四種抗氧化劑對(duì)豬精液冷凍保存影響研究進(jìn)展

馮赫澤，宋宇倫，李井春

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

豬作為重要的畜牧產(chǎn)品正受到越來(lái)越多的關(guān)注。為了保證生產(chǎn)效率和生產(chǎn)質(zhì)量，現(xiàn)在多采用人工授精進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖。目前保存方法多采用常溫下17℃保存、4℃的低溫保存、超低溫-79℃（干冰）或-196℃（液氮）三種保存方法。隨著人工授精技術(shù)在養(yǎng)豬業(yè)的普及，對(duì)豬精液保存技術(shù)的研究正在逐步深入。豬精液可以在常溫下短時(shí)間保存，并且精子活力和質(zhì)量也受許多因素影響。與冷凍精液相比，常溫保存的精液受孕率高、投資少、人工操作方便，可產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益。因此與其他方法相比，常溫保存精液是豬人工授精的首要選擇。雖然常溫保存技術(shù)被廣泛應(yīng)用，但冷凍精液在儲(chǔ)存、運(yùn)輸、使用地域、抵抗疫病、節(jié)約配種成本、降低育種強(qiáng)度方面與常溫精液相比優(yōu)勢(shì)顯著。目前，由于豬精子結(jié)構(gòu)的特殊性，豬精液冷凍保存技術(shù)始終沒(méi)有獲得突破性進(jìn)展，世界上應(yīng)用豬凍精進(jìn)行人工授精所占的比例不到1%。因此，可以嘗試通過(guò)研究例如沒(méi)食子酸、丹參素和迷迭香酸等在豬精液冷凍保存中的抗氧化能力，并選取出效果相較最佳的抗氧化劑加入到冷凍稀釋液中，以便在豬生產(chǎn)實(shí)踐中提高生產(chǎn)效率。

1 豬精液冷凍保存技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

豬精液冷凍保存技術(shù)主要是將豬精子儲(chǔ)存在液氮（-196℃）或干冰（-79℃）中，使精子能夠置于冷凍環(huán)境中，進(jìn)而使細(xì)胞代謝幾乎停止，達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。目前，中國(guó)生豬養(yǎng)殖主要以利用新鮮精液人工授精繁殖為主，但鮮精體外保存時(shí)間較短，且精子質(zhì)量下降較快，極大地影響了公豬精液的利用效率。雖然研究人員已對(duì)豬精液冷凍保存技術(shù)開(kāi)展了大量研究，并改進(jìn)和開(kāi)發(fā)了冷凍稀釋液和保護(hù)劑的配方，但其實(shí)際應(yīng)用結(jié)果仍不理想。原因在于豬精子的結(jié)構(gòu)與牛羊不同，其精液冷凍機(jī)理始終不如牛羊等動(dòng)物清晰明確，也沒(méi)有能生產(chǎn)與之匹配的冷凍試劑、解凍試劑和冷凍配套設(shè)備，豬凍精在解凍后的指標(biāo)達(dá)不到生產(chǎn)應(yīng)用的要求，在豬繁殖生產(chǎn)中難以推廣應(yīng)用，僅極小量用于引種育種。因此，在當(dāng)前豬精液冷凍保存技術(shù)未完善之前，可優(yōu)先選擇在冷凍稀釋劑中添加新型抗氧化劑，提高當(dāng)前豬精液冷凍保存技術(shù)水平的生產(chǎn)效率。

2 四種抗氧化劑在豬精液冷凍保存中的應(yīng)用

2.1 維生素E

維生素E，又名α-生育酚，其發(fā)生的抗氧化作用，內(nèi)源性和外源性產(chǎn)生的活性氧（ROS）引起氧化還原平衡的變化與各種疾病有關(guān)，也是一種被認(rèn)為是生存所必需的現(xiàn)象。維生素E為了調(diào)節(jié)由于其脂肪中可溶性維生素的濃度較高而導(dǎo)致的體內(nèi)氧化還原平衡，并普遍存在于個(gè)體內(nèi)，包括細(xì)胞膜和脂蛋白。因此維生素E在維持精細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，抑制自由基在精子形成方面具有重要作用，可使精子頂體完整率得到有效提升并降低精子畸形率、改善精液品質(zhì)。任俊玲等人的試驗(yàn)證明，添加0.2 mg/mL維生素E可有效提高冷凍-解凍精子活力、活率、質(zhì)膜完整率，并且能顯著減少M(fèi)DA（丙二醛）的生成。但需要注意的是，維生素E若添加過(guò)量，在細(xì)胞膜抗脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中，維生素E轉(zhuǎn)化為自由基，對(duì)精子造成損害。李芳研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍稀釋液中添加0.6 mg/mL的維生素E可以有效提升SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（過(guò)氧化氫酶）的活性，有效防止脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能起到保護(hù)作用。并且發(fā)現(xiàn)，同時(shí)添加維生素E和PUFA（多不飽和脂肪酸）對(duì)豬精子的冷凍效果要優(yōu)于單獨(dú)添加維生素E。張樹(shù)山發(fā)現(xiàn)，在冷凍保存液中加入維生素E可以改善豬精液凍后活率和頂體完整率，當(dāng)加入水平為600 μg/mL時(shí)，活率和頂體完整率得到明顯提高，精液的凍后活率和頂體完整率均隨著加入水平的上升而改善，但在超過(guò)一定水平后反而下降。由此（表1）可見(jiàn)，維生素E在豬精液保存技術(shù)當(dāng)中具有重要作用，但單獨(dú)使用維生素E的豬精液保存效果已趨近飽和，目前可嘗試使用兩種或多種抗氧化劑與維生素E組合進(jìn)行豬精液冷凍保存效果的研究。

表1 維生素E在豬精液冷凍保存中的應(yīng)用

2.2 沒(méi)食子酸

沒(méi)食子酸（GA，Gallic acid）是一種多酚類(lèi)有機(jī)化合物，多從掌葉大黃、大葉桉、山茱萸等植物中提取，在食品、生物、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。沒(méi)食子酸作為具有強(qiáng)抗氧化性的一類(lèi)天然酚酸，目前已被國(guó)家批準(zhǔn)為可以用作食品的主要抗氧化劑使用，除了抗氧化之外沒(méi)食子酸還具備抗菌功能，對(duì)大腸桿菌感染和革蘭氏陰性菌具有很強(qiáng)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)證明，向冷凍保存培養(yǎng)基中添加50 μg/mL沒(méi)食子酸可顯著改善人的精子形態(tài)、活率、活力和DNA完整性，并減少DNA片段化和脂質(zhì)過(guò)氧化。ⅰnan? ME等人在Honameli山羊精液凍融后，在Tris基精液稀釋液中添加濃度為1 mmol/L的GA對(duì)Honamli山羊精液凍融后的精子參數(shù)均產(chǎn)生積極效應(yīng)。因此應(yīng)繼續(xù)使用不同劑量和制劑組合對(duì)其他物種進(jìn)行進(jìn)一步研究。Gungor S等人在Tris基稀釋液中冷凍保存公羊精液時(shí)補(bǔ)充2 mmol/L GA可增加豬精子解凍后的運(yùn)動(dòng)能力，而補(bǔ)充0.05 mmol/L GA可增強(qiáng)線(xiàn)粒體功能（見(jiàn)表2）。目前，沒(méi)食子酸在豬精液冷凍保存技術(shù)當(dāng)中的研究應(yīng)用甚少，未來(lái)將會(huì)是重要的研究方向。

表2 沒(méi)食子酸在精液冷凍保存中的應(yīng)用

2.3 丹參素

丹參素是一種優(yōu)秀的天然抗氧化劑，該化合物大量存在于中草藥丹參中，能清除超氧陰離子，保護(hù)細(xì)胞線(xiàn)粒體不受氧自由基脂質(zhì)過(guò)氧化的影響。使超氧化物歧化酶（SOD）的含量提升，降低自由基產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量，對(duì)心血管疾病和其他健康問(wèn)題具有治療作用，這些作用背后的機(jī)制包括抗氧化、抗凋亡等。因此有試驗(yàn)表明，添加丹參多糖（SMP）可顯著提高解凍后的精子活率、超氧化物歧化酶、乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、過(guò)氧化氫酶活性。在冷凍過(guò)程中，SMP能防止豬精子發(fā)生過(guò)氧化損傷，提高冷凍-解凍過(guò)程中的精子活力和產(chǎn)仔數(shù)。在豬精液常溫保存稀釋液中添加不同濃度的丹參素能夠不同程度地改善精液保存質(zhì)量。其中，25 μmol/L丹參素使精子活率、質(zhì)膜和頂體完整率、T-AOC（總抗氧化）水平和SOD活性得到有效提升，MDA含量明顯下降。Xuekai Tian等人試驗(yàn)證明，17℃下不同濃度丹參素加入豬精液稀釋溶液保存效果不同。與對(duì)照組相比，補(bǔ)充丹參素的豬精液樣品表現(xiàn)出的氧化應(yīng)激對(duì)精子的影響降低。補(bǔ)充30 μmol/L丹參素能使精子活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性和抗氧化能力顯著提升。由表3可以看出，丹參素對(duì)豬精子具有顯著的保護(hù)作用，研究?jī)r(jià)值潛能巨大。但目前相關(guān)研究甚少，未來(lái)可嘗試將丹參素應(yīng)用于豬精液的冷凍保存技術(shù)并分析出最佳添加劑量，進(jìn)一步提高豬精液的冷凍保存效果。

表3 丹參素在豬精液保存中的應(yīng)用

3 討論

目前，豬精子抗氧化作為豬精液冷凍保存技術(shù)當(dāng)中最為重要的環(huán)節(jié)，由于豬精液在冷凍-解凍過(guò)程中精子細(xì)胞膜磷脂不飽和脂肪酸濃度與牛羊相比較高，更易受到ROS（活性氧）攻擊，導(dǎo)致抗氧化能力降低造成豬精子的氧化損傷。因此目前抗氧化劑的研究尤為重要，對(duì)提高生豬繁殖性能、擴(kuò)大生豬養(yǎng)殖及發(fā)展畜牧產(chǎn)業(yè)具有重要意義。天然提取物作為保存精液的抗氧化劑，具有廣闊的研究空間和發(fā)展前景，這對(duì)于提高人工授精技術(shù)的生產(chǎn)力和降低授精成本也起著重要作用。

表4 迷迭香酸在豬精液保存中的應(yīng)用