微RNA-132-3p靶向第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物調(diào)控葡萄膜黑色素瘤細胞增殖與凋亡

許志波

葡萄膜黑色素瘤是一種罕見的癌癥, 也是最多見的一種成人原發(fā)性眼內(nèi)腫瘤[1］。雖然通過手術(shù)摘除或放射治療是控制眼內(nèi)腫瘤的好方法, 但高達一半的病人會發(fā)展為遠處轉(zhuǎn)移性疾病, 致使病人預(yù)后很差[2-3］。對于轉(zhuǎn)移性葡萄膜黑色素瘤尚無有效的治療方法, 大多數(shù)病人轉(zhuǎn)移后存活不到12個月[3］。目前, 葡萄膜黑色素瘤的發(fā)病機制仍不明確, 并且缺乏有效的生物標志物能夠識別高風險病人。因此迫切需要篩選腫瘤特異性預(yù)后因子以預(yù)測病人預(yù)后。微RNA（miRNA/miR）是一類高度保守的小分子內(nèi)源性非編碼RNA, 日益成為腫瘤等各種疾病發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子[4］, 也可作為葡萄膜黑色素瘤的潛在生物標志物[5］。有研究對不同病理類型的葡萄膜黑色素瘤組織和正常葡萄膜黑色素組織進行miRNA的差異分析, 發(fā)現(xiàn)microRNA-132-3p（miRNA-132-3p, miR-132-3p）在梭形和上皮細胞型葡萄膜黑色素瘤組織中表達上調(diào)[6］, 然而miR-132-3p對葡萄膜黑色素瘤細胞生物行為的影響及其機制尚未見相關(guān)報道。本研究于2018年2月至2019年7月利用體外細胞實驗, 觀察miR-132-3p在葡萄膜黑色素瘤細胞增殖和凋亡中的作用, 并進一步探索其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料正常葡萄膜上皮細胞系A(chǔ)RPE-19和葡萄膜黑色素瘤細胞系SP6.5、M23購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心, 胎牛血清、洛斯維·帕克紀念研究所-1640（RPMI-1640）培養(yǎng)基購自美國Gibco公司, Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司, 膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司, 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、第10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、周期素依賴激酶抑制劑p21（P21）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）一抗購自美國Cellular Signaling Technology公司, 辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購自上海碧云天生物技術(shù)研究所, miR-132-3p、miR-132-3p干擾質(zhì)粒（anti-miR-132-3p）、PTEN過表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-PTEN）、熒光素酶報告載體購自上海吉瑪生物有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染正常葡萄膜上皮細胞系A(chǔ)RPE-19、葡萄膜黑色素瘤細胞系SP6.5、M23細胞中接種至含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi), 培養(yǎng)于飽和濕度、37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期的SP6.5細胞, 按2×105個/mL接種至6孔板, 利用Lipofectamine 2000試劑, 將miR-132-3p、anti-miR-132-3p、pcDNA3.1-PTEN及其相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染至SP6.5細胞, 轉(zhuǎn)染完成48 h后進行后續(xù)研究。

1.3 定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測miR-132-3p表達取對數(shù)生長期的ARPE-19、SP6.5、M23細胞, TRIzol法提取總RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA）, 進行qPCR反應(yīng)。miR-132-3p正向引物5'GCGCGCGTAACAGTCTACAGC-3', 反向引物5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC-3'。U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3', 反向引物5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3'。以U6為內(nèi)參, 根據(jù)2-ΔΔCt法計算miR-132-3p的相對表達量。

1.4 MTT法檢測細胞增殖收集各組SP6.5細胞, 加胰酶消化并調(diào)整細胞密度為2×104個/毫升。將細胞懸液接種至96孔板（100微升/孔）, 常規(guī)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后, 分別加入100 μL的MTT溶液孵育4 h, 加入200 μL的二甲基亞砜后置于搖床上孵育10 min。多功能酶標儀測定各孔490 nm波長處SP6.5細胞吸光度值, 吸光度值越大, 表明細胞活性越強。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡收集各組SP6.5細胞, 加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞, 分別加入5 μL Annexin V-FITC染色液和5 μL PI染色液, 室溫條件下避光反應(yīng)15 min, 通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測PTEN、cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax蛋白表達收集各組SP6.5細胞, 分別加入放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液, 提取總蛋白, 將蛋白沸水浴變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）, 轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉常溫封閉1 h, 加入一抗（稀釋比1∶1 000）4 ℃孵育24 h, 加Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（TBST）漂洗3次, 加入二抗（稀釋比1∶2 000）37 ℃孵育1 h, 再次用TBST進行充分漂洗后加化學(xué)發(fā)光液進行顯影。以GAPDH為內(nèi)參, 計算PTEN、cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量。

1.7 雙螢光素酶報告實驗利用TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-132-3p的靶基因, 發(fā)現(xiàn)miR-132-3p與PTEN的3'非編碼區(qū)（3'UTR）存在結(jié)合位點。構(gòu)建含miR-132-3p結(jié)合位點的PTEN 3'UTR野生型（WT- PTEN）及突變型（MUT- PTEN）報告基因載體, 將其分別與miR-132-3p、miR-132-3p陰性對照（miRNC）共轉(zhuǎn)染至S65細胞, 48 h后根據(jù)雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒操作步驟, 檢測細胞雙螢光素酶相對活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計。計量數(shù)據(jù)表示為xˉ ±s, 兩組間比較用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較用單因素方差分析, 多組間兩兩比較比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-132-3p在細胞ARPE-19、SP6.5和M23中的表達qPCR檢測結(jié)果顯示, miR-132-3p在葡萄膜黑色素瘤細胞SP6.5、M23及正常葡萄膜上皮細胞ARPE-19中表達量為0.94±0.09、0.81±0.08、0.26±0.02（F=78.70,P＜0.001）；SP6.5、M23均高于ARPE-19（P＜0.05）。選擇差異最顯著的SP6.5細胞開展后續(xù)研究。

2.2 抑制miR-132-3p對細胞SP6.5增殖、凋亡的影響在SP6.5細胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-132-3p, 與antimiR-NC組比較, miR-132-3p表達量大幅減少, 24 h、48 h、72 h的細胞活性明顯降低, 細胞凋亡率顯著增加, cyclin D1、Bcl-2蛋白表達量降低而P21、Bax水平提高, 上述差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1, 2；表1, 2。

表1 抑制miR-132-3p對葡萄膜黑色素瘤細胞SP6.5增殖的影響/xˉ ±s

圖1 抑制miR-132-3p對葡萄膜黑色素瘤細胞SP6.5凋亡的影響

圖2 抑制miR-132-3p對葡萄膜黑色素瘤細胞SP6.5增殖、凋亡蛋白表達的影響

表2 抑制miR-132-3p對葡萄膜黑色素瘤細胞SP6.5凋亡的影響/xˉ ±s

2.3 miR-132-3p靶向、調(diào)控PTEN生物學(xué)信息工具預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn), PTEN的3'UTR部分堿基內(nèi)含有miR-132-3p的結(jié)合位點, 見圖3A。與miR-NC組比, miR-132-3p組WT- PTEN熒光素酶相對活性顯著降低（1.02±0.10比0.21±0.02,t=13.76、P＜0.05）, MUT- PTEN熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（1.00±0.10比0.98±0.09,t=0.26、P＞0.05）。與miR-NC組比, miR-132-3p組PTEN表達量顯著降低（0.22±0.02比0.07±0.01,t=11.62、P＜0.05）, 與anti-miR-NC組比, anti-miR-132-3p組PTEN表達量顯著升高（0.19±0.02比0.60±0.06,t=11.23、P＜0.05）, 見圖3B。

圖3 miR-132-3p靶向、調(diào)控PTEN：A為PTEN的3＇非翻譯區(qū)（3'UTR）含有miR-132-3p的互補序列；B為miR-132-3p調(diào)控PTEN的表達

2.4 過表達PTEN對細胞S65增殖、凋亡的影響在S65細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PTEN, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 相比于pcDNA3.1-PTEN陰性對照（pcDNA3.1）組, PTEN蛋白表達量明顯升高, 24 h、48 h、72 h的細胞活性逐漸降低, 細胞凋亡率有所增加, Bcl-2、cyclin D1水平顯著降低而P21、Bax表達量明顯提高, 上述差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3, 4。

表3 過表達PTEN對葡萄膜黑色素瘤細胞SP6.5增殖的影響/xˉ ±s

2.5 抑制PTEN可逆轉(zhuǎn)抑制miR-132-3p對細胞SP6.5增殖、凋亡的影響與anti-miR-NC組比較, 抑制miR-132-3p顯著影響SP6.5細胞PTEN蛋白表達量、24 h、48 h、72 h的細胞活性、細胞凋亡率和cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax蛋白水平（P＜0.05）, 結(jié)果同“2.2”“2.3”。與anti-miR-132-3p+si-NC組比較, antimiR-132-3p和si-PTEN共轉(zhuǎn)染入SP6.5細胞, 24 h、48 h、72 h的細胞活性和cyclin D1、Bcl-2蛋白表達水平提高, 細胞凋亡率和PTEN、P21、Bax蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見表5, 6。

表5 抑制PTEN可逆轉(zhuǎn)抑制miR-132-3p對細胞SP6.5增殖的影響/xˉ ±s

表4 過表達PTEN對細胞SP6.5凋亡的影響/xˉ ±s

表6 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)抑制miR-132-3p對細胞SP6.5凋亡的影響/xˉ ±s

3 討論

miRNA是一種短鏈非編碼RNA, 長度從18到25個核苷酸不等, 在葡萄膜黑色素瘤等腫瘤進程中發(fā)揮抑癌或致癌作用[7］, 如miR-21[8］, miR-9[9］, miR-181[10］。既往研究表明, miR-132-3p參與結(jié)直腸癌[11］、血管平滑肌脂肪瘤[12］、胃癌[13］等腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。miR-132-3p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細胞中的表達明顯上調(diào)[14］, miR-132-3p在結(jié)直腸癌細胞中的表達下調(diào), 上調(diào)miR-132-3p的表達可顯著抑制腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和遷移并促進細胞凋亡[15］。miR-132-3p過表達顯著抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖, 并使細胞凋亡率明顯增加, 在骨肉瘤中起腫瘤抑制因子作用[16］。本研究中, miR-132-3p在SP6.5、M23細胞中表達上調(diào), 與前人研究[7, 15］結(jié)果一致。同時, 抑制miR-132-3p表達顯著降低24 h、48 h、72 h的SP6.5細胞活性及cyclin D1、Bcl-2蛋白表達水平（P＜0.05）, 提高細胞凋亡率和P21、Bax蛋白表達水平（P＜0.05）, 表明抑制miR-132-3p表達可以抗葡萄膜黑色素瘤細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡, 具有抗葡萄膜黑色素瘤作用。

PTEN是一種著名的抗腫瘤基因[17］, 在葡萄膜黑色素瘤中具有抑癌作用[18］。Abdel-Rahman等[19］第一次證明PTEN是一種腫瘤抑制因子, 參與葡萄膜黑色素瘤的發(fā)病機制, 可能與臨床結(jié)果有關(guān)。PTEN載體的過度表達抑制葡萄膜黑色素瘤MUM-2B細胞的侵襲[20］。在惡性黑色素瘤中, PTEN表達量明顯降低, 其缺失與惡性黑色素瘤進展密切相關(guān)[21］。本研究中, 過表達PTEN明顯抑制24 h、48 h、72 h的SP6.5細胞活性和Bcl-2、cyclin D1水平（P＜0.05）, 提升細胞凋亡率和P21、Bax表達量（P＜0.05）, 與抑制miR-132-3p表達結(jié)果相同。PTEN抑制葡萄膜黑色素瘤的作用與前述報道相同, 為PTEN作為腫瘤抑制因子增加了新的證據(jù)。

大量資料顯示, miRNA通過與靶mRNA的3'UTR互補位點堿基配對, 導(dǎo)致mRNA降解、裂解或翻譯抑制, 從而調(diào)控基因表達[22］。研究表明, 在乳腺癌細胞中, PTEN是miR-132和miR-212的直接靶點, miR-132或miR-212處理顯著降低乳腺癌細胞MCF-7中PTEN表達[23］。在阿爾茨海默病中, miR-132關(guān)鍵靶點之一的PTEN表達上調(diào)[24］。在膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細胞中, PTEN被鑒定為miR-132-3p的直接和功能性下游靶標[15］。本研究的生物信息學(xué)和雙螢光素酶報告實驗也證實了miR-132-3p對PTEN的靶向結(jié)合關(guān)系。另外, 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)抑制miR-132-3p對SP6.5細胞抗增殖、促凋亡的作用, 表明miR-132-3p可能是通過調(diào)控PTEN表達影響葡萄膜黑色素瘤細胞增殖和凋亡的。

綜上所述, miR-132-3p在葡萄膜黑色素瘤細胞中表達上調(diào), miR-132-3p可通過靶向調(diào)控PTEN的表達抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖并促進細胞凋亡, 這為葡萄膜黑色素瘤提供了新的候選預(yù)后生物標志物和治療靶標。