核因子2相關(guān)因子2激動劑dh404對異氟醚誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙大鼠腦海馬組織的影響

張縱橫, 朱全智, 丁蕾

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（POCD）是病人手術(shù)麻醉后出現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥, 主要臨床表現(xiàn)為病人術(shù)后出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶、判斷力、注意力等下降[1］。研究發(fā)現(xiàn)異氟醚麻醉可致術(shù)后認(rèn)知功能障礙, 可能與異氟醚加劇氧化應(yīng)激反應(yīng), 增加腦內(nèi)海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)[2］。核因子2相關(guān)因子2（Nrf2）是一種轉(zhuǎn)錄因子, 氧化應(yīng)激時能結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件啟動氧化應(yīng)激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[3］。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）是Nrf2負(fù)調(diào)控因子, 具有重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)控機(jī)制[4］。血紅素加氧酶1（HO-1）作為一種應(yīng)激蛋白, 在應(yīng)激和疾病條件下具有抗炎、抗組織損傷、抗氧化及保護(hù)細(xì)胞黏膜等積極作用, 是Nrf2下游的抗氧化基因[5］。本研究起止時間為2018年12月至2019年8月。本研究擬探討Nrf2激動劑dh404改善異氟醚麻醉誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙, 進(jìn)一步探討Nrf2信號通路在氟醚麻醉誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙大鼠腦組織中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 選擇清潔級SD雄性大鼠24只, 鼠齡8～12周, 體質(zhì)量范圍為250～280 g, 購自中國科學(xué)院昆明動物研究所, 動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滇）K2016-0001, 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號為SYXK（滇）K2017-0009。無特定病原體級動物房飼養(yǎng)條件：溫度范圍為22～26 ℃, 相對濕度范圍為40%～60%, 適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。本研究符合一般動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑 Nrf2激動劑dh404（Reata制藥公司, 批號HY-112671）、異氟醚（美國雅培制藥有限公司）、Nrf2、HO-1、Keap1、β肌動蛋白（β-actin）PCR正反向引物（上海生工公司）、Nrf2兔單克隆抗體、HO-1兔單克隆抗體、Keap1兔單克隆抗體（均購自美國Abcam公司）、山羊抗兔二抗（購自美國LICOR公司）、丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（均購自南京建成生物工程研究所）。

1.1.3 主要儀器 Drager Fabius型麻醉機(jī)（德國Drager公司）、Morris水迷宮（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）、實(shí)時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）、酶標(biāo)儀（Thermo公司）、石蠟切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）、正置光學(xué)顯微鏡、成像系統(tǒng)（日本尼康）。

1.2 建立動物模型、分組24只大鼠均于清潔級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按照隨機(jī)數(shù)字表法將24只大鼠分為三組, 對照組、異氟醚組、Nrf2激動劑dh404+異氟醚組（dh404組）, 每組8只。dh404組在吸入異氟醚前30 min腹腔注射Nrf2激動劑dh404（1.5 mg/kg）, 對照組和異氟醚組注射等量的生理鹽水。將各麻醉組大鼠放置于麻醉箱中, 經(jīng)麻醉機(jī)向箱內(nèi)充入30%氧氣的空氣, 調(diào)節(jié)揮發(fā)罐使異氟醚濃度為2%, 持續(xù)時間6 h。將對照組大鼠置于含30%氧氣的空氣中6 h。各組在麻醉期間經(jīng)腹腔注射補(bǔ)充葡萄糖及生理鹽水, 每2小時1次, 0.5毫升/次。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 Morris水迷宮測試 麻醉前一天進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。參照參考文獻(xiàn)[6］, 各組大鼠在麻醉結(jié)束后24 h進(jìn)行Morris水迷宮測試。①定位航行實(shí)驗(yàn)：每天訓(xùn)練4次, 連續(xù)5 d。將大鼠分別從不同象限面向池壁輕放入池中, 限時60 s, 記錄大鼠從入水到爬上平臺所用的時間, 即逃避潛伏期。將60 s內(nèi)找不到平臺的大鼠逃避潛伏期記為60 s。②空間探索實(shí)驗(yàn)：在大鼠完成最后一次定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后, 撤去平臺, 任選一入水點(diǎn)將大鼠放入水池內(nèi), 記錄60 s內(nèi)在原平臺所在象限的探索時間及穿越平臺次數(shù)。測試結(jié)束后立即處死大鼠, 取腦海馬組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 采用免疫組織化學(xué)法檢測腦海馬組織Nrf2表達(dá)情況 將4%多聚甲醛固定腦組織, 用刀片將腦組織切成2 mm厚的組織塊, 放入一次性蠟盒中, 脫水、透明、浸蠟、包埋后, 蠟塊在組織切片機(jī)上連續(xù)切片, 片厚4 μm。經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇逐步水化后高溫抗原修復(fù)20 min。3%雙氧水室溫避光浸泡10 min。每張切片的組織上滴加50 μL山羊血清, 封閉30 min后, 加50 μL兔抗鼠Nrf2抗體孵育, 4 ℃過夜。次日, 棄去一抗后滴加二抗孵育30 min。滴加DAB顯色劑, 鏡下觀察組織顏色。之后進(jìn)行蘇木素復(fù)染, 中性樹脂封片。顯微鏡下觀察Nrf2的蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測腦組織HO-1、Keap1表達(dá)水平 提取腦組織總蛋白, 蛋白質(zhì)定量試劑盒定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯2 h, 5%脫脂牛奶封閉1 h, 洗滌緩沖液洗膜后加入一抗（1∶1 000稀釋）, 孵育2 h, 加入二抗（1∶3 000稀釋）, 室溫孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光顯影, 以β-actin為內(nèi)參, 凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白與內(nèi)參條帶的相對灰度值。

1.3.4 采用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測腦組織Nrf2、HO-1、Keap1表達(dá)水平 Trizol法提取腦組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄, 采用SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR方法檢測各組腦組織Nrf2、HO-1、Keap1基因的表達(dá)水平。引物設(shè)計如下：Nrf2正向5'-CCATTCCCGAGTTACAGTGTCTT-3', 反 向5'-GATCGATGAGTAAAAATGGTAATTGC-3'；HO-1正向5'-AGCATGTTCCCAGGATG-3', 反向5'-GCTCAATGTTGAGCACA-3'；Keap1正向5'-GGTACGACGTGGAGACAGAG-3', 反向5'-TAGCCTCCGAGGACGTAGAT-3'；β-actin正向5'-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3', 反 向5'-CGTCATCCA TGGCGAACTGG-3'。每個樣本重復(fù)檢測3次?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量按2-ΔΔCt法計算。

1.3.5 分別檢測腦組織MDA、SOD、GSH-Px的表達(dá)水平 將腦組織用冰鹽水沖洗, 試紙擦干后稱重, 按體質(zhì)量體積比1∶9加入生理鹽水, 研磨制成10%腦勻漿。4 ℃, 5 000 r/min離心10 min, 按照試劑盒說明書分別采用TBA法檢測腦組織MDA濃度、WST-1法檢測腦組織SOD活性和分光光度法檢測腦組織GSH-Px活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 所有計量數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布, 結(jié)果用xˉ ±s表示, 多組間比較采用單因素方差分析, 多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認(rèn)知功能的比較與對照組相比, 異氟醚組大鼠逃避潛伏期長, 平臺所在象限停留時間及穿越平臺次數(shù)減少（P＜0.05）；與異氟醚組相比, dh404組大鼠逃避潛伏期縮短, 平臺所在象限停留時間及穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.05）。見表1。

表1 dh404對異氟醚麻醉后各組大鼠認(rèn)知功能的影響/xˉ ±s

2.2 各組大鼠腦海馬組織Nrf2表達(dá)情況腦海馬組織CA1區(qū)免疫組織化學(xué)結(jié)果見圖1。異氟醚組大鼠中可見少量Nrf2核陽性細(xì)胞, dh404組大鼠腦組織中可見大量核陽性細(xì)胞, 見圖2。qRT-PCR結(jié)果顯示, dh404組大鼠腦組織Nrf2 mRNA表達(dá)水平（6.70±0.98）高于對照組（1.00±0.12）及異氟醚組（1.16±0.15）（F=95.63,P＜0.001）, 而異氟醚組與對照組Nrf2 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腦海馬組織CA1區(qū)結(jié)構(gòu)切片染色圖（免疫組織化學(xué)染色×400）：1A為對照組；1B為異氟醚組；1C為dh404組

圖2 各組大鼠腦海馬組織Nrf2表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色×400）：2A為對照組；2B為異氟醚組；2C為dh404組

2.3 各組大鼠腦海馬組織HO-1、Keap1表達(dá)水平蛋白質(zhì)印跡法和qRT-PCR結(jié)果均顯示, 與對照組相比, 異氟醚組和dh404組大鼠腦組織HO-1蛋白和mRNA表達(dá)減少、Keap1蛋白和mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）；與異氟醚組相比, dh404組大鼠HO-1蛋白和mRNA表達(dá)升高、Keap1蛋白和mRNA表達(dá)減少（P＜0.05）。見表2, 圖3。

圖3 各組大鼠腦組織HO-1、Keap1蛋白表達(dá)水平

表2 dh404對各組大鼠腦組織HO-1蛋白、Keap1和mRNA表達(dá)的影響/xˉ ±s

2.4 各組大鼠腦勻漿丙二醛濃度、SOD及GSH-Px活性與對照組相比, 異氟醚組和dh404組大鼠丙二醛濃度增加而SOD、GSH-Px活性降低（P＜0.05）；與異氟醚組相比, dh404組大鼠丙二醛濃度減少而SOD、GSH-Px活性增強(qiáng)（P＜0.05）。見表3。

表3 dh404對各組大鼠腦勻漿丙二醛濃度、SOD及GSH-Px活性的影響/xˉ ±s

3 討論

異氟醚是臨床上最常用的吸入性麻醉藥物之一。研究表明, 異氟醚可誘發(fā)中樞神經(jīng)毒性, 導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能減退[7-8］。異氟醚的濃度、麻醉時間、指標(biāo)檢測時間的不同可導(dǎo)致其對新生大鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的影響不同[9］。曹高亞等[10］研究表明持續(xù)吸入異氟醚對空間記憶能力的影響顯著, 而且長時間高濃度的吸入方式造成的影響時間較長；Wang等[11］研究發(fā)現(xiàn), 1.5%異氟醚治療2 h會損害嚙齒動物的認(rèn)知功能, 包括學(xué)習(xí)記憶功能和焦慮相關(guān)行為。水迷宮是檢測海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)手段[12］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 異氟醚組大鼠逃避潛伏期與對照組比長, 平臺所在象限停留時間及穿越平臺次數(shù)與對照組比減少。表明大鼠異氟醚麻醉后引發(fā)認(rèn)知功能障礙。

Nrf2是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白, 在被ROS或親電子試劑激活后進(jìn)入細(xì)胞核, 識別ARE, 編碼下游抗氧化蛋白（Nrf2、HO-1及SOD-1）而發(fā)揮內(nèi)源性抗氧化作用, Nrf2、HO-1和SOD-1及其mRNA表達(dá)水平可間接反映Nrf2信號通路激活情況[13-14］。有研究顯示, 吸入1.5%異氟醚能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并影響神經(jīng)和認(rèn)知發(fā)育, 而PKCα/Nrf2信號通路的激活具有神經(jīng)保護(hù)作用[15］。另有研究發(fā)現(xiàn), 高壓氧預(yù)處理對異氟烷誘導(dǎo)小鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙模型中的記憶缺陷具有神經(jīng)保護(hù)作用, 可能與通過激活Nrf2/HO-1途徑介導(dǎo)有關(guān)[16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 異氟醚組大鼠腦組織中可見少量Nrf2核陽性細(xì)胞, 而異氟醚組和dh404組大鼠腦組織Keap1表達(dá)水平升高、HO-1表達(dá)水平減少, 提示異氟醚可通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠發(fā)生認(rèn)知功能障礙, 吸入異氟醚后, Nrf2表達(dá)水平呈應(yīng)激性升高, 但無法有效減輕大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平。因此, 本研究觀察Nrf2激動劑dh404對神經(jīng)認(rèn)知的保護(hù)作用。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, dh404組大鼠相關(guān)指標(biāo)均有所改善。且dh404組大鼠腦組織中可見大量核陽性細(xì)胞, Nrf2、HO-1表達(dá)水平升高而Keap1表達(dá)水平減少。提示預(yù)給予dh404可以有效改善異氟醚麻醉所誘導(dǎo)大鼠空間學(xué)習(xí)能力下降, 可能與Nrf2信號通路激活, 從而起到腦保護(hù)作用有關(guān)。

麻醉手術(shù)過程中會增加機(jī)體氧化應(yīng)激壓力, 對機(jī)體造成進(jìn)一步損害。丙二醛能夠反映細(xì)胞受氧自由基損傷的程度, 而SOD活性高低反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力[17］。GSH-Px屬于體內(nèi)分布較廣的過氧化物分解酶, 其活性高低反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力, 是機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的靈敏指標(biāo)[18］。SOD、GSH-Px和過氧化氫酶共同構(gòu)成機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng), 能直接反映機(jī)體抗氧化能力[19］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 與對照組相比, 異氟醚組和dh404組大鼠丙二醛濃度增加而SOD、GSH-Px活性降低；與異氟醚組相比, dh404組大鼠丙二醛濃度減少而SOD、GSH-Px活性增強(qiáng)。提示dh404可起到保護(hù)異氟醚誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙的大鼠, 其可能的作用機(jī)制是Nrf2信號通路激活起到抗氧化作用。

綜上所述, 異氟醚6 h吸入可誘發(fā)大鼠認(rèn)知功能障礙與腦組織氧化應(yīng)激水平增高有關(guān), 促進(jìn)Nrf2信號通路激活可改善異氟醚6 h吸入導(dǎo)致認(rèn)知功能損害。