褪黑素單克隆抗體的制備

武海新，廖晨星，常 毅，馬 慧，劉巧香，李有志，郭 剛*，劉國世*

1 北京市中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193 2 北京首農(nóng)食品集團有限公司，北京 100028 3 山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心，山東濟南 250109

0 引言

褪黑素（Melatonin，MT）又稱為抑黑素或美拉酮寧，哺乳動物體內(nèi)由松果體釋放，廣泛存在與消化道、生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等部位，調(diào)節(jié)動物的晝夜節(jié)律，同時也具有調(diào)節(jié)免疫功能[1]、抗衰老[2]、抗腫瘤[3]、調(diào)節(jié)骨骼生長[4]等廣泛的生物學(xué)作用。本研究采用動物免疫、制備雜交瘤細胞的方法，制備高特異性褪黑素單克隆抗體。以該褪黑素單克隆抗體為材料，能夠進一步開發(fā)褪黑素快速檢測方法，為生物和畜牧領(lǐng)域的科研和生產(chǎn)提供便利。同時該抗體可作為進一步研究褪黑素體內(nèi)外功能及機理的材料工具，為后續(xù)的科研工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠[6～8 周齡，（18±2）g]，揚州大學(xué)提供；褪黑素（CAS號：73-31-4）、卵清白蛋白（OVA）、EDC、NHS、弗氏佐劑，Sigma公司；羊抗鼠-HRP，南京鐘鼎生物公司；透析袋、0.22 μm無菌濾器，Millipore公司；高糖DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒，南京諾唯贊公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備

將10 mg褪黑素溶解于NaOH水溶液，加熱反應(yīng)6 h，加入鹽酸中和過量堿，過硅膠層析柱純化，得到產(chǎn)物8 mg，溶于200 μLDMF中。稱取BSA和OVA各10 mg分別溶于2 mL 0.01 mol/L PBS中，將100 μL衍生物滴加到OVA中，然后各加入10 mgEDC、10 mgNHS，室溫攪拌5 h，PBS透析3 天，期間換液6次，取出分裝備用。

1.2.2 動物免疫

選取6～8 周齡BALB/c小鼠5 只，將褪黑素-OVA與弗氏佐劑混合，50 μg/只進行皮下注射，2～3 周后加強免疫。采血，通過間接ELISA方法確定抗血清針對褪黑素-OVA的滴度。

1.2.3 抗血清滴度檢測及篩選

將褪黑素-OVA用PBS包被液稀釋成1 μg/mL，混勻后加入酶標板中，每孔100 μL，4 ℃過夜；丟棄包被液，洗板3次，每孔加入200 μL封閉液，37 ℃恒溫箱1 h；取出酶標板，棄去包被液，洗板1次；將抗血清從1∶500起3 倍梯度稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃恒溫箱1 h；將液體丟棄，洗板3次，向每孔中加入100 μL稀釋好的酶標二抗（山羊抗鼠-HRP，1∶20 000）；37 ℃恒溫箱1 h；將液體丟棄，洗板4次，每孔加入100 μL TMB顯色液，根據(jù)顏色的深淺決定顯色時間，一般37 ℃，15 min；每孔加入100 μL 1 mol/L HCL溶液，終止反應(yīng)；即刻在酶標儀上讀數(shù)，450 nm處樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1則判定為陽性孔。

1.2.4 骨髓瘤細胞制備

提前1 周用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將SP2/0細胞擴大培養(yǎng)。細胞融合當天將SP2/0細胞移入50 mL離心管中，離心1 500 r/min，5 min；丟棄上清，加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，吹打細胞并計數(shù)。

1.2.5 脾細胞制備

選擇血清ELISA滴度達到1∶121 500的小鼠，在融合前3 天終止免疫，腹腔注射褪黑素-OVA 100 μg；融合當天將小鼠進行安樂死處死；在75%酒精中浸泡5 min；在無菌條件下取出脾臟，把脾臟放入培養(yǎng)皿中的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；使用注射器內(nèi)心研磨脾臟，并用細胞篩過濾，然后用DMEM沖洗篩網(wǎng)。將過濾后懸液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，用不含血清的DMEM清洗1次，離心1 500 r/min，5 min；用紅細胞裂解液去除紅細胞，用不含血清的DMEM再清洗1次，離心1 500 r/min，5 min；鋪板計數(shù)。

1.2.6 細胞融合

將脾細胞和骨髓瘤細胞混合，使脾細胞與骨髓瘤細胞數(shù)量比為2∶1；將細胞移至50 mL離心管中，用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，離心1 500 r/min，5 min，棄去上清，搖動離心管使細胞均勻；用電融合液洗細胞1次，然后離心1 500 r/min，5 min，棄上清；用電融合液將細胞稀釋成2×107個/mL，然后在融合池中加入2 mL細胞懸液進行電融合上機試驗，電擊后靜置10 min；使用高糖DMEM培養(yǎng)基，把融合好的細胞鋪至96 孔板，每孔100 μL；將96孔板放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；10 天后進行融合篩選檢測。

1.2.7 融合篩選

將褪黑素-OVA用PBS包被液稀釋成1 μg/mL，混勻后加入酶標板中，每孔100 μL，4 ℃過夜。次日吸取100 μL/孔細胞上清進行ELISA檢測；根據(jù)ELISA結(jié)果，樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1則判定為陽性孔；對二次確認后的陽性孔細胞進行亞克隆。

1.2.8 細胞亞克隆

吹打陽性孔細胞并計數(shù)，使用有限稀釋法對融合細胞進行稀釋，并接種至96孔板。7～10天后在顯微鏡下觀察，檢測有克隆生長的孔并做好標記，挑取陽性的單克隆細胞進行再次亞克隆，重復(fù)至檢測達100%陽性后，挑出單克隆孔進行擴大培養(yǎng)并凍存。

1.2.9 亞克隆篩選

操作方法同1.2.7。

1.2.10 抗體純化

在親和純化層析柱中裝入Protein A瓊脂糖凝膠介質(zhì)，將3G3D1細胞上清緩慢上樣，待抗體結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，即得到所需純化抗體，在PBS中進行4 ℃透析過夜，次日進行純度與濃度測定。

1.2.11 抗體鑒定

通過ELISA檢測純化抗體滴度，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定所得抗體濃度。

1.2.12 純化抗體ELISA滴度檢測

操作方法同1.2.3。

1.2.13 抗體純度鑒定

純化后抗體進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠抗血清滴度檢測

通過對5 免后鼠抗血清與褪黑素-OVA滴度檢測，1#、3#小鼠抗血清針對褪黑素-OVA滴度能夠達到121 500，2#、4#、5#小鼠抗血清針對褪黑素-OVA滴度能夠達到40 500（表1）。通過競爭ELISA方法確定抗血清針對褪黑素競爭抑制率，3#小鼠抗血清針對褪黑素有競爭性（表2）。

表1 5免后7 天對小鼠血清抗體滴度檢測結(jié)果

表2 5免后7 天小鼠血清競爭滴度檢測結(jié)果

2.2 融合細胞篩選

將骨髓瘤細胞和免疫小鼠脾細胞進行電融合，鋪板10 天后進行ELISA篩選檢測。通過兩輪ELISA篩選，得到5 株OD值高于0.5的融合細胞（1H12、2C5、2C9、3G3、4C11）（表3）。進一步通過ELISA篩選檢測，獲得1 株針對褪黑素-OVA特異性最高的融合細胞株（3G3）（表4）。

表3 融合細胞ELISA篩選結(jié)果

表4 融合細胞上清競爭ELISA篩選結(jié)果

2.3 雜交瘤細胞株的建立

將骨髓瘤細胞和免疫小鼠脾細胞融合后，經(jīng)過3 輪細胞亞克隆和ELISA篩選（表5），獲得針對褪黑素-OVA具有高特異性的陽性單克隆細胞株5 株（3G3B2、3G3C7、3G3D1、3G3F4、3G3G3）（圖1）。

表5 亞克隆細胞上清競爭ELISA篩選結(jié)果

圖1 篩選出的陽性雜交瘤細胞

2.4 純化抗體滴度鑒定

選擇3G3D1這株單克隆細胞株進行抗體純化。經(jīng)ELISA滴度檢測可達1∶64 000，純化抗體ELISA檢測結(jié)果如表6所示。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒對純化后抗體進行濃度測定，所得3G3D1-抗體濃度為0.28 mg/mL，體積4 mL。

表6 3G3D1純化抗體ELISA檢測結(jié)果

2.5 抗體純度鑒定

3G3D1純化抗體SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍染色，出現(xiàn)55 kD、25 kD兩個條帶，符合IgG重鏈與輕鏈分子大?。▓D2）。

圖2 純化抗體SDS-PAGE分析

3 討論

褪黑素分子量為232.28 Da。作為一種小分子物質(zhì)，褪黑素屬于半抗原，無法直接刺激動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答從而產(chǎn)生特異性抗體[5]，因此需要先與蛋白載體相結(jié)合，才能實現(xiàn)對動物的免疫過程[6]。本研究中將褪黑素小分子與卵清蛋白OVA進行偶聯(lián)，制備出褪黑素-OVA抗原，并通過5 輪免疫成功得到了血清滴度過關(guān)的免疫小鼠，并且分離小鼠脾臟制備雜交瘤細胞。經(jīng)過篩選共獲得5 株陽性雜交瘤細胞，均可穩(wěn)定分泌褪黑素單克隆抗體。由于3G3D1細胞株對褪黑素-OVA抗原的識別能力最強，因此使用這株細胞進行抗體純化，最終得到單克隆抗體濃度為0.28 mg/mL，滴度可達1∶64 000。因此本研究成功制備出針對褪黑素小分子物質(zhì)的高特異性單克隆抗體。

褪黑素是一種哺乳動物體內(nèi)常見的抗氧化劑和抗炎物質(zhì)[7]，同時也是調(diào)控生殖的重要激素[8]。本研究制備出褪黑素單克隆抗體，為褪黑素含量的快速檢測方法的開發(fā)提供材料，也為相關(guān)功能性研究奠定基礎(chǔ)。