丁香酚-β-D-葡萄糖苷的合成、熱裂解及其在卷煙中的應(yīng)用

梁德民，張 瑋，王嘉樂，費(fèi) 婷，李德國，奚 安，顧文博，吳 達(dá)

上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，上海市浦東新區(qū)秀浦路3733 號 201315

糖苷類物質(zhì)是許多天然香料的前體物，存在于自然界各種植物中，其本身無氣味或氣味很弱，常溫下性質(zhì)穩(wěn)定，但經(jīng)過熱解、酶解或水解等條件，斷裂糖苷鍵并釋放出香味成分［1-2］?；谏鲜鎏匦?，糖苷類香料在卷煙加香領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。段海波等［3］合成了天然等同結(jié)構(gòu)的玫瑰醇糖苷并添加至卷煙中，可以改善和修飾卷煙煙氣、減輕刺激性，且克服了玫瑰醇因揮發(fā)而導(dǎo)致的釋香不穩(wěn)定問題。郭亞勤等［4］研究了紅景天糖苷的熱裂解成分并應(yīng)用于卷煙中，發(fā)現(xiàn)紅景天糖苷具有豐富卷煙煙氣，提升煙氣細(xì)膩柔和度，降低雜氣的作用。曾世通等［5］研究合成了β-紫羅蘭醇糖苷，在主流煙氣中能裂解生成多種香味成分，且具有良好的釋放穩(wěn)定性和均勻性。李有桂等［6］報(bào)道了甲基環(huán)戊烯醇酮-β-D-吡喃葡糖苷的合成方法并進(jìn)行熱裂解實(shí)驗(yàn)，可為新型焦甜香煙用香原料的研發(fā)提供參考。

丁香酚（Eugenol），化學(xué)名稱為4-烯丙基-2-甲氧基苯酚（FEMA 2467），是一種重要的天然芳香酚類香原料，具有典型的強(qiáng)烈丁香和辛香特征，在食品、醫(yī)藥及卷煙調(diào)香領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［7］。丁香酚作為一種重要的煙用香原料，不僅能賦予卷煙辛香吃味，使卷煙的香氣質(zhì)、香氣量有所增加，煙氣中凸顯細(xì)膩、圓潤及柔和特征，還能夠降低卷煙煙氣的刺激性，對卷煙煙氣有積極正面的作用，但常溫下丁香酚在空氣中易氧化，且嗅香重、揮發(fā)性強(qiáng)，對加香穩(wěn)定性存在一定影響［8-9］。丁香酚-β-D-葡萄糖苷（以下簡稱丁香酚糖苷）是丁香酚的香味前體物，常溫下穩(wěn)定且不揮發(fā)，可明顯改善丁香酚在卷煙加香中存在的問題，具有較好的應(yīng)用前景［10-11］。因此，本研究中以實(shí)驗(yàn)室合成的丁香酚糖苷為研究對象，通過熱失重及熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜法對丁香酚糖苷進(jìn)行熱裂解規(guī)律研究，結(jié)合卷煙主流煙氣分析考察丁香酚的煙氣釋放及糖苷加香應(yīng)用效果，旨在為丁香酚糖苷類香料前體物在卷煙加香中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

空白未加香卷煙樣品（上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司提供）。

丁香酚（＞98%）、安伯萊特IR 120（H）離子交換樹脂（北京百靈威科技有限公司）；氫氧化鋰、甲醇鈉、正十七烷、葡萄糖及其他試劑（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；丁香酚-β-D-葡萄糖苷（自制，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)IR、NMR、HRMS表征，純度＞98%）。

TGA8000熱失重儀器（美國PerkinElmer公司）；5250 熱裂解儀（美國CDS 公司）；7890A/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；RM20H 轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)（德國Borgwaldt公司）；AV500核磁共振儀（500 MHz，德國Bruker 公司）；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；CIJECTOR 香精香料注射儀（德國Burghart 公司）；XS105DU 電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler 公司）；KBF240 恒溫恒濕箱（德國Binder公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖苷的合成

丁香酚糖苷的合成路線如圖1 所示，中間體和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)以NMR 進(jìn)行表征，產(chǎn)物4 為目標(biāo)化合物。

圖1 丁香酚-β-D-葡萄糖苷的合成路線Fig.1 The synthetic route for eugenol-β-D-glucoside

1.2.1.1 溴代四乙酰葡萄糖（1）的合成

參考文獻(xiàn)［12］的方法合成溴代四乙酰葡萄糖（1），得到淡黃色的固體，熔點(diǎn)為87～89 ℃，與文獻(xiàn)報(bào)道值［13-14］符合，產(chǎn)品需低溫保存。

1.2.1.2 丁香酚-2,3,4,6-四-O-乙?；?D-葡萄糖苷（3）的合成

取5.08 g（12.1 mmol）2,3,4,6-四-O-乙?；?D-葡萄糖溴化物，溶于30 mL丙酮中；另取丁香酚6.01 g（36.5 mmol），溶于氫氧化鋰的水溶液（1 mol/L，15 mL）中。將上述體系混合，室溫下劇烈攪拌3 h，通過薄層色譜法監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完成后，減壓將反應(yīng)體系中的丙酮除去，剩下的混合物用二氯甲烷（15 mL×3）萃取，合并的有機(jī)相再用10%氫氧化鈉溶液（15 mL×3）洗滌，洗滌后的有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾并減壓濃縮，得到粗產(chǎn)物。硅膠柱色譜法純化粗產(chǎn)物，洗脫劑：V石油醚∶V乙酸乙酯=5∶1，得到2.25 g 目標(biāo)化合物（3），為黃色油狀液體，產(chǎn)率為37%。1H NMR（500 MHz，CDCl3），δ：7.07（1H，s），6.74（1H，s），6.70（1H，s），5.95（1H，s），5.29（2H，d，J=7.9 Hz），5.19（1H，s），5.11（2H，d，J=17.6 Hz），4.93（1H，s），4.29（1H，s），4.19（1H，s），3.82（3H，s），3.80（1H，s），3.36（2H，s），2.07（12H，d，J=22.5 Hz）。13C NMR（125 MHz，CDCl3），δ：170.6，170.2，169.4，169.2，150.5，143.8，137.5，136.5，121.5，120.5，115.8，113.4，101.1，77.2，76.8，72.5，72.1，61.5，57.2，39.8，20.6，20.6，20.5，20.5；ESI-MS（m/z）：517.1［M+Na］+。

1.2.1.3 丁香酚葡萄糖苷（4）的合成

將2.25 g（4.55 mmol）產(chǎn)物3溶解在V二氯甲烷∶V甲醇=1 ∶4 的10 mL 混合溶液中，加入甲醇鈉245.9 mg（4.55 mmol），室溫?cái)嚢? h，通過薄層色譜法監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完成后，攪拌下加入安伯萊特IR 120（H）離子交換樹脂直至體系pH=6～7，體系經(jīng)過墊有硅藻土的漏斗過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮，得到粗產(chǎn)物。硅膠柱色譜法純化粗產(chǎn)物，洗脫劑：V石油醚∶V乙酸乙酯=1∶2 至純乙酸乙酯，進(jìn)行梯度洗脫，得到目標(biāo)化合物（4）1.45 g，為白色固體，產(chǎn)率為97%，熔點(diǎn)為131～132 ℃。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6），δ：7.00（1H，d，J=8.2 Hz），6.80（1H，s），6.67（1H，d，J=8.2 Hz），5.95（1H，td，J=16.9 Hz，6.8 Hz），5.19（1H，s），5.09（1H，s），5.04（2H，d，J=17.0 Hz），5.00（1H，d，J=5.1 Hz），4.84（1H，d，J=7.0 Hz），4.51（1H，s），3.74（3H，s），3.66（1H，d，J=11.9 Hz），3.44（1H，dd，J=11.6 Hz，5.8 Hz），3.30（2H，d，J=6.7 Hz），3.24（2H，s），3.14（2H，s）；13C NMR（125 MHz，DMSO-d6），δ：148.9，144.9，138.1，133.5，120.4，117.0，115.6，113.1，100.3，77.1，76.9，73.3，69.8，60.8，55.7，39.2；ESI-MS（m/z）：349.1［M+Na］+。

1.2.2 熱裂解研究

1.2.2.1 丁香酚糖苷的熱失重分析

分別稱取2 mg 丁香酚糖苷和丁香酚至不同的100 μL 氧化鋁盤中。以高純氮?dú)鉃檩d氣，流速為20 mL/min，以升溫速率為20 ℃min 從50 ℃升溫至600 ℃，記錄質(zhì)量變化曲線。

1.2.2.2 丁香酚糖苷的熱裂解分析

稱取1 mg 左右的丁香酚糖苷固體，置于填充有玻璃毛的小石英管中，另一頭用玻璃毛封上，將該石英管放入熱裂解儀的加熱絲中進(jìn)行有氧裂解，裂解產(chǎn)物可通過GC-MS進(jìn)行分析。

（1）熱裂解條件：

A.不同溫度條件下的裂解：裂解探頭起始溫度50 ℃，升溫速率20 ℃/ms，分別升溫至200、300、600、900 ℃后，分別保持30 s。

B.模擬卷煙燃燒裂解：按照Baker 裂解實(shí)驗(yàn)方法［15-16］，300 ℃保持5 s；30 ℃/s 升溫至900 ℃，保持5 s。

冷阱的捕集溫度為-60 ℃，冷阱進(jìn)樣條件為-60 ℃升至280 ℃，保持5 min。

（2）GC-MS 色譜條件：HP-5 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣He；載氣流量：1.0 mL/min；分流比：100∶1；升溫程序：40 ℃（3 min）離子源：EI 源；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；質(zhì)量掃描范圍：40～450 amu。

（3）裂解產(chǎn)物定性和分析：應(yīng)用NIST 和WILEY質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索定性熱裂解產(chǎn)物，采用峰面積歸一化法計(jì)算產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3 加香應(yīng)用研究

1.2.3.1 卷煙加香樣品制備

稱取0.2 g 丁香酚糖苷固體，溶解于10 mL 無水乙醇，配制濃度為20.0 g/L的溶液。

（1）煙絲加香：用香精香料注射儀將丁香酚糖苷溶液注射至空白卷煙中，每支卷煙加香量為10 μL，起始加香點(diǎn)為距煙絲與濾嘴連結(jié)處2 mm，終止加香點(diǎn)為距煙絲與濾嘴連結(jié)處58 mm。

（2）卷煙紙加香：使用香精香料注射儀將10 μL糖苷溶液均勻涂布在卷煙紙上。

分別取等量的丁香酚和無水乙醇采用相同方式加香制備對照卷煙和空白卷煙。

1.2.3.2 主流煙氣釋放分析

（1）主流煙氣粒相物分析：取平衡過的加香煙支，用轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)按照標(biāo)準(zhǔn)條件抽吸卷煙。用劍橋?yàn)V片捕集煙氣，每張濾片捕集20支卷煙的煙氣粒相物。抽吸畢，將捕集粒相物的劍橋?yàn)V片折疊，放入250 mL 錐形瓶中，加入20 mL 甲基叔丁基醚溶液及200 μL 5.0 mg/mL 正十七烷內(nèi)標(biāo)溶液，室溫下振蕩萃取30 min，靜置5 min。直接取樣進(jìn)行GC-MS分析。

（2）不同糖苷添加量分析：按不同加香量將丁香酚糖苷添加至卷煙煙絲中，同本節(jié)（1）中的操作方法，進(jìn)行GC-MS分析。

（3）逐口分析：將煙絲加香的卷煙樣品于轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)上分別收集卷煙的第2～第5口的逐口煙氣粒相物，同本節(jié)（1）的方法處理劍橋?yàn)V片后，進(jìn)行GC-MS分析。

（4）GC-MS條件：

色譜柱：DB-FATWAX UI 毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；載氣：He；載氣流量：1.0 mL/min；分流模式：不分流；程序升溫：離子源：EI源；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；質(zhì)量掃描范圍：35～450 amu。

（5）主流煙氣化合物定性和分析：應(yīng)用NIST 和WILEY質(zhì)譜庫檢索并定性主流煙氣化合物，采用內(nèi)標(biāo)半定量法計(jì)算產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱失重分析結(jié)果

丁香酚和丁香酚糖苷的熱失重DTG曲線如圖2所示。丁香酚的DTG曲線只有一個(gè)吸收峰，丁香酚質(zhì)量開始損失的溫度約為50 ℃，其質(zhì)量最大損失的溫度約為149.5 ℃。丁香酚糖苷的DTG曲線有兩個(gè)峰：第一個(gè)峰（小于100 ℃）可能是丁香酚糖苷中的水分、低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)而導(dǎo)致，而第二個(gè)峰是由于丁香酚糖苷分解而導(dǎo)致，質(zhì)量損失的起始溫度約為220 ℃，質(zhì)量損失的最終溫度約為370 ℃，其質(zhì)量最大損失的溫度約為290.5 ℃。丁香酚糖苷的熱解溫度相比丁香酚提高近170 ℃，因此，與丁香酚相比，丁香酚糖苷的熱穩(wěn)定性明顯提高，有利于其在卷煙中的應(yīng)用。

圖2 丁香酚和丁香酚糖苷的DTG曲線Fig.2 DTG curves of eugenol and eugenol glycoside

2.2 丁香酚糖苷熱裂解分析結(jié)果

不同溫度條件下丁香酚糖苷的裂解結(jié)果如圖3所示。300 ℃條件下，發(fā)現(xiàn)有裂解產(chǎn)物丁香酚產(chǎn)生，而200 ℃未發(fā)生裂解，這與熱失重的結(jié)論一致。如表1所示，丁香酚糖苷裂解的主要產(chǎn)物為丁香酚，其他產(chǎn)物主要有糠醛、苯酚和2-甲氧基苯酚等。模擬卷煙燃燒的熱裂解條件下，丁香酚糖苷裂解主要產(chǎn)物為丁香酚，占主要裂解產(chǎn)物的94%以上；裂解產(chǎn)物種類也未增加。

表1 不同溫度條件下的熱裂解產(chǎn)物峰面積Tab.1 Peak areas of pyrolysis products at different temperatures

圖3 由80 ℃分別升至200和300 ℃時(shí)丁香酚糖苷熱裂解的總離子流圖Fig.3 TIC chromatograms of eugenol glycoside under pyrolysis from 80 ℃to 200 ℃and 300 ℃respectively

2.3 加香卷煙的主流煙氣分析結(jié)果

2.3.1 主流煙氣中丁香酚的釋放量

考察丁香酚糖苷裂解產(chǎn)物在卷煙主流煙氣中的釋放情況。將空白、煙絲添加糖苷及卷煙紙?zhí)砑犹擒?、煙絲添加丁香酚的卷煙樣品在標(biāo)準(zhǔn)條件下抽吸，采用GC-MS法分析其主流煙氣粒相物成分。表2為主流煙氣中主要代表性成分的化合物釋放情況，結(jié)果表明：①與空白卷煙相比，添加丁香酚糖苷的卷煙主流煙氣中產(chǎn)生丁香酚，焦糖化產(chǎn)物有些許增加，其他組分變化不明顯。表明丁香酚糖苷在卷煙燃吸的過程中除糖苷鍵斷裂生成丁香酚外，無其他明顯副反應(yīng)發(fā)生；此外，添加丁香酚的卷煙主流煙氣中也產(chǎn)生丁香酚。②對比糖苷在卷煙中的兩種加香方式可知，煙絲加香卷煙主流煙氣中丁香酚釋放量明顯高于卷煙紙加香。這表明煙絲加香條件下，裂解生成的丁香酚更易進(jìn)入主流煙氣中，而卷煙紙加香裂解生成的丁香酚可能更易進(jìn)入到側(cè)流煙氣中。以不同加香方式在卷煙中添加糖苷，可達(dá)到不同的加香效果。

表2 卷煙樣品主流煙氣中主要代表性成分的釋放量①Tab.2 Releases of representative components in mainstream smoke of cigarette samples

2.3.2 糖苷添加量對主流煙氣丁香酚釋放量的影響由圖4可以看出，卷煙煙氣中丁香酚的釋放量隨著糖苷添加量的增加而增大，在所設(shè)加香濃度的梯度下，丁香酚的釋放量與糖苷添加量基本上呈線性關(guān)系。

圖4 主流煙氣中丁香酚釋放量與糖苷或丁香酚加香量的關(guān)系Fig.4 Relationships of eugenol releases in mainstream smoke with glycoside or eugenol addition rate

2.3.3 主流煙氣丁香酚逐口釋放量分析

煙絲加香卷煙樣品的煙氣丁香酚逐口釋放量分析結(jié)果如圖5所示。添加丁香酚糖苷的卷煙主流煙氣中丁香酚逐口釋放量基本一致，逐口穩(wěn)定性較好；而添加丁香酚的卷煙煙氣中丁香酚的逐口釋放量呈現(xiàn)前高后低的變化趨勢。這表明添加丁香酚糖苷的卷煙煙氣中丁香酚的釋放更為均勻。

圖5 不同抽吸口數(shù)對應(yīng)的主流煙氣中丁香酚的逐口釋放量Fig.5 Puff-by-puff releases of eugenol in mainstream cigarette smoke

2.4 丁香酚糖苷在卷煙中的應(yīng)用

將空白卷煙與添加丁香酚、丁香酚糖苷的加香卷煙進(jìn)行對比分析。添加了丁香酚、丁香酚糖苷的卷煙相比空白卷煙，煙氣中均產(chǎn)生丁香酚，丁香酚的釋放量均隨添加量的增加呈線性增長，且丁香酚糖苷的添加效果優(yōu)于丁香酚，主要表現(xiàn)為卷煙燃吸時(shí)釋香均勻，前后一致。此外，由于丁香酚糖苷常溫下十分穩(wěn)定，耐高溫、不揮發(fā)且氣味弱，解決了丁香酚常溫下易揮發(fā)、嗅香重，及加香不穩(wěn)定等問題。

3 結(jié)論

①丁香酚糖苷的裂解溫度在220 ℃以上，相比丁香酚具有更好的熱穩(wěn)定性。②丁香酚糖苷主要的裂解產(chǎn)物為丁香酚，副產(chǎn)物較少。③添加丁香酚糖苷的卷煙在主流煙氣中釋放丁香酚，釋放量隨糖苷添加量的增加而增加，且糖苷的不同添加方式可達(dá)到不同的加香效果。④丁香酚糖苷在卷煙應(yīng)用中具有良好的加香穩(wěn)定性，卷煙的釋香更為均勻，加香效果不僅優(yōu)于丁香酚，還可解決丁香酚存在的加香不穩(wěn)定等問題，因此，可作為一種穩(wěn)定的煙用香料前體，在卷煙加香中有較好的應(yīng)用前景。