慢性阻塞性肺疾病60例血漿鎖鏈素、維生素K水平變化及臨床意義

于凡珍, 陳爍, 李家樹

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見病和多發(fā)病, 是以持續(xù)氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的疾病, 其氣流受限多呈進(jìn)行性發(fā)展。目前認(rèn)為慢性炎癥和蛋白酶-抗蛋白酶失衡是COPD的主要發(fā)病機(jī)制[1］。鎖鏈素是近年發(fā)現(xiàn)的彈性蛋白特征性水解產(chǎn)物, 其體液含量可以反映肺組織中彈性蛋白的代謝情況, 被認(rèn)為是肺損傷的敏感指標(biāo)[2］。維生素K是γ-谷氨酰羧化酶的輔酶, 是激活凝血因子等多種蛋白質(zhì)的重要輔因子?；|(zhì)Gla蛋白（matrix gla protein, MGP）也是一種依賴維生素K激活的蛋白質(zhì), 具有抑制軟組織鈣化的重要作用。既往研究顯示維生素K可通過催化MGP的谷氨酸殘基羧化生成活性人羧化基質(zhì)Gla蛋白（cMGP）, 從而發(fā)揮抑制組織彈性蛋白鈣化、降解的作用[3-5］。循環(huán)中去羧化（Dp-uc；即非活性）MGP水平與維生素K水平呈負(fù)相關(guān), 已被用來評(píng)估血漿維生素K水平[6］。研究發(fā)現(xiàn)血漿維生素K水平下降可引起肺彈性蛋白降解增加, 并與肺氣腫的發(fā)生呈明顯負(fù)相關(guān)[7-8］。目前鎖鏈素、維生素K在COPD中的作用并未完全清楚, 本研究的目的在于探討COPD病人血漿鎖鏈素、維生素K水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年12月至2021年7月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院收治的COPD病人為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）納入COPD病人均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸學(xué)分會(huì)《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》[1］中關(guān)于COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)。（2）一般資料完整, 能夠配合該研究順利進(jìn)行。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并與鎖鏈素、MGP相關(guān)的系統(tǒng)性疾病如嚴(yán)重心血管及皮膚損傷性疾?。唬?）合并除COPD以外的其他呼吸系統(tǒng)疾?。唬?）合并有嚴(yán)重的肝腎、內(nèi)分泌、炎性腸道疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾?。唬?）服用維生素K拮抗劑（如苯丙酸酯和華法林等）或脂溶性維生素或其類似物治療者, 器官移植史病人等。

本研究共納入COPD病人60例為COPD組, 另選取同期體檢中心健康體檢病人30例為對(duì)照組。對(duì)照組一般資料完整, 能夠配合該研究順利進(jìn)行。組間性別構(gòu)成、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙指數(shù)等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）, 具有可比性。見表1。

表1 健康體檢對(duì)照組與慢性阻塞性肺疾?。–OPD）組一般資料比較

本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（KY-20210714001-01）, 病人或其近親屬簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 血漿鎖鏈素、非活性基質(zhì)Gla蛋白（Dp-uc-MGP）水平 COPD組與對(duì)照組病人均于就診當(dāng)天, 用乙二胺四乙酸抗凝管抽取靜脈空腹晨血5 mL, 混合10～20 min后, 離心5 min左右（3 500 r/min）, 仔細(xì)收集上清, -80 ℃冰箱冷凍備用。血漿鎖鏈素、DpucMGP采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）進(jìn)行檢測(cè), 試劑盒均購(gòu)自上海將來實(shí)業(yè)江萊生物。

1.2.2 血清炎性因子水平 COPD組與對(duì)照組病人均于就診當(dāng)天, 用不含抗凝劑的真空采血管抽取靜脈空腹晨血5 mL, 混合10～20 min后, 離心5 min左右（3 500 r/min）, 仔細(xì)收集上清, 送該院檢驗(yàn)科采用流式細(xì)胞儀（貝克曼庫(kù)爾特生物科技有限公司）檢測(cè)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。

1.2.3 肺功能 COPD組與對(duì)照組病人均于就診當(dāng)天, 采用肺功能測(cè)量?jī)x（德國(guó)JAEGER）進(jìn)行肺功能測(cè)定, 記錄第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%）、一氧化氮彌散量（DLCO）。所有操作均由同一專業(yè)肺功能醫(yī)師在同一肺功能儀上進(jìn)行。

1.3 COPD病人分組（1）根據(jù)2020年慢性阻塞性肺疾病全球倡議中規(guī)定的慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）診斷標(biāo)準(zhǔn)將不同進(jìn)展期病人分為COPD穩(wěn)定期組和AECOPD組：COPD穩(wěn)定期組30例, 其中男25例, 女5例, 年齡（67.30±7.77）歲, 體質(zhì) 量 指 數(shù)（25.16±3.34）kg/m2, 吸 煙 指 數(shù)705.00±448.24；AECOPD組30例, 其中男25例, 女5例, 年齡（66.67±5.38）歲, 體質(zhì)量指數(shù)（24.82±4.42）kg/m2, 吸煙指數(shù)681.67±427.00。（2）根據(jù)COPD病人本次入院前1年內(nèi)急性加重次數(shù)分組：前一年發(fā)生2次及以上中/重度急性加重, 或1次及以上因急性加重住院的病人為COPD高風(fēng)險(xiǎn)組, 余為COPD低風(fēng)險(xiǎn)組。其中COPD高風(fēng)險(xiǎn)組27例, 其中男23例, 女4例, 年齡（66.70±7.66）歲, 體質(zhì)量指數(shù)（25.20±4.26）kg/m2, 吸煙指數(shù)709.26±472.52；COPD低風(fēng)險(xiǎn)組33例, 其中男27例, 女6例, 年齡（67.12±5.76）歲, 體質(zhì)量指數(shù)（24.81±3.61）kg/m2, 吸煙指數(shù)680.30±407.15。

以上COPD穩(wěn)定期組和AECOPD組、COPD高風(fēng)險(xiǎn)組和COPD低風(fēng)險(xiǎn)組組間性別構(gòu)成、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙指數(shù)等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）, 具有可比性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示, 方差齊的組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), 方差不齊的組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（第25、第75百分位數(shù)）[M（P25,P75）］表示, 組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示, 組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson進(jìn)行。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD組與對(duì)照組鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標(biāo)比較與對(duì)照組相比, COPD組血鎖鏈素、Dp-ucMGP、IL-6、TNF-α水平較高（P＜0.05）, 肺功能指標(biāo)FEV1%、DLCO較低（P＜0.05）, 見表2。

表2 健康體檢對(duì)照組與COPD組鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標(biāo)比較/±s

表2 健康體檢對(duì)照組與COPD組鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標(biāo)比較/±s

注：COPD為慢性阻塞性肺疾病, Dp-ucMGP為非活性基質(zhì)Gla蛋白, IL-6為白細(xì)胞介素-6, TNF-α為腫瘤壞死因子-α, FEV1%為第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比, DLCO為一氧化氮彌散量。

組別對(duì)照組COPD組t（Z）值P值例數(shù)30 60鎖鏈素/（μg/L）1.84±0.89 3.03±0.96 5.69＜0.001 Dp-ucMGP/（μg/L）8.93±1.78 11.24±1.45 6.60＜0.001 IL-6/（ng/L）2.45±1.41 3.97±1.91 3.86＜0.001 TNF-α/（ng/L）2.95±1.79 6.19±3.17（4.57）＜0.001 FEV1%/%81.65±11.46 53.44±16.43 6.68＜0.001 DLCO/mmol·min-1·kPa-1 6.22±0.94 4.31±1.29 5.85＜0.001

2.2 不同進(jìn)展期COPD病人鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子、肺功能指標(biāo)比較與COPD穩(wěn)定期組相比, AECOPD組血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）, 但炎性因子血清IL-6、TNF-α水平均明顯升高（P＜0.05）, 肺功能指標(biāo)FEV1%、DLCO均明顯降低（P＜0.05）, 見表3。

表3 不同進(jìn)展期COPD病人血鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標(biāo)比較水平比較/±s

表3 不同進(jìn)展期COPD病人血鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標(biāo)比較水平比較/±s

注：COPD為慢性阻塞性肺疾病, Dp-ucMGP為非活性基質(zhì)Gla蛋白, IL-6為白細(xì)胞介素-6, TNF-α為腫瘤壞死因子-α, FEV1%為第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比, DLCO為一氧化氮彌散量, AECOPD為慢性阻塞性肺疾病急性加重期。

組別AECOPD組COPD穩(wěn)定期組t值P值例數(shù)30 30鎖鏈素/（μg/L）2.97±0.99 3.08±0.94 0.44 0.664 Dp-ucMGP/（μg/L）11.35±1.50 11.14±1.42 0.55 0.583 IL-6/（ng/L）4.45±2.13 3.48±1.56 2.01 0.049 TNF-α/（ng/L）8.01±2.65 4.38±2.56 5.39＜0.001 FEV1%/%49.17±13.99 57.72±17.77 2.07 0.043 DLCO/mmol·min-1·kPa-1 3.80±0.97 4.82±1.37 3.31 0.002

2.3 不同風(fēng)險(xiǎn)組COPD病人鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子、肺功能指標(biāo)比較與COPD低風(fēng)險(xiǎn)組相比, COPD高風(fēng)險(xiǎn)組血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP、IL-6水平均明顯升高（P＜0.05）, 肺功能指標(biāo)FEV1%、DLCO均明顯降低（P＜0.05）, 見表4。

表4 不同風(fēng)險(xiǎn)組COPD病人血鎖鏈素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指標(biāo)比較水平比較

2.4 COPD病人血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP水平與炎性因子及肺功能指標(biāo)的相關(guān)性COPD病人血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP水平與炎性因子血清IL-6、TNF-α均呈明顯正相關(guān)（均P＜0.05）；與肺功能指標(biāo)FEV1%、DLCO均 呈 顯 著 負(fù) 相 關(guān)（均P＜0.05）, 見表5。

表5 COPD病人血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP水平與炎性因子及肺功能指標(biāo)的相關(guān)性（r,P值）

2.5 COPD病人血漿鎖鏈素、Dp-ucMGP水平之間的相關(guān)性COPD病人血漿鎖鏈素水平與Dp-uc-MGP水平呈顯著正相關(guān)（r=0.76,P＜0.001）。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn), 彈性蛋白與COPD發(fā)病密切相關(guān), 在COPD的發(fā)病過程中常伴隨異常的彈性蛋白降解和修復(fù)[9］。正常情況下, 分解人肺組織的彈性蛋白酶和抗彈性蛋白酶抑制劑之間處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài), 從而維持肺組織的正常結(jié)構(gòu)不被破壞[10］。當(dāng)慢性炎癥、吸煙、空氣污染等刺激使蛋白酶-抗蛋白酶失衡時(shí), 蛋白酶水解肺彈性蛋白增加, 導(dǎo)致彈性蛋白降解加速及肺氣腫。

鎖鏈素是纖維狀彈性蛋白的水解產(chǎn)物, 由4個(gè)賴氨酸的側(cè)鏈交聯(lián)而成, 是交聯(lián)彈性蛋白纖維特有的氨基酸, 只存在于哺乳動(dòng)物的彈性蛋白中。鎖鏈素作為成熟彈性蛋白的主要成分, 在肺組織中分布極為豐富。當(dāng)肺內(nèi)蛋白酶-抗蛋白酶失衡導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)破壞時(shí), 彈性蛋白降解增加, 釋放鎖鏈素也會(huì)增加。釋放出的游離鎖鏈素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 不參與機(jī)體的分解代謝, 因此可作為肺損傷破壞的生化指標(biāo)。既往研究表明, COPD病人體液中鎖鏈素水平由高到低依次是：急性加重期、穩(wěn)定期、健康對(duì)照組[11］。Huang等[12］發(fā)現(xiàn)部分穩(wěn)定期和急性加重期COPD病人血液中的鎖鏈素水平高于健康對(duì)照組, 但穩(wěn)定期和急性加重期病人血液中的鎖鏈素水平無(wú)顯著差別。柳威等[13］則發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期COPD組誘導(dǎo)痰鎖鏈素水平明顯高于健康對(duì)照組, 并與FEV1、FVC呈負(fù)相關(guān)。Kim等[14］進(jìn)一步研究證實(shí)尿中鎖鏈素水平升高是COPD病人肺氣腫的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子, 并與COPD的頻繁加重顯著相關(guān)。Piscaer等[7］也發(fā)現(xiàn)COPD組血漿鎖鏈素水平顯著高于健康對(duì)照組, 并與肺功能指標(biāo)DLCO呈負(fù)相關(guān), 但與FEV1、FEV1%等無(wú)明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示, COPD組病人血漿鎖鏈素水平明顯高于對(duì)照組；而且, COPD高風(fēng)險(xiǎn)組病人血漿鎖鏈素水平明顯高于COPD低風(fēng)險(xiǎn)組病人, 提示血漿鎖鏈素水平可以反映COPD的急性加重風(fēng)險(xiǎn)。但不同進(jìn)展期COPD病人之間血漿鎖鏈素水平無(wú)顯著差別, 這與Huang等[12］研究結(jié)果一致。究原因可能是在AECOPD期間, 彈性蛋白降解速度相對(duì)較慢, 短期內(nèi)升高不明顯所致。同時(shí), COPD高風(fēng)險(xiǎn)組IL-6、TNF-α、FEV1%、DLCO較COPD低風(fēng)險(xiǎn)組均顯著下降, 反映該組病人慢性炎癥更重, 肺功能低下。進(jìn)一步相關(guān)性分析, COPD病人血漿鎖鏈素與炎性因子IL-6、TNF-α均呈顯著正相關(guān), 提示COPD存在的慢性炎癥可促進(jìn)肺彈性蛋白降解。另外, COPD病人血漿鎖鏈素還與肺功能指標(biāo)FEV1%、DLCO呈顯著負(fù)相關(guān), 提示鎖鏈素與COPD病人肺損傷嚴(yán)重程度有關(guān), 可作為評(píng)估COPD病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。但是, 血漿鎖鏈素水平與FEV1%、DLCO之間相關(guān)性的研究結(jié)果并非總是一致的, 考慮其原因可能與入組COPD病人嚴(yán)重程度不一、研究樣本量偏小有關(guān)。

維生素K又稱凝血維生素, 是一種常見的脂溶性維生素, 具有止血、控制細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡、抗炎、抗氧化應(yīng)激等廣泛作用[15］。已有證據(jù)表明維生素K可通過降低IL-6、TNF-α、C反應(yīng)蛋白等多種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用[16-17］。此外, 維生素K還是γ-谷氨酰羧化酶的輔酶, 可協(xié)助催化蛋白質(zhì)中的谷氨酸殘基生成γ-羧化谷氨酸[3］。MGP是一種14 kDa的分泌型小分子蛋白, 可表達(dá)于心、肺、腎、皮膚和動(dòng)脈血管壁等多種組織中。研究發(fā)現(xiàn), MGP是維生素K依賴的軟組織鈣化抑制劑[18］。維生素K可促使MGP的5個(gè)谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷的Gla, 產(chǎn)生鈣結(jié)合位點(diǎn), 進(jìn)而發(fā)揮抑制組織彈性蛋白鈣化、降解的作用[4,19］。Piscaer等[7］研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比, COPD病人血漿維生素K水平顯著降低, 且其與彈性蛋白降解指標(biāo)鎖鏈素呈負(fù)相關(guān), 提示維生素K在COPD的發(fā)病中可能起一定作用。在另一項(xiàng)關(guān)于深綠色蔬菜和肺氣腫風(fēng)險(xiǎn)之間聯(lián)系的研究中, Shen等[8］發(fā)現(xiàn)維生素K攝入量與肺氣腫的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)；與攝入低于推薦劑量維生素K的人群相比, 攝入推薦劑量維生素K可使患肺氣腫的概率降低39%。最近, Dofferhoff等[20］也發(fā)現(xiàn)新冠肺炎病人預(yù)后不良與其血漿維生素K缺乏相關(guān)。他們認(rèn)為肺炎引起的血漿維生素K耗竭可導(dǎo)致MGP的激活受損, 這是重癥肺炎彈性纖維損傷加速的主要機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示, COPD組病人血漿Dp-ucMGP水平明顯高于對(duì)照組, 即COPD病人血漿維生素K水平明顯低于對(duì)照組。推測(cè)其原因可能與COPD病人維生素K攝入不足、慢性炎癥消耗和維生素K循環(huán)個(gè)體差異相關(guān)[19］。而且, COPD高風(fēng)險(xiǎn)組病人血漿Dp-ucMGP水平明顯高于COPD低風(fēng)險(xiǎn)組病人, 提示血漿Dp-ucMGP水平可以反映COPD的急性加重風(fēng)險(xiǎn)。相關(guān)性分析顯示COPD病人血漿Dp-ucMGP水平與炎性因子IL-6、TNF-α正相關(guān), 這可能與維生素K抗炎作用的發(fā)揮相關(guān)。此外, COPD病人血漿Dp-ucMGP水平與肺功能指標(biāo)FEV1%、DLCO呈顯著負(fù)相關(guān), 提示Dp-ucMGP也與COPD病人肺損傷嚴(yán)重程度有關(guān)。COPD病人血漿Dp-ucMGP水平還與鎖鏈素呈顯著正相關(guān), 即血漿維生素K與鎖鏈素呈顯著負(fù)相關(guān), 表明維生素K缺乏在COPD發(fā)病中的起一定作用, 其機(jī)制可能與促進(jìn)肺彈性蛋白降解相關(guān), 這與Piscaer等[7］研究結(jié)果相一致。

綜上所述, COPD病人血漿鎖鏈素和Dp-ucMGP水平明顯升高, 且與炎性因子、肺功能指標(biāo)呈明顯相關(guān), 可作為評(píng)估COPD病情嚴(yán)重程度的血漿標(biāo)志物。由于COPD病人血漿維生素K水平下降, 且與鎖鏈素呈顯著負(fù)相關(guān), 推測(cè)維生素K可能參與了肺彈性蛋白降解過程, 這或可成為緩解COPD病人病情進(jìn)展的新思路, 但仍須進(jìn)一步地補(bǔ)充試驗(yàn)提供更多證據(jù)。但是, 鎖鏈素在COPD病人中的研究結(jié)果并不統(tǒng)一, 而且目前維生素K和Dp-ucMGP在COPD中的相關(guān)研究較少, 仍有待于大規(guī)模、長(zhǎng)期隨訪臨床研究來進(jìn)一步探索。