叉頭框蛋白C2、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1的表達與皮膚鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)特性的相關(guān)性

孫秋悅, 曹宸, 楊細(xì)虎, 嚴(yán)志新

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）是起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的一類惡性腫瘤, CSCC的發(fā)病率在皮膚非黑色素惡性腫瘤中僅次于基底細(xì)胞癌, 約占所有皮膚癌的20%, 也是非黑色素皮膚腫瘤致死的首要原因[1-4］?，F(xiàn)據(jù)統(tǒng)計, 有5%的CSCC可發(fā)生轉(zhuǎn)移[5］。CSCC在發(fā)生、發(fā)展的過程中涉及眾多的基因。叉頭框蛋白C2（FoxC2）是淋巴管發(fā)育的重要蛋白, 在許多惡性腫瘤中均有表達, 但在CSCC中鮮有研究。淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1（LYVE-1）是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物, 有研究發(fā)現(xiàn)LYVE-1的表達與口腔鱗狀細(xì)胞癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-8］。但在CSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用還沒有相關(guān)報道, 因此本實驗探討了FoxC2、LYVE-1在CSCC發(fā)生、發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能的作用。本實驗采用免疫組織化學(xué)S-P法, 應(yīng)用抗FoxC2單抗對人CSCC中FoxC2抗原進行標(biāo)記；應(yīng)用抗LYVE-1單抗對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞進行標(biāo)記, LYVE-1表達水平用微淋巴管密度（MLVD）表示。半定量分析FoxC2表達情況, 定量分析腫瘤內(nèi)MLVD, 探討二者與CSCC生物學(xué)特性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2013年10月至2021年1月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院收治的44例原發(fā)性CSCC病人。篩選條件：①病人行原發(fā)性CSCC腫塊切除手術(shù), ②腫瘤原發(fā)灶蠟塊保存完整, ③臨床病理及病例資料完整。44例病人年齡范圍為37～97歲。選取2例正常皮膚組織作為對照。本研究病人及近親屬對研究方案簽署知情同意書, 符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 免疫組織化學(xué)試劑兔抗人FoxC2單抗（即用型）、兔抗人LYVE-1單抗（即用型）均來自Abcam；羊抗鼠/兔IgG聚合物（即用型）來自合肥泉暉醫(yī)療器械有限公司, 貨號RQT100；DAB顯色液由該院病理科提供。

1.3 染色方法采用免疫組織化學(xué)染色檢測全部標(biāo)本中FoxC2、LYVE-1水平, 操作如下：組織切片常規(guī)脫蠟至水, 在4%福爾馬林溶液室溫條件下固定24 h, 采用高溫高壓組織抗原修復(fù), 抗原修復(fù)液采用濃度0.1 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）（pH 8.0）, 修復(fù)條件為溫度121 ℃、修復(fù)時間為噴氣計時2.5 min, 滅活劑采用3%過氧化氫一抗稀釋液采用磷酸緩沖鹽溶液, FoxC2與LYVE-1的稀釋比例分別為1∶200、1∶10 000, 孵育溫度4 ℃, 過夜。二抗羊抗鼠/兔IgG聚合物（即用型）, 在室溫下孵育20 min, 顯色液采用DAB, 顯色時間5 min。蘇木精復(fù)染30 s, 脫水, 中性樹脂封片。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定觀察FoxC2、LYVE-1在CSCC組織中的表達情況及與病理參數(shù)（年齡、性別、腫瘤長徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）的關(guān)系。LYVE-1采用MLVD表示, MLVD計數(shù)方式為[9］：一個淋巴管為棕黃色染色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇, 先在低倍鏡（40倍鏡）下觀察, 再選擇高密度區(qū)在高倍鏡下（200倍鏡）隨機選擇5個視野內(nèi)淋巴管進行計數(shù), 記錄平均值。FoxC2為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染色, 主要為細(xì)胞核染色。以同一顯微鏡倍數(shù)（×40）觀察全片, 確定腫瘤浸潤邊緣, 然后選擇5個高倍（×400）視野, 取所分析的5個不同視野染色細(xì)胞所占百分比及染色強度進行綜合評分, 染色強度判分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞未著色為0分（-）、淺黃色為1分（+）、棕黃色為2分（++）、棕褐色為3分（+++）。陽性細(xì)胞所占百分比判分標(biāo)準(zhǔn)[10］：陽性細(xì)胞＜1%為0分；1%～10%為1分、＞10%～30%為2分；＞30%～60%為3分；＞60%為4分。以染色強度與陽性細(xì)胞百分比評分之和作為染色結(jié)果的判定, 陰性或低表達：0～3分；高表達：≥4分。0～3分為低表達組, ≥4分為高表達組。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。FoxC2的表達高低與病人臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗。LYVE-1的表達情況用MLVD表示, MLVD值與病人臨床病理特征的關(guān)系, 兩組樣本間比較符合正態(tài)分布且方差齊者采用兩獨立樣本t檢驗, 反之則采用秩和檢驗。三組樣本間比較先進行方差齊性檢驗, 方差齊且符合正態(tài)分布采用單因素方差分析, 反之則采用Kruskal-WallisH檢驗。FoxC2和LYVE-1的表達的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。檢驗標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 FoxC2表達和MLVD值與CSCC臨床病理特征的關(guān)系2例正常皮膚組織中FoxC2表達陰性。44例CSCC中, FoxC2高表達率為52%（23/44）, 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組其高表達率為（88.88%）, 明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（42.85%）（P=0.036）；中低分化組FoxC2高表達率為（88.88%）, 明顯高于高分化組（26.92%）（P＜0.001）；不同年齡、性別、腫瘤長徑的CSCC組織中FoxC2表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

CSCC標(biāo)本經(jīng)免疫組織化學(xué)LYVE-1抗體染色后, 其淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色, 44例CSCC的MLVD為（9.62±5.07）個, 不同年齡、性別、腫瘤長徑的CSCC組織中MLVD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）, CSCC有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、中低分化組的MLVD值分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、高分化組（P＜0.05）。具體情況見表1。

表1 原發(fā)性皮膚鱗狀細(xì)胞癌44例癌組織中叉頭框蛋白C2（FoxC2）表達和微淋巴管密度（MLVD）與其臨床病理特征的關(guān)系

2.2 FoxC2表達水平與MLVD的相關(guān)性44例CSCC組織中, FoxC2高表達組MLVD為（12.24±4.86）個, 低表達組MLVD為（6.75±3.56）個, Pearson相關(guān)分析顯示, FoxC2表達情況與MLVD值呈正相關(guān)（r=0.55,P＜0.001）, 即FoxC2高表達組的MLVD值高于FoxC2低表達組的MLVD值。

3 討論

CSCC臨床上的治療手段主要以手術(shù)切除治療為主, 我國仍然以傳統(tǒng)腫塊局部切除手術(shù)為主, 國外最常用的手術(shù)治療為莫式顯微描記手術(shù), 此技術(shù)不僅僅可以切除皮膚腫塊, 在充分考慮浸潤深度的前提下, 可以將局部復(fù)發(fā)率降到最低, 但在我國還沒有達到普及[11-12］。目前納米光療已經(jīng)是治療皮膚腫瘤的一種全新的技術(shù), 但治療效果仍然非常受限[13］, 我國CSCC病人術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險依然很高, 一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移將會導(dǎo)致較差的預(yù)后。

FoxC2是調(diào)節(jié)血管及淋巴管發(fā)育的重要蛋白, 目前有17個Fox基因亞家族, 控制著一系列生物過程, 包括細(xì)胞生長、增殖、分化, 其突變與淋巴水腫密切相關(guān), 同時也是腫瘤轉(zhuǎn)移所必需的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[14］。本研究結(jié)果顯示, FoxC2在CSCC中低分化組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中高表達, 提示FoxC2可能參與CSCC發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移, 且FoxC2高表達組的MLVD值明顯高于低表達組, 提示FoxC2促進腫瘤淋巴管新生, 與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。FoxC2參與腫瘤淋巴管新生的原因可能有：①磷酸化的FoxC2和果蠅同源框蛋白1（Prox1）控制下游的連接蛋白37的表達[15］, 從而阻礙淋巴管瓣膜的形成。FoxC2和連接蛋白37的缺失會導(dǎo)致淋巴管生長和重塑發(fā)生嚴(yán)重缺陷[16］。②淋巴管成熟需要流體剪切應(yīng)力, 而FoxC2可以通過調(diào)節(jié)流體剪切應(yīng)力來穩(wěn)定新生的淋巴管系統(tǒng), 幫助其存活[17］。因此FoxC2在淋巴系統(tǒng)中起到至關(guān)重要的作用。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)FoxC2在食管癌病人中高度表達, 其表達程度與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[18］, 本研究結(jié)果與其相似。因此, 靶向阻斷FoxC2的表達可能會在治療CSCC及腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移有著廣闊的前景。

LYVE-1是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物, 用于區(qū)分淋巴管與血管, 對淋巴管有高度特異性, 在淋巴管新生中發(fā)揮重要的作用[19］。本研究結(jié)果顯示, CSCC有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、中低分化組的MLVD值分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、高分化組, FoxC2高表達組MLVD值大于FoxC2低表達組, 提示LYVE-1的表達水平與CSCC的發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此, 靶向阻斷LYVE-1的表達可能會為治療CSCC提供新的方向。