比較羊水細(xì)胞原位培養(yǎng)法和胰酶消化法在產(chǎn)前診斷染色體檢查中的應(yīng)用價(jià)值*

候舒文，陳 薇，嚴(yán)雅蘭，劉 慧，袁 靜

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，安徽合肥 230022

由染色體數(shù)目或者結(jié)構(gòu)異常引起的一類遺傳性疾病被稱為染色體病，其可以導(dǎo)致新生兒出生缺陷[1]。自從1966年有研究者首次培養(yǎng)羊水細(xì)胞成功并用于產(chǎn)前診斷后,該技術(shù)已成為一種減少新生兒出生缺陷的重要手段[2-3]。1984年TABOR等[4]首次報(bào)道了羊水細(xì)胞載玻片-原位培養(yǎng)法(以下簡稱原位法)，該方法是將羊水細(xì)胞直接接種到載破片上進(jìn)行培養(yǎng)。而目前各實(shí)驗(yàn)室普遍應(yīng)用的方法是羊水細(xì)胞胰酶消化法，即將羊水細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶上進(jìn)行培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)室原先以胰酶消化法培養(yǎng)羊水細(xì)胞，從2020年開始同時(shí)采取胰酶消化法和原位法進(jìn)行平行培養(yǎng)羊水細(xì)胞并進(jìn)一步進(jìn)行染色體核型分析。為探討兩種羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法在產(chǎn)前診斷中的臨床意義及比較兩種不同的方法對羊水細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片及染色體核型分析的效果，現(xiàn)對兩種方法的羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率、培養(yǎng)時(shí)間、分裂相、染色體核型結(jié)果等進(jìn)行比較分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年7—12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前診斷的1 105例孕婦羊水標(biāo)本作為研究對象，年齡17～47歲，孕周18～24周。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并與所有受檢者簽訂知情同意書。1 105例孕婦羊水產(chǎn)前診斷指征包括高齡(324例)、唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)(258例)、B超異常(159例)、不良妊娠史(168例)、夫婦之一染色體異常(38例)、無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測高風(fēng)險(xiǎn)(60例)、其他(98例)。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 超凈工作臺SW-CJ-1F(蘇州凈化)、二氧化碳培養(yǎng)箱HERAcell240i(美國Thermo)、倒置顯微鏡TS2 Fi3(日本Nikon)、大容量低速離心機(jī)KDC-1044L(安徽中科中佳)、電熱恒溫水槽DK-B600型(上海三發(fā))、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn))、電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9082BS-Ⅲ(上海新苗)、冰箱BCD-192WE(青島Hisense)、醫(yī)用低溫保存箱DW-25W518(青島Haier)、染色體分散儀CDS-5(美國THERMOTRON)、GSL-120 全自動染色體核型掃描分析系統(tǒng)(美國Leica)。

1.2.2試劑 羊水細(xì)胞培養(yǎng)基(廣州達(dá)暉)、細(xì)胞原位培養(yǎng)盒(杭州杰毅麥特)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國FALCON)、秋水仙素(杭州寶榮)、氯化鉀(上海瀘試國藥)、枸櫞酸鈉(上海瀘試國藥)、乙二胺四乙酸(上海生工)、胰酶(美國Sigma)、甲醇(無錫展云)、冰乙酸(無錫展云)、胰酶分帶液(杭州寶榮)、Giemsa染液(杭州寶榮)、其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本抽取 在無菌條件下抽取孕18～24周羊水20 mL，分別注入兩個(gè)15 mL無菌離心管內(nèi)備用。

1.3.2接種 兩管羊水轉(zhuǎn)速以2 000 r/min離心7 min，棄上清，一管羊水加入培養(yǎng)基4 mL，吹打混勻后，接種至培養(yǎng)瓶中；另一管羊水加入2 mL相同羊水培養(yǎng)基，輕吹混勻，吸取懸液分別接種至2個(gè)原位培養(yǎng)盒，移至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。原位培養(yǎng)20～48 h后，向培養(yǎng)盒中加入3 mL新鮮羊水培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3換液 (1)胰酶消化法：培養(yǎng)9～11 d后于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長并且有多個(gè)較好的梭形細(xì)胞克隆形成時(shí)，將原培養(yǎng)液移入另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)以備用，向原培養(yǎng)瓶中加入4 mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。(2)原位法：培養(yǎng)6～8 d后于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況?？寺≥^多，且多為中大克隆時(shí)即可換上3 mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.4收獲 (1)胰酶消化法：用注射器(7號針頭)向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入濃度為20 μg/mL的秋水仙素2滴，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中處理2.5 h后，采用胰酶消化法(0.25%消化胰酶)收集羊水細(xì)胞，再加入37 ℃預(yù)熱的低滲液(0.075 mol/L KCl)6 mL，吹打混勻后低滲5 min，然后依次進(jìn)行預(yù)固定、固定處理制得細(xì)胞懸液后，進(jìn)行滴片、烤片、G顯帶制備染色體。(2)原位法：向培養(yǎng)盒內(nèi)加入100 μg/mL秋水仙素50 μL，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)30 min，吸去培養(yǎng)液，再加入37 ℃預(yù)熱后的低滲液(0.4% KCl,0.4%枸櫞酸鈉=1∶1)低滲30 min，依次進(jìn)行預(yù)固定、第一次固定、第二次固定、第三次固定處理后，將培養(yǎng)盒內(nèi)的玻片平放在染色體分散儀中進(jìn)行分散，然后再烤片、G顯帶制備染色體。

1.3.5閱片分析 G顯帶后，采用德國徠卡(Leica)GSL-120 全自動染色體核型掃描分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描、捕獲核型。根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS 322.2-2010)分析染色體核型，計(jì)數(shù)分析的細(xì)胞應(yīng)來自兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，染色體顯帶分辨率至少應(yīng)達(dá)到320條帶水平，原瓶消化法計(jì)數(shù)至少20個(gè)細(xì)胞，分析5個(gè)細(xì)胞，染色體核型分析2個(gè)細(xì)胞；原位培養(yǎng)法計(jì)數(shù)至少15個(gè)克隆，分析5個(gè)細(xì)胞，染色體核型分析2個(gè)細(xì)胞。如遇到異常核型，應(yīng)該增加計(jì)數(shù)分析染色體核型數(shù)量。

1.3.6染色體核型質(zhì)量等級評分 根據(jù)文獻(xiàn)[5]標(biāo)準(zhǔn)，染色體核型質(zhì)量采取等級進(jìn)行評分。染色體核型在1 000倍放大下，分為分散(一個(gè)視野下不包含全部染色體核型)、優(yōu)質(zhì)(一個(gè)視野下包含全部染色體核型且染色體核型交叉少于或等于5條)、差(染色體核型交叉大于5條)3個(gè)等級。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。非正態(tài)分布以M(25，P75)表示。組間比較采取Mann-WhitneyU檢驗(yàn)(非正態(tài)分布計(jì)量變量)。計(jì)數(shù)資料用率(%)表示，組間比較采取配對設(shè)計(jì)χ2檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1原位法與胰酶消化法羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率比較 1 105例羊水標(biāo)本均采用原位法、胰酶消化法兩種培養(yǎng)方法進(jìn)行雙線培養(yǎng)及制片，其中2例羊水樣本兩種方法均培養(yǎng)失敗，這2例樣本有陳舊性出血，離心后有少許褐色沉淀；1例樣本性狀為茶色、顏色渾濁，原位法培養(yǎng)失敗，胰酶消化法培養(yǎng)成功；2例樣本胰酶消化法培養(yǎng)失敗，原位法培養(yǎng)成功，其中1例羊水性狀呈醬油色，1例呈褐色。胰酶消化法培養(yǎng)成功率為99.64%(1 101/1 105)，原位法培養(yǎng)成功率為99.73%(1 102/1 105)，這兩種方法的培養(yǎng)成功率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.33，P>0.05)。

2.2原位法與胰酶消化法羊水細(xì)胞培養(yǎng)條件及分裂相比較 原位法羊水需求量為5 mL，培養(yǎng)基用量為7 mL；胰酶消化法羊水需求量為10 mL，培養(yǎng)基用量為8 mL。與胰酶消化法相比，原位法羊水細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間短，分裂相及優(yōu)質(zhì)分裂相數(shù)目多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-31.83，P<0.001;Z=-2.937，P=0.003;Z=-2.943，P=0.003)。見表1。原位法每張玻片獲得的染色體核型數(shù)目多于胰酶消化法，且其核型完整度、染色體分散度、顯帶清晰度都要優(yōu)于胰酶消化法。見圖1、2。

表1 原位法與胰酶消化法羊水細(xì)胞培養(yǎng)條件及分裂相數(shù)目比較

注：A為原位法的顯微鏡下染色體核型(×10)；B為胰酶消化法的顯微鏡下染色體核型(×10)。

注：A為原位法的1 000倍放大下染色體核型；B為胰酶消化法的1 000倍放大下染色體核型。

2.3原位法與胰酶消化法羊水染色體核型結(jié)果比對與分析

2.3.1羊水染色體核型結(jié)果比對分析 實(shí)行胰酶消化法、原位法兩種方法雙線培養(yǎng)均成功的羊水標(biāo)本為1 100例，其中兩種方法均檢出972例正常核型(88.36%)、128例異常核型(11.64%)，染色體核型結(jié)果符合率為100%。128例異常核型包括3例13三體(0.27%)、3例18三體(0.27%)、16例21三體(1.45%)、3例47,XXX(0.27%)、3例47,XXY(0.27%)、1例49,XXXXY(0.09%)、1例69,XYY(0.09%)、12例易位(1.09%)、23例倒位(2.09%)、3例缺失(0.27%)、1例重復(fù)(0.09%)、52例染色體多態(tài)性改變(4.73%)、7例染色體數(shù)目異常真嵌合(0.64%)。見表2。

表2 1 100例羊水染色體核型結(jié)果符合率比對分析(n)

2.3.2染色體核型嵌合 在雙線培養(yǎng)的原位法發(fā)現(xiàn)了8例染色體異常嵌合，其中7例嵌合的異常核型均出現(xiàn)在原位法兩線培養(yǎng)玻片上的數(shù)個(gè)克隆內(nèi)，并且在單線培養(yǎng)的胰酶消化法中也發(fā)現(xiàn)這7例染色體異常嵌合，則判斷此為真嵌合，7例核型異常真嵌合結(jié)果見表3；還有1例僅在原位法1線培養(yǎng)的8號克隆內(nèi)發(fā)生1號染色體部分片段易位，其他克隆內(nèi)的核型均未出現(xiàn)易位，判斷此為假嵌合現(xiàn)象。

表3 7例羊水染色體核型嵌合結(jié)果

3 討 論

新生兒出生缺陷的重要原因是染色體病，而確診染色體病的主要方法是羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析技術(shù)。目前隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不斷涌現(xiàn)許多新的遺傳診斷技術(shù)，而染色體核型分析仍是診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)槠鋵σ孜弧⒌刮?、嵌合等染色體異常的檢出具有無可替代的重要作用。羊水多來源于外、中、內(nèi)三個(gè)胚層的脫落細(xì)胞，活細(xì)胞少，培養(yǎng)難度高[6]。本實(shí)驗(yàn)室原先采用的是傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞培養(yǎng)瓶-胰酶消化培養(yǎng)法，該法操作步驟繁瑣、細(xì)胞丟失多、核型清晰度不佳，且由于采用胰酶消化將細(xì)胞克隆混合而無法區(qū)分細(xì)胞來源[7]，之后本實(shí)驗(yàn)室為提高染色體核型質(zhì)量及產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確率而引入羊水細(xì)胞載玻片-原位培養(yǎng)法。

本研究同時(shí)采取胰酶消化法和原位法培養(yǎng)羊水細(xì)胞，配對設(shè)計(jì)χ2檢驗(yàn)分析兩種方法的培養(yǎng)成功率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與郝娜等[7]報(bào)道結(jié)果一致。原位法使用的載玻片是具有天然正電荷的玻璃材質(zhì)，羊水細(xì)胞更容易在其表面貼壁生長[8]，縮短了培養(yǎng)時(shí)間，且其接種面積較胰酶消化法小，培養(yǎng)基用量更少，與胰酶消化法相比，原位法既縮短了產(chǎn)前診斷報(bào)告發(fā)放時(shí)間又節(jié)省了羊水培養(yǎng)基用量。本研究對進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦抽取20 mL羊水進(jìn)行染色體核型分析，10 mL羊水接種于培養(yǎng)瓶中，另10 mL羊水平均分成兩份5 mL分別接種于兩個(gè)原位培養(yǎng)盒中。在原位法的羊水接種量僅為5 mL的情況下，其核型分裂相仍多于胰酶消化法。本研究采取GSL-120 全自動染色體核型掃描分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描、捕獲核型，根據(jù)染色體核型交叉條數(shù)及在1 000倍放大的視野下是否包含全部染色體來評判染色體分散質(zhì)量[5]，結(jié)果顯示原位法培養(yǎng)的羊水中優(yōu)質(zhì)分裂相也多于胰酶消化法?？赡苡捎谠环ㄖ苯訉⒀蛩臃N于載玻片上，樣本無需進(jìn)行多次轉(zhuǎn)移、胰酶消化及多次離心吹打、滴片等步驟，相較于胰酶消化法簡化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，減少了細(xì)胞損失及實(shí)驗(yàn)操作錯誤的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)了羊水細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)流程化操作，從而可以獲得更多、更滿意的染色體核型以供分析。

本研究對原位法與胰酶消化法同時(shí)培養(yǎng)成功的1 100例羊水染色體核型結(jié)果進(jìn)行比對與分析，結(jié)果顯示兩種方法培養(yǎng)的羊水染色體核型結(jié)果符合率為100%，均檢出972例正常核型、128例異常核型，其中包括7例染色體數(shù)目異常真嵌合。嵌合體是指同一個(gè)體內(nèi)同時(shí)存在兩種或兩種以上的細(xì)胞系[9]，在閱片過程中能夠準(zhǔn)確鑒別真假嵌合體，對臨床預(yù)后的選擇具有至關(guān)重要的作用。國外學(xué)者主張根據(jù)嵌合體性質(zhì)將嵌合體分為3種水平[10]：水平Ⅰ是指單個(gè)異常核型僅出現(xiàn)在單個(gè)培養(yǎng)體系中，一般判斷為假嵌合；水平Ⅱ是指兩個(gè)或兩個(gè)以上相同異常核型僅出現(xiàn)在單個(gè)培養(yǎng)體系中；水平Ⅲ是指兩個(gè)或兩個(gè)以上相同異常核型出現(xiàn)在兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)體系中，一般為真嵌合的可能性高。對于水平Ⅱ嵌合體胰酶消化法很難鑒別，因?yàn)橐让赶ú捎靡让赶瘜⒓?xì)胞克隆混合而無法有效辨別真假嵌合；原位法則保留了羊水細(xì)胞克隆性，可以有效區(qū)分真假嵌合。在原位法的羊水染色體核型分析過程中若發(fā)現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上的相同異常核型僅出現(xiàn)在單個(gè)克隆內(nèi)時(shí)，則認(rèn)為此是假嵌合[11]。在實(shí)驗(yàn)過程中造成假嵌合的原因可能為羊水細(xì)胞在體外培養(yǎng)的環(huán)境與體內(nèi)不同而發(fā)生的異常突變、母體細(xì)胞在羊膜腔穿刺時(shí)混入導(dǎo)致其與羊水細(xì)胞同時(shí)增殖、胰酶消化法制片過程中由于胰酶消化、刮取細(xì)胞等操作導(dǎo)致的染色體斷裂、易位等[12-15]。與胰酶消化法相比，原位法保留了羊水細(xì)胞克隆性，可以鑒別羊水細(xì)胞來源，分辨染色體真假嵌合，降低了假性嵌合風(fēng)險(xiǎn)，有利于產(chǎn)前診斷的嵌合體異常診斷[16]。

綜上所述，原位法具有培養(yǎng)時(shí)間短、培養(yǎng)基用量少、羊水需求量少、操作步驟簡單、優(yōu)質(zhì)分裂相多,以及可以有效診斷真假嵌合等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了羊水細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)流程化操作，提高了染色體核型質(zhì)量，縮短了產(chǎn)前診斷報(bào)告發(fā)放時(shí)間。但原位法耗材成本高且制片的可重復(fù)性低；胰酶消化法則由于可以重復(fù)滴片其制片的可重復(fù)性相對較高，且耗材相對經(jīng)濟(jì)。結(jié)合原位法和胰酶消化法的優(yōu)缺點(diǎn)，羊水細(xì)胞培養(yǎng)可以采用原位法為主、胰酶消化法為輔的培養(yǎng)模式，提高產(chǎn)前診斷的效率、準(zhǔn)確率與成功率。