意圖；B：Vc內(nèi)DAPI、Panx1及NeuN免疫熒光染色圖，其中DAPI為藍(lán)色、Panx1為紅色、NeuN為綠色。TN組：三叉神經(jīng)痛組；TN+PEMF組：三叉神經(jīng)痛加脈沖電磁場(chǎng)治療組。標(biāo)尺為200 μm。n=3， aP<0.05。圖2 Vc神經(jīng)元中Panx1分布表達(dá)的免疫熒光染色

2.3 PEMF下調(diào)TN小鼠Vc內(nèi)NR1-Src-Panx1通路

NR1與突觸可塑性及慢性痛的發(fā)生關(guān)系密切，通過(guò)Western blotting進(jìn)一步檢測(cè)了三組小鼠Vc內(nèi)NR1、p-Src以及Panx1的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，眶下神經(jīng)結(jié)扎后Vc內(nèi)三種分子的表達(dá)TN組相比假手術(shù)組均升高(P<0.01)，且TN+PEMF組三種分子的表達(dá)與TN組相比顯著降低(P<0.01，圖3)，提示PEMF刺激可以顯著下調(diào)TN小鼠Vc內(nèi)NR1-Src-Panx1通路。

A：Western blotting檢測(cè)圖；B：Western blotting檢測(cè)統(tǒng)計(jì)圖。TN組：三叉神經(jīng)痛組；TN+PEMF組：三叉神經(jīng)痛加脈沖電磁場(chǎng)治療組。n=5， aP<0.05， bP<0.01。圖3 PEMF刺激對(duì)TN小鼠Vc內(nèi)NR1、p-Src以及Panx1蛋白水平的影響

3 討論

TN是一種多發(fā)于中老年人群的常見(jiàn)頭面部神經(jīng)病理性痛，臨床癥狀多表現(xiàn)為單側(cè)面部三叉神經(jīng)支配區(qū)域內(nèi)的嚴(yán)重、短暫性刺痛和復(fù)發(fā)性疼痛。隨著我國(guó)人口老齡化及現(xiàn)今工作生活壓力的不斷增加，TN的發(fā)生率逐年增長(zhǎng)，已成為亟需解決的嚴(yán)重社會(huì)問(wèn)題。PEMF被證明可顯著緩解骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)炎引起的疼痛，但其是否可有效治療TN尚未見(jiàn)報(bào)道。

1985年，第一篇關(guān)于1 500 Gauss的電磁場(chǎng)可以減弱嗎啡的鎮(zhèn)痛效果的研究發(fā)表后逐漸引起學(xué)者重視[15]，隨后多項(xiàng)關(guān)于PEMF對(duì)于疼痛的動(dòng)物及臨床試驗(yàn)卻得出了完全不同的結(jié)論：鎮(zhèn)痛、促痛、無(wú)效均有報(bào)道。經(jīng)過(guò)梳理后可以初步得出：對(duì)于疼痛的作用的不一致主要是由于所加載的PEMF的參數(shù)如頻率、強(qiáng)度及加載時(shí)間等的不同引起的差別[16-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示特定頻率的刺激具有顯著的鎮(zhèn)痛效應(yīng)(15 Hz，5 Gauss，2 h/d，7 d)，同時(shí)此參數(shù)在課題組的前期研究中被驗(yàn)證對(duì)于破骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的凋亡具有抑制作用從而抑制骨吸收作用，具有骨質(zhì)疏松治療意義[14]，近期研究亦表明PEMF刺激可促進(jìn)腦出血后血腫清除，從而減輕炎癥反應(yīng)[13]。

Panx1是繼Connexin、Innexin后于2000年發(fā)現(xiàn)的新型縫隙連接蛋白Pannexin家族成員之一，且被發(fā)現(xiàn)廣泛分布在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種類型細(xì)胞中，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[19]。本研究中探明了PEMF刺激對(duì)于TN的潛在作用效果。我們使用眶下神經(jīng)結(jié)扎模型構(gòu)建TN小鼠模型，對(duì)小鼠施加15 Hz、5 Gauss的PEMF刺激后顯示其可顯著緩解TN小鼠口面部的機(jī)械痛和自發(fā)痛，提示PEMF對(duì)于TN口面部疼痛具有明顯的治療效應(yīng)。并且免疫熒光染色結(jié)果顯示TN小鼠Vc神經(jīng)元內(nèi)Panx1表達(dá)明顯增加，而PEMF刺激后Panx1表達(dá)明顯降低。既往研究顯示TN模型大鼠中三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)Panx1的表達(dá)升高[20]，與本研究結(jié)果一致；而用siRNA抑制其表達(dá)可以明顯緩解TN[21]。本研究進(jìn)一步探索了TN小鼠中Panx1相關(guān)通路分子的表達(dá)變化，明確了PEMF刺激可以下調(diào)TN小鼠Vc內(nèi)NR1-Src-Panx1通路從而達(dá)到鎮(zhèn)痛的效果，對(duì)于揭示TN的致病原理以及PEMF治療TN的臨床治療可提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。