花葉萬年青功能成分提取條件優(yōu)化與活性探究

馬 波，陶 震，周 瑞，王 雪，呂茜茜，孫士紅，王 寒，高金秋，張楚涵，陳鳳清，*

(1.白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 白城 137000； 2.白城師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 白城 137000)

花葉萬年青(DieffenbachiapictaLodd)也稱黛粉葉，為常綠灌木狀草本植物，屬于天南星科(Araceae)花葉萬年青屬(Dieffenbachia)。天南星科植物多為藥用植物[1]，含有大量生物堿、總黃酮、氨基酸、甾醇類等多種天然產(chǎn)物[2]，其中，生物堿類成分具有殺蟲、殺菌作用，植物多糖具有多種藥理活性，如抗氧化、抗炎性反應(yīng)、增強(qiáng)免疫等[3]。

使用化學(xué)農(nóng)藥可導(dǎo)致病蟲害抗藥性和環(huán)境污染等一些問題，也將威脅到人類健康。因此，利用植物功能成分研制新型抗菌劑、殺蟲劑，開發(fā)綠色農(nóng)藥具有重要意義。生物堿是植物中重要的生物活性物質(zhì)之一，目前已報道了多種植物的生物堿提取條件[4]。天南星科中的很多植物為中國傳統(tǒng)中藥，且分布廣泛，但對其資源的研究與開發(fā)力度比較薄弱。目前對天南星科植物的化學(xué)成分研究主要集中在天南星屬、半夏屬和菖蒲屬，但發(fā)現(xiàn)的生物堿僅70余個。生物堿作為一類具有較高價值的藥用成分，現(xiàn)階段的研究成果顯然不能充分發(fā)揮其藥用價值。前人對花葉萬年青的研究多集中于栽培、繁殖、觀賞等方面[1]，而對其生物堿提取及其活性研究則未見報道。本文采用超聲波乙醇浸提法，通過正交設(shè)計優(yōu)化花葉萬年青生物堿提取工藝；通過殺蟲試驗，初步研究花葉萬年青生物堿對3種供試害蟲的殺滅作用；通過抑菌試驗，研究花葉萬年青生物堿對7種供試菌種的抑菌活性，旨在為植物源殺蟲劑的開發(fā)與研制提供理論依據(jù)。

植物多糖具有多種活性作用，如抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等[5-7]。目前天南星科植物水溶性多糖的研究多見于芋頭[8]、半夏[9-10]、石菖蒲等植物，對花葉萬年青可溶性多糖生物活性的研究尚未見文獻(xiàn)報道。本文通過自由基清除法試驗和Fe3+還原性試驗，研究花葉萬年青多糖的抗氧化活性，以期為開發(fā)花葉萬年青多糖的藥用價值提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花葉萬年青為實驗室栽種。菌種有大腸埃希菌(Escherichiacoli)(CMCC44103)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(CMCC26003)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(CMCC10104)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(CMCC63501)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysentery)(CMCC51105)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)(CMCC50071)，購于中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心(CMCC)，于實驗室低溫保藏。試驗用蟲有棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)(4齡幼蟲)、小菜夜蛾(Plutellaxylostella)(3齡幼蟲)、大麥蟲(Zophobasatratus)(30日齡)，購于活體昆蟲專業(yè)供應(yīng)商河南省濟(jì)源白云實業(yè)有限公司。

儀器主要有酶標(biāo)測試儀(伯爵ELX800)、超聲波清洗儀(深華泰PS-100A)、紫外分光光度計(島津UVmini-1240)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RF52-2(上海滬西分析儀器有限公司)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試材處理

室內(nèi)盆栽：從花葉萬年青植株上選取無病蟲害、長40 cm以上、帶有3或4片舒展葉的分枝，移至裝有校園內(nèi)樹林土的花盆中，每盆1株，若干盆，常規(guī)管理。待株高長至80 cm以上時，以方便取材的葉做為試材，收集枯老葉片，于50～60 ℃烘干，粉碎。

1.2.2 多糖提取的單因素與正交試驗設(shè)計

采用苯酚-硫酸法[7]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：葡萄糖質(zhì)量c(mg)=2.985 5×D485-0.042，R2=0.999 3。

以料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g·mL-1)、提取時間(1、1.5、2、2.5、3 h)、提取溫度(75、80、85、90、95 ℃)、提取次數(shù)(1、2、3次)為研究對象，依次考察各因素不同水平下花葉萬年青多糖得率。多糖得率(mg·g-1)=提取液中多糖含量/樣品質(zhì)量。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，按照4因素3水平，采用L9(34)正交試驗法優(yōu)化花葉萬年青多糖提取工藝，因素水平見表1。通過穩(wěn)定性試驗、精密度試驗和加標(biāo)回收率試驗，驗證正交優(yōu)化結(jié)果的可行性。

表1 多糖提取的正交試驗因素水平表

1.2.3 生物堿提取的單因素與正交優(yōu)化試驗

參照文獻(xiàn)[11]改進(jìn)生物堿薄層層析方法，以鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)品，驗證生物堿存在。

采用溴甲酚綠法[12]，以鹽酸小檗堿為對照品，制作生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：鹽酸小檗堿質(zhì)量c(μg)=192.55×D417+1.010 1，R2=0.999 4。

以料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 mL·g-1)、超聲時間(40、60、80、100、120 min)、超聲溫度(50、58、66、74、80 ℃)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(75%、80%、85%、90%、95%)為研究對象，依次考察各因素不同水平下花葉萬年青生物堿得率。其中，生物堿得率(mg·g-1)=提取液中生物堿含量/樣品質(zhì)量。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，按照4因素3水平，采用L9(34)正交試驗設(shè)計法優(yōu)化花葉萬年青生物堿提取工藝，因素水平見表2。

表2 生物堿提取的正交試驗因素水平表

1.2.4 多糖提取物抗氧化活性探究

將多糖提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、烘干后得到粗多糖粉末，分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g粗多糖粉末，用80%乙醇溶解并定容至100 mL，分別得1、2、3、4、5 g·L-1(按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，相當(dāng)于多糖濃度分別為0.862、1.724、2.585、3.447、4.309 g·L-1)粗多糖溶液。

以維生素C(VC)為對照，分別研究花葉萬年青多糖清除ABTS自由基、DPPH自由基、羥基自由基(·OH)作用及對Fe3+還原能力的影響。清除ABTS自由基測定方法參照文獻(xiàn)[13-16]，清除DPPH自由基測定方法參照文獻(xiàn)[14-15]，清除羥基自由基(·OH)測定方法參照文獻(xiàn)[15]，F(xiàn)e3+還原能力測定方法參照文獻(xiàn)[16-17]。

1.2.5 生物堿提取物殺蟲作用

將生物堿提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到生物堿提取物浸膏，分別稱取1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 g生物堿提取物浸膏溶于20 mL殺蟲液溶劑(吸取50 μL吐溫80和50 μL 95%乙醇，用蒸餾水定容至100 mL[18])，分別得55、60、65、70、75、80 mg·mL-1(按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，相當(dāng)于生物堿濃度分別為0.635、0.692、0.750、0.808、0.866、0.923 mg·mL-1)生物堿殺蟲試液。

以生物堿殺蟲死亡率為考察指標(biāo)，采用均勻設(shè)計法實施殺蟲試驗，試驗設(shè)計見表3。對于幾種試驗蟲，按蟲體浸漬法，每次處理30頭，在12、24、36 h統(tǒng)計死亡數(shù)量，計算死亡率。蟲體死亡率(%)=(總死亡個數(shù)/總蟲數(shù))×100[18-19]。

表3 均勻設(shè)計表

1.2.6 生物堿提取物抑菌活性

將生物堿提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到生物堿提取物浸膏，精確稱取0.125 g生物堿提取物浸膏，用80%乙醇溶解，定容至10 mL，制成12.5 g·L-1(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，相當(dāng)于生物堿濃度為0.144 g·L-1)生物堿提取液。

采用10倍稀釋法制備菌懸液，用濾紙片法進(jìn)行病原細(xì)菌的抑制試驗。通過抑菌圈直徑(d)來判定菌種對生物堿提取物的敏感程度：d<8 mm為不敏感或敏感度不明顯；8 mm≤d<10 mm為低度敏感；10 mm≤d<15 mm為中度敏感；15 mm≤d<20 mm為高度敏感；d≥20 mm為極度敏感[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每項試驗設(shè)置3個重復(fù)，用SPSS 26.0軟件處理數(shù)據(jù)，用Excel 2010軟件作圖，采用鄧肯多重比較法(Duncan’s multiple-range)對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，顯著性水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 花葉萬年青多糖提取結(jié)果

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

由圖1可知，提取溫度、時間、料液比和提取次數(shù)均對花葉萬年青多糖得率有不同程度的影響。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，適宜的溫度范圍為85～95 ℃，提取時間為1～3 h，料液比為1∶30～1∶40 (g·mL-1)，提取次數(shù)為1～3次；較佳單因素水平為提取溫度90 ℃、提取時間1.5 h、料液比1∶35 (g·mL-1)、提取次數(shù)2次。

圖1 提取時間、提取溫度、料液比、提取次數(shù)對花葉萬年青多糖提取的影響Fig.1 Effect of extraction time， extraction temperature， solid-liquid ratio and extraction times on the extraction of polysaccharide from D. picta

2.1.2 花葉萬年青多糖提取正交優(yōu)化試驗結(jié)果

結(jié)合表4和表5可知，各因素對花葉萬年青多糖得率的影響大小為料液比>提取次數(shù)>提取時間>提取溫度，最優(yōu)組合為A2B1C1D3，即花葉萬年青多糖提取較佳工藝為提取溫度90 ℃，提取時間1 h，料液比1∶30 (g·mL-1)，提取3次。

表4 花葉萬年青多糖提取正交試驗設(shè)計方案與結(jié)果

表5 極差分析結(jié)果

多重比較結(jié)果表明，4個因素的3個水平之間差異不顯著(P>0.05)，因此，如果綜合試驗成本考慮，將多糖提取最佳工藝確定為提取溫度85 ℃，提取時間1 h，料液比1∶30 (g·mL-1)，提取1次。

多糖得率的精密度實驗結(jié)果(表6)顯示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.3%，表明優(yōu)化的提取方案精密度良好。多糖得率的穩(wěn)定性試驗結(jié)果(表7)顯示，RSD為0.2%，表明樣品的穩(wěn)定性較好。加標(biāo)回收率試驗結(jié)果顯示，各部位回收率均在80%以上。優(yōu)化工藝條件方法學(xué)考察試驗結(jié)果表明，此工藝參數(shù)可靠、穩(wěn)定。

2.2 花葉萬年青生物堿提取結(jié)果

2.2.1 單因素試驗結(jié)果

提取料液比、超聲時間、超聲溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)均對花葉萬年青生物堿得率有不同程度的影響，根據(jù)單因素試驗結(jié)果(圖3)，認(rèn)為適宜的料液比范圍為1∶20～1∶40 (g·mL-1)，超聲時間為40～120 min，超聲溫度為50～80 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%～95%；較佳單因素水平為料液比1∶35 (g·mL-1)、超聲時間60 min、超聲溫度66 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)95%。

2.2.2 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

結(jié)合表8和9，各因素對花葉萬年青生物堿得率的影響大小為超聲溫度>超聲時間>料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)，設(shè)計正交試驗最優(yōu)組合為A1B3C2D2，即花葉萬年青葉生物堿提取較佳工藝為料液比1∶30 (g·mL-1)，超聲時間80 min，超聲溫度66 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%。多重比較結(jié)果顯示，液料比、超聲時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的3個水平之間差異不顯著(P>0.05)；超聲溫度的3個水平之間差異均顯著(P<0.05)，如果考慮試驗成本，建議生物堿提取最佳工藝為超聲溫度66 ℃，超聲時間40 min，料液比1∶30 (g·mL-1)，乙醇體積分?jǐn)?shù)85%。

由表6和表7可知，精密度試驗RSD為1.1%，表明方法精密度良好；穩(wěn)定性試驗結(jié)果的RSD為0.2%，表明樣品的穩(wěn)定性較好。加標(biāo)回收率試驗結(jié)果(圖4)顯示，回收率均在80%以上。說明優(yōu)化的工藝參數(shù)可靠、方法可行。

表6 花葉萬年青提取多糖和生物堿的精密度

表7 花葉萬年青多糖和生物堿提取的穩(wěn)定性

圖2 多糖加標(biāo)回收率Fig.2 Recovery rate of polysaccharide

2.3 花葉萬年青功能成分的生物活性

2.3.1 多糖的抗氧化活性

花葉萬年青多糖抗氧化活性主要有多糖對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基清除清除率，以及對Fe3+還原能力的影響。由圖5-A可知，花葉萬年青多糖對DPPH自由基有一定的清除能力，隨著花葉萬年青多糖質(zhì)量濃度的升高，自由基清除率均增加?；ㄈ~萬年青多糖清除DPPH自由基的半抑制濃度(IC50)為4.994 mg·mL-1，VC清除DPPH自由基的IC50為2.216 mg·mL-1，花葉萬年青多糖IC50大于VC的IC50，說明花葉萬年青多糖清除DPPH自由基能力弱于VC。

圖3 料液比、超聲時間、超聲溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)對花葉萬年青生物堿提取的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio， ultrasonic time， ultrasonic temperature and ethanol volume fraction on extraction of alkaloids from D. picta

表8 花葉萬年青葉部位生物堿提取正交試驗設(shè)計方案與結(jié)果

表9 極差分析結(jié)果

圖4 生物堿加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Fig.4 Recovery rate of alkaloid

由圖5-B可知，花葉萬年青多糖質(zhì)量濃度為0～5.0 mg·mL-1時，對ABTS自由基清除率表現(xiàn)出濃度依賴性；即隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，其ABTS自由基清除率逐漸升高。在5.0 mg·mL-1時，花葉萬年青多糖的自由基清除率達(dá)到48.60%。與玉竹多糖[21]相比，花葉萬年青多糖具有更強(qiáng)的ABTS自由基清除能力?；ㄈ~萬年青多糖清除ABTS自由基的IC50為7.75 mg·mL-1，VC清除ABTS自由基的IC50為2.708 mg·mL-1，花葉萬年青多糖IC50大于VC的IC50，說明花葉萬年青多糖清除ABTS自由基能力弱于VC。

由圖5-C可知，隨著花葉萬年青多糖質(zhì)量濃度的增加，其對羥基自由基的清除率增大。在5.0 mg·mL-1時，花葉萬年青多糖對羥基自由基的清除率達(dá)到40.86%；多糖濃度為2.0 mg·mL-1時，對羥基自由基的清除率與VC相近。與白鮮皮多糖抗氧化能力[22]相比，花葉萬年青多糖具有較好的抗氧化能力。但與山竹果皮多糖[23]相比，其對羥基自由基清除率較低?；ㄈ~萬年青多糖清除羥基自由基的IC50為24.063 mg·mL-1，VC清除羥基自由基的IC50為5.853 mg·mL-1，花葉萬年青多糖IC50大于VC的IC50，說明花葉萬年青多糖清除羥基自由基能力弱于VC。

由圖5-D可知，相同濃度下花葉萬年青多糖的鐵還原力低于VC。花葉萬年青多糖濃度達(dá)到5 mg·mL-1時，吸光度D700為0.338 6，表明花葉萬年青具有較強(qiáng)的抗氧化性?；ㄈ~萬年青多糖質(zhì)量濃度為1～3 mg·mL-1時，鐵還原力能力與花葉萬年青多糖的質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。與南瓜籽多糖[24]相比，花葉萬年青多糖的抗氧化性較弱。

A，DPPH自由基清除能力；B，ABTS自由基清除能力；C，羥基自由基清除能力；D，對Fe3+還原能力。A， DPPH free radical scavenging ability； B， ABTS free radical scavenging ability； C， Scavenging ability on hydroxyl radical； D， Fe3+ reduction ability.圖5 花葉萬年青多糖抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of polysaccharide from D. picta

2.3.2 生物堿的殺蟲作用

由表10可知，花葉萬年青生物堿提取物對3種試驗蟲的觸殺效果較好，棉鈴蟲在浸漬處理36 h后死亡率最高可達(dá)92.22%，蟲體死亡率隨觀察時間的延長而增加，觸殺效果為36 h(組合4除外)高于24 h和12 h。多重比較結(jié)果表明，棉鈴蟲在浸漬36 h后，組合1、2、3、5和6之間差異不顯著(P>0.05)，組合4與其他組合之間差異顯著(P<0.05)。小菜夜蛾在浸漬處理36 h后，死亡率最高可達(dá)96.67%，組合2和組合6之間差異不顯著(P>0.05)，組合1和組合3之間差異不顯著(P>0.05)，組合4和組合5之間差異不顯著(P>0.05)，其余組合之間差異顯著(P<0.05)，表明不同試驗組合對小菜夜蛾的觸殺效果不盡相同。大麥蟲在浸漬處理36 h后的死亡率最高可達(dá)96.67%；在相同觀察時間下，不同試驗條件下大麥蟲死亡率不同。

2.3.3 生物堿的抑菌作用

12.5 mg·mL-1生物堿提取物對不同菌的抑制效果有所不同，大腸埃希菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌的抑菌圈直徑分別為10.95、8.00、8.20、8.85、7.05、10.67、8.25 mm，說明12.5 mg·mL-1生物堿提取物對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌抑菌活性最強(qiáng)，其次是糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、痢疾志賀氏菌，而傷寒沙門氏菌表現(xiàn)出不敏感或敏感度不明顯。

表10 花葉萬年青生物堿殺蟲試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化了花葉萬年青葉片多糖和生物堿的提取工藝，多糖最佳提取條件為料液比1∶30 (g·mL-1)，提取次數(shù)3次，提取時間1 h，提取溫度90 ℃；生物堿的最佳提取條件為超聲溫度66 ℃，超聲時間80 min，料液比1∶30 (g·mL-1)，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%。抗氧化試驗結(jié)果表明，花葉萬年青多糖有顯著的體外抗氧化活性，對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基有明顯的清除作用，其IC50分別為4.994、7.75和24.063 mg·mL-1，均大于相應(yīng)對照物VC的IC50；花葉萬年青多糖對Fe3+有還原作用，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

花葉萬年青生物堿對大麥蟲、小菜夜蛾和棉鈴蟲均有很強(qiáng)的觸殺作用。浸漬次數(shù)1次、浸漬時間4 s、浸漬液濃度24 mg·mL-1、培養(yǎng)溫度65 ℃條件下對棉鈴蟲浸漬后36 h死亡率可達(dá)92.22%；浸漬次數(shù)6次、浸漬時間10 s、浸漬液濃度4 mg·mL-1培養(yǎng)溫度70 ℃條件下對小菜夜蛾和大麥蟲浸漬后36 h死亡率均可達(dá)96.67%。抑菌試驗結(jié)果顯示，花葉萬年青生物堿對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌抑菌活性最強(qiáng)，其次是糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、痢疾志賀氏菌，而對傷寒沙門氏菌表現(xiàn)出不敏感或敏感度不明顯。提示花葉萬年青在植物病蟲害的防治上具有較好的應(yīng)用前景，可為花葉萬年青資源的深入開發(fā)和利用提供依據(jù)，同時為新農(nóng)藥研制提供一定的科學(xué)參考。