LINC01980 在宮頸癌中的表達(dá)及調(diào)控LIN28B 表達(dá)促進(jìn)宮頸癌生長(zhǎng)的作用機(jī)制①

王春梅 吳德慧 康 燕 魏順英 馬登云 （青海紅十字醫(yī)院婦一科，西寧 810000）

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率較高，且逐漸年輕化，嚴(yán)重威脅女性健康［1］。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展，早期宮頸癌可通過(guò)手術(shù)、放化療治療，但晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者預(yù)后較差［2］。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，靶向治療為癌癥臨床治療提供了新思路，分析宮頸癌發(fā)展的相關(guān)機(jī)制可能為其臨床治療提供新方法［3］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 nt 的不具備蛋白編碼功能的RNA 分子，可與DNA、RNA 和蛋白相互作用，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白活性，參與染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活和抑制等生物學(xué)過(guò)程［4］。lncRNA 不僅參與機(jī)體正常生理活動(dòng)，在疾病發(fā)生發(fā)展尤其是腫瘤發(fā)生過(guò)程中具有重要作用，尋找宮頸癌中特異表達(dá)的lncRNA，并分析其在宮頸癌中的分子機(jī)制，可能有助于尋找宮頸癌治療靶點(diǎn)，為宮頸癌靶向治療提供新思路［5］。課題組前期生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中LINC01980表達(dá)顯著上調(diào)，與肝癌、食管癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，但其在宮頸癌中的表達(dá)及其對(duì)宮頸癌的影響尚未闡明［6-8］。LIN28B 是一種保守RNA 結(jié)合蛋白，與宮頸癌、卵巢癌等女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)，可能是治療女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的潛在靶標(biāo)［9-10］。本研究生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，LIN28B 與LINC01980 具有相互作用位點(diǎn)，因此，本研究擬探討LINC01980在宮頸癌中的表達(dá)及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響的可能機(jī)制，為宮頸癌治療提供新的靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 選取2020 年1 月至2021 年5 月青海紅十字醫(yī)院收治的病理學(xué)診斷為宮頸癌的患者60 例作為宮頸癌組，年齡35～67 歲，平均年齡（48.78±8.83）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受手術(shù)、放化療等治療；②合并其他婦科疾病者；③合并肝、腎等重大功能臟器不全者；④合并其他惡性腫瘤患者。選取同期青海紅十字醫(yī)院健康體檢者（宮頸未發(fā)生病變）60 例作為健康組，年齡33～70 歲，平均年齡（47.95±10.89）歲。兩組研究對(duì)象年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。研究經(jīng)青海紅十字醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑與儀器 人宮頸癌細(xì)胞系Hela（TCHu187）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；MEM培養(yǎng)基（41500034）、胎牛血清（10099）、胰蛋白酶（25200056）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；Lipofectamine3000試劑盒（L3000015）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RNAiso plus（9108Q）購(gòu)自日本TaKaRa 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（205311）、qRT-PCR 試劑盒（204443）購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司；CCK-8（C0037）、蛋白提取試劑盒（P0012）、BCA 蛋白定量試劑盒（C1062）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；DNA 含量檢測(cè)試劑盒（細(xì)胞周期，CA1510）、AnnexinV Alexa Fluor488/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（CA1040）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；protein A/G 磁珠（sc-2003）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Technology公司；Magna RIP Kit（17-701）購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore；PierceTM生物素 3'末端DNA 標(biāo)記試劑盒（89818）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1，ab16663）、周期蛋白依賴性激酶4（Cyclin-dependent kinases 4，CDK4，ab108357）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3，ab32351）、β-actin（ab8227）、山羊抗兔IgG H&L（ab6721）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；LINC01980、LIN28B、GAPDH 引物和siRNA 質(zhì)粒、siNC 質(zhì)粒、pcDNA3.1載體、pcDNA3.1-LINC28B 質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；NanoDrop one 超微量分光光度計(jì)、Multiskan FC 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；CFX96 Touch 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、Gel-Doc XR蛋白凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)工具iBio Tools V5.0（http://www.chrisapp.xyz：3838/R/AnnoE2/，設(shè)置參數(shù)：P＜0.05，logFC=1）預(yù)測(cè)宮頸癌差異表達(dá)基因，catRAPID（http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group）預(yù)測(cè)lncRNA 與蛋白的相互結(jié)合關(guān)系，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)LINC01980與LIN28B相互作用關(guān)系，提示辨識(shí)度（Discriminative Power）＞20%可能發(fā)生交互作用，＞75%極有可能存在交互作用。

1.2.2 血液采集 宮頸癌患者于術(shù)前、對(duì)照組于體檢當(dāng)日抽取肘部靜脈血3 ml，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至新離心管，-80 ℃保存。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 常規(guī)復(fù)蘇宮頸癌細(xì)胞系Hela，加至含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，2～3 d 更換1 次培養(yǎng)液，細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)胰蛋白酶消化傳代。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為6×105個(gè)/孔，接種至6 孔板，細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)更換為無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基，按照Lipofectamine3000 試 劑 盒 說(shuō) 明 書 將 Lnc-NC、si-LINC01980、si-LINC01980+LIN28B-NC、si-LINC01980+LIN28B 分別轉(zhuǎn)染至Hela 細(xì)胞，分為L(zhǎng)nc-NC 組、si-LINC01980 組、si-LINC01980+LIN28B-NC 組 和si-LINC01980+LIN28B 組，對(duì)照組僅添加新鮮培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 qRT-PCR 檢測(cè)血清及細(xì)胞中LINC01980、LIN28B mRNA 表達(dá) RNAiso Plus 試劑盒提取血清及Hela細(xì)胞中總RNA并檢測(cè)濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 45 s，變性95 ℃ 30 s，退火60/58/62 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算血清及Hela 細(xì)胞中LINC01980、LIN28B mRNA相對(duì)表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 RNA 免疫共沉淀 收集Hela 細(xì)胞，離心，加入等體積RIP裂解緩沖液吹打懸浮，取5 g 蛋白抗體于免疫沉淀緩沖液內(nèi)與protein A/G 磁珠結(jié)合2 h，加入100 μl 細(xì)胞裂解物，4 ℃輕柔攪動(dòng)孵育1 h，離心，棄上清，加入400 μl洗脫緩沖液4 ℃孵育2 h，TRIzol提取RNA，qRT-PCR 檢測(cè) LINC01980表達(dá)。

1.2.6 RNA pull-down 根據(jù)RNA pull-down 試劑盒說(shuō)明書實(shí)驗(yàn)，將生物素標(biāo)記的LINC01980 轉(zhuǎn)染至Hela 細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液和鏈霉親和素瓊脂糖珠4 ℃孵育 3 h，預(yù)冷裂解緩沖液洗滌3 次，十二烷基硫酸鈉緩沖液中回收蛋白，Western blot檢測(cè)LIN28B表達(dá)。

1.2.7 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力 收集1.2.3 中轉(zhuǎn)染后的各組Hela 細(xì)胞，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù) 3 個(gè)復(fù)孔，棄原培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μl CCK-8 試劑和100 μl 新鮮培養(yǎng)基，37 ℃避光培養(yǎng)2 h，棄上清，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度（OD）值，細(xì)胞活力（%）=實(shí)驗(yàn)孔OD 值/對(duì)照孔OD值×100%。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HTR-8/Svneo 細(xì)胞周期及凋亡 收集1.2.3 中轉(zhuǎn)染48 h 的各組Hela 細(xì)胞，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)復(fù)孔，PBS 洗滌， 1 500 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞并調(diào)整濃度為 1×106個(gè)/ml，吸取1 ml 細(xì)胞懸液，離心，棄上清，70%預(yù)冷乙醇固定2 h，PBS 洗滌，離心，加100 μl RNase A 溶液，重懸細(xì)胞，37 ℃水浴30 min，加入400 μl PI染色液混勻，4 ℃遮光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。收集1.2.3 中轉(zhuǎn)染48 h 的各組Hela 細(xì)胞，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)復(fù)孔，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，PBS 洗滌，Binding Buffer 重懸細(xì)胞，吸取100 μl細(xì)胞懸液加至流式管，再加入5 μl室溫遮光孵育10 min，加入5 μl PI 染色液室溫遮光孵育5 min，加入PBS 至500 μl，混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.9 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá) 收集1.2.3 中培養(yǎng)48 h 的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 5×104個(gè)/孔，加至24孔板，棄上清，PBS洗滌，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)復(fù)孔，試劑盒提取細(xì)胞總蛋白并檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳，封閉，分別加入兔抗人CyclinD1、CDK4、caspase-3、β-actin 稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜，加入山羊抗兔IgG H&L 二抗稀釋液（1∶2 000 稀釋），室溫孵育1 h，TBST 洗膜，蛋白凝膠成像儀成像，Image J 分析蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組與健康組血清LINC01980、LIN28B mRNA 表達(dá)比較 生物信息學(xué)工具iBio Tools V5.0（http://www.chrisapp.xyz：3838/R/AnnoE2/）預(yù)測(cè)結(jié)果表明，LINC01980在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)（圖1A）。與健康組比較，宮頸癌組血清LINC01980、LIN28B mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.001，圖1B）。

圖1 兩組血清LINC01980、LIN28B mRNA表達(dá)Fig.1 Expressions of serum LINC01980 and LIN28B mRNA in two groups

2.2 生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)LINC01980 結(jié)合蛋白 生物信息學(xué)網(wǎng)站（http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group）預(yù)測(cè)結(jié)果表明：LINC01980 RNA 與LIN28B 存在結(jié)合位點(diǎn)，且在1841-1990 處辨識(shí)度達(dá)88%，極有可能發(fā)生相互作用（表2）。

表2 生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)LINC01980結(jié)合蛋白Tab.2 Binding proteins of LINC01980 predicted by bioinformatics website

2.3 RNA 免 疫 共 沉 淀、RNA pull-down 檢 測(cè)LINC01980 與LIN28B 結(jié)合 RNA 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與IgG 相比，免疫沉淀復(fù)合物中LINC01980 含量顯著升高（P＜0.001，圖2A），RNA pull-down 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LINC01980 正義鏈下拉的沉淀物中檢測(cè)出LIN28B 表達(dá)（圖2B）。提示LINC01980與LIN28B發(fā)生相互作用。

圖2 LINC01980、LIN28B結(jié)合驗(yàn)證圖Fig.2 LINC01980 and LIN28B combination verification diagram

2.4 沉 默LINC01980 對(duì)Hela 細(xì) 胞LINC01980、LIN28B mRNA 表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，Lnc-NC組LINC01980、LIN28B mRNA 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），si-LINC01980 組 LINC01980、LIN28B mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 Hela細(xì)胞LINC01980、LIN28B mRNA表達(dá)Fig.3 LINC01980 and LIN28B mRNA expressions in Hela cells

2.5 沉默LINC01980 對(duì)Hela 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與對(duì)照組比較，Lnc-NC 組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期G0/G1期、S 期、G2/M 期細(xì)胞百分比、CyclinD1、CDK4、caspase-3 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），si-LINC01980 組細(xì)胞活力、S 期、G2/M 期細(xì)胞百分比、CyclinD1、CDK4、LIN28B 蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞百分比、caspase-3 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.001，圖4）。

圖4 沉默LINC01980表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of silencing LINC01980 expression on Hela cell growth

2.6 過(guò)表達(dá)LIN28B逆轉(zhuǎn)了沉默LINC01980對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 與si-LINC01980 組比較，si-LINC01980+LIN28B NC 組Hela 細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率、G0/G1期、S 期、G2/M 期細(xì)胞百分比、CyclinD1、CDK4、caspase-3 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），si-LINC01980+LIN28B 組細(xì)胞活力、S 期、G2/M 期細(xì)胞百分比、CyclinD1、CDK4、LIN28B蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞百分比、caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.001，圖5）。

圖5 過(guò)表達(dá)LIN28B逆轉(zhuǎn)了沉默LINC01980對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Fig.5 Overexpression of LIN28B reversed inhibitory effect of silencing LINC01980 on growth of cervical cancer cells

3 討論

宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，同時(shí)也是女性第四大常見惡性腫瘤，其發(fā)生主要與高危型人乳頭狀瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）持續(xù)感染有關(guān)［11］。手術(shù)和放化療等雖然有效降低了宮頸癌病死率，但晚期宮頸癌患者預(yù)后較差，宮頸癌仍是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因之一［12］。lncRNA是由200～300 個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，部分lncRNA 可作為惡性腫瘤診斷和預(yù)后的潛在靶標(biāo)和生物標(biāo)志物［13-14］。LINC01980 是 一種新發(fā)現(xiàn)的癌癥相關(guān)lncRNA，研究表明肝癌組織中LINC01980 表達(dá)顯著高于癌旁組織，LINC01980高表達(dá)的肝癌患者預(yù)后較差，且敲除LINC01980 能夠抑制肝癌細(xì)胞Huh7 和Hep3B 增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6］。微列陣分析表明，LINC01980 在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中顯著上調(diào)，且與癌癥TNM 分期、組織浸潤(rùn)和患者預(yù)后有關(guān)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明LINC01980能夠促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌生長(zhǎng)［8］。本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，LINC01980在宮頸癌中表達(dá)上調(diào)，臨床試驗(yàn)顯示宮頸癌患者血清中LINC01980表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組，提示在宮頸癌中LINC01980 表達(dá)異常。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默LINC01980 可抑制宮頸癌細(xì)胞Hela 活力，提高G0/G1期細(xì)胞百分比，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。CyclinD1是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的主要蛋白之一，與CDK4 形成復(fù)合物調(diào)控G1期細(xì)胞向S 期過(guò) 渡［15］。本 研 究Western blot 結(jié) 果 表 明，沉 默LINC01980 能夠抑制蛋白CyclinD1 和CDK4 表達(dá)，提示LINC01980可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡參與宮頸癌Hela 細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，具體機(jī)制有待進(jìn)一步分析。

lncRNA 通過(guò)堿基互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)形成頸環(huán)，能夠與DNA、RNA 和蛋白相互作用，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平影響基因表達(dá)，進(jìn)而參與染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活和抑制、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程［16-17］。lncRNA?；撬嵘险{(diào)基因1（taurine-upregulated gene 1，TUG1）通過(guò)靶向極光激酶A（aurora kinase A，AURKA）促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3增殖和侵襲［18］。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，LINC01980 與LIN28B 存在相互作用。LIN28B 是一種高度保守的RNA 結(jié)合蛋白，在胚胎干細(xì)胞和發(fā)育組織中高表達(dá)，參與細(xì)胞發(fā)育、代謝重編程、腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過(guò)程［19］。LIN28B 可通過(guò)直接結(jié)合mRNA 或阻斷miRNA 生物合成調(diào)節(jié)基因表達(dá)［20］。Let-7是一種腫瘤抑制因子，研究表明LIN28B 能夠通過(guò)與let-7 前體末端相結(jié)合阻斷Let-7 生物合成［21］。本研究表明，在Hela 細(xì)胞中沉默LINC01980 表達(dá)，LIN28B 表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)LIN28B 可逆轉(zhuǎn)沉默LINC01980 對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，提示LINC01980 協(xié)同LIN28B 在Hela細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮作用。本研究證實(shí)LIN28B是LINC01980 的結(jié)合蛋白且存在相互作用，提示LINC01980 可結(jié)合LIN28B，抑制Hela 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但LINC01980與LIN28B蛋白的結(jié)合序列及具體作用機(jī)制尚不明確，是后續(xù)研究重點(diǎn)。

綜上，LINC01980 在宮頸癌中過(guò)表達(dá)，沉默LINC01980 能夠抑制宮頸癌Hela 細(xì)胞生長(zhǎng)，可能與LINC01980 調(diào)控LIN28B 有關(guān)。但本研究?jī)H通過(guò)生物學(xué)分析及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討了LINC01980可能通過(guò)調(diào)控LIN28B 影響宮頸癌Hela 細(xì)胞生長(zhǎng)，需在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證，且LINC01980 是否通過(guò)其他途徑影響宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)有待后續(xù)研究。