基于文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)的6-OHDA帕金森病大鼠模型特點(diǎn)分析及在中藥研究中的應(yīng)用

王孟迪張秋梅范 蓓Alberto Carlos Pires Dias王鳳忠*王 瓊*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中葡中醫(yī)藥國(guó)際合作中心,四川 瀘州 646000;3.葡萄牙米尼奧大學(xué)生物系,分子和環(huán)境生物學(xué)中心,中葡藥食植物資源研究中心,葡萄牙 布拉加4710-057)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD) 是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用引起的老年性神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為動(dòng)作緩慢,肌體僵硬和靜止性震顫。其典型的病理特征是中腦黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergic neuron,DN)的丟失,導(dǎo)致多巴胺(dopamine,DA)分泌減少,并產(chǎn)生路易小體(Lewy bodies,LB)[1]。PD好發(fā)于中老年人群,其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚[2],為進(jìn)一步探究PD的病因及診療方案,需要建立能很好模擬PD患者臨床和病理表現(xiàn)的動(dòng)物模型,神經(jīng)毒素模型是最經(jīng)典和歷史最悠久的一類PD模型,通過(guò)使用神經(jīng)毒素藥物誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物或靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦中黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元選擇性退化,產(chǎn)生與臨床患者相似的病理和行為變化[3]。這類神經(jīng)毒素可以全身給藥或局部給藥,取決于所用藥物的類型和所涉及的種屬。多年來(lái),包括6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)、百草枯(paraquat,PQ)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、和魚(yú)藤酮(rotenone)在內(nèi)的許多藥物都被成功應(yīng)用于構(gòu)建PD模型[4]。6-OHDA模型是史上第一個(gè)PD動(dòng)物模型,也是目前應(yīng)用最廣泛藥物模型之一[5]。6-OHDA作為DA的羥基化衍生物,可在多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)運(yùn)輸毒素,競(jìng)爭(zhēng)性抑制DA[6]。該模型在病理、生化方面的表現(xiàn)與人類PD患者相似,如黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性壞死,黑質(zhì)和紋狀體TH活性及DA含量降低[7]等。

為進(jìn)一步明確6-OHDA模型的造模方法和特點(diǎn),本文采用文獻(xiàn)分析的方法對(duì)近20年國(guó)內(nèi)外有關(guān)6-OHDA誘導(dǎo)大鼠PD模型的有效文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)造模要素和模型鑒定方法進(jìn)行歸納總結(jié),并對(duì)近年來(lái)6-OHDA大鼠模型在抗PD中藥研究中的應(yīng)用情況進(jìn)行收集,為PD的機(jī)制研究及抗PD中藥的非臨床研究提供模型參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 6-OHDA模型在PD研究中的應(yīng)用分析

使用CNKI和PubMed兩大常用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索。利用CNKI的中國(guó)學(xué)術(shù)文獻(xiàn)網(wǎng)絡(luò)總庫(kù)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索。點(diǎn)擊“高級(jí)搜索”,在主題搜索中同時(shí),應(yīng)用“并含”輸入“大鼠”,時(shí)間設(shè)定為2001年1月1日至2021年7月30日,檢索有關(guān)大鼠在6-OHDA方面的中文文獻(xiàn),用PubMed分別以“6-OHDA”和“rat”為關(guān)鍵詞進(jìn)行文獻(xiàn)檢索,檢索同時(shí)段的相關(guān)的英文文獻(xiàn)。

當(dāng)文獻(xiàn)符合以下標(biāo)準(zhǔn)時(shí)被納入研究:(1)在正式期刊中發(fā)表的研究性文章(綜述、學(xué)位論文、會(huì)議文章剔除);(2)實(shí)驗(yàn)中至少設(shè)計(jì)有對(duì)照組(或假手術(shù)組)和模型組;(3)所使用動(dòng)物的品系、性別、體重信息描述清楚,造模要素描述完整;(4)6-OHDA被用于建立帕金森病模型;(5)使用了至少一種行為學(xué)檢測(cè),并有行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果。獲得6-OHDA相關(guān)中英文文獻(xiàn)共312條,其中中文文獻(xiàn)162條,有效文獻(xiàn)105條;英文150條,有效文獻(xiàn)73條,最終得到有效文獻(xiàn)共計(jì)178條。

1.2 模型動(dòng)物及相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的分析

采用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)篩選后的178篇文獻(xiàn)中的信息進(jìn)行匯總。錄入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系、性別、體重,造模方法、檢測(cè)指標(biāo)等信息,對(duì)6-OHDA所致的PD模型動(dòng)物及相關(guān)測(cè)試指標(biāo)進(jìn)行分析,所有圖形采用GraphPad Prism 6.02軟件制作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過(guò)統(tǒng)計(jì)相關(guān)的文獻(xiàn)數(shù)量并計(jì)算占比,文中圖形由Graphpad Software提供。

2 結(jié)果

2.1 6-OHDA模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

經(jīng)統(tǒng)計(jì),6-OHDA大鼠注射模型的使用品系主要是SD和Wistar(圖1A),此外還有研究使用Long Evans大鼠[8]和Simonsen大鼠[9]。關(guān)于動(dòng)物性別的選擇,多數(shù)研究選擇了雄性動(dòng)物,少數(shù)選擇了雌性動(dòng)物(圖1B)。在造模動(dòng)物的體重選擇方面,大部分的研究選擇了180～250 g的體重區(qū)間(49.25%)(圖1C)。

圖1 6-OHDA模型動(dòng)物品系與性別使用情況Figure 1 Animal strain and sex usage of 6-OHDA model

6-OHDA模型的造模方法采用將藥物直接注入腦區(qū)造成損傷的方式進(jìn)行,沒(méi)有全身吸收的過(guò)程,因此不同動(dòng)物之間的差異小,可廣泛用于靈長(zhǎng)類、嚙齒類動(dòng)物等。雖然靈長(zhǎng)類動(dòng)物更能模擬人類疾病的癥狀,但費(fèi)用昂貴,不利于初期藥效篩選;小鼠等小型動(dòng)物腦部體積較小,難以針對(duì)特定的腦區(qū)進(jìn)行注射,且術(shù)后死亡率高,造模難度較大,因此最常選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的是大鼠。與小鼠相比,大鼠腦部體積大,手術(shù)視野寬闊,術(shù)后存活率更高。有研究指出,SD大鼠和Wistar大鼠的腦部結(jié)構(gòu)不完全一致,因此在選擇定位坐標(biāo)時(shí)需要參考以相應(yīng)品系為標(biāo)本編寫(xiě)的腦立體圖譜,以提高定位的準(zhǔn)確度[10]。

此外,有研究表明絕經(jīng)后的女性PD患者的運(yùn)功能動(dòng)異?？赏ㄟ^(guò)雌激素緩解,說(shuō)明雌激素對(duì)PD具有改善作用[11]。在動(dòng)物性別的選擇方面,雄鼠的造模成功率顯著高于雌鼠,且切除雙側(cè)卵巢的雌鼠造模成功率顯著高于保留卵巢的雌鼠[12]?；蛟S是考慮到激素周期干擾的原因,大部分的研究選擇了使用雄性大鼠建立PD模型。

2.2 6-OHDA模型的造模要素

6-OHDA整體給藥無(wú)法透過(guò)血腦屏障,因此,只能通過(guò)腦立體定位儀注射的方式將藥物注入特定的靶點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在黒質(zhì)紋狀體多巴胺系統(tǒng)的不同部位注射不同劑量的 6-OHDA可建立不同損傷程度和損傷類型的PD模型[13]。

2.2.1 部位

6-OHDA注射模型所選擇的注射部位主要有黑質(zhì)(substantia,SN),紋狀體(corpus striatum,CPu),內(nèi)側(cè)前腦束(medial forebrain bundle,MFB),中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)。據(jù)文獻(xiàn)分析,其中28.98%的研究選擇了CPu注射,27.27%的研究選擇了SN注射,28.98%的研究選擇了MFB注射,VTA通常與其他部位復(fù)合注射,單獨(dú)不作使用;在選擇單側(cè)和雙側(cè)注射的問(wèn)題上,大部分研究選擇了單側(cè)注射(98.01%),單側(cè)造模減少了手術(shù)損傷,操作更易、死亡率更低,同時(shí)可對(duì)正常側(cè)和手術(shù)側(cè)進(jìn)行對(duì)比。在單側(cè)注射模型中,70.86%的文獻(xiàn)選擇了單側(cè)單點(diǎn)注射,23.17%的文獻(xiàn)選擇了單側(cè)雙點(diǎn)注射,3.97%的文獻(xiàn)選擇單側(cè)多點(diǎn)(3點(diǎn)及以上)注射。采用雙側(cè)造模的文獻(xiàn)僅有2.58%,因其損傷程度大,致死率高,故不做常規(guī)選擇[14]。

復(fù)合注射模型常見(jiàn)的有SN+VTA(14,7.95%)、SN+MFB(5,2.84%)、MFB+VTA(3,1.70%)和SN+CPu(2,1.14%),見(jiàn)表1。

表1 6-OHDA模型的造模部位Table 1 The molding site of the 6-OHDA model

(1)黑質(zhì)(substantia,SN)

SN主要的注射部位為黒質(zhì)致密部(SNc),是黑質(zhì)紋狀體通路的起源部位,此處有豐富的DA能神經(jīng)元,在該處造?？芍苯訐p毀 DN胞體,引起手術(shù)側(cè)紋狀體內(nèi)DA水平降低,DA受體數(shù)量呈代償性增加。6-OHDA注射到黑質(zhì),12 h內(nèi)即開(kāi)始發(fā)生DA神經(jīng)元變性[15],因此是常用的注射部位。SN體積狹小,形狀呈扁柱狀, 難以精準(zhǔn)定位,單點(diǎn)注射模型的成功率較低,雙側(cè)造模易出現(xiàn)吞咽困難、渴感缺乏和運(yùn)動(dòng)障礙,甚至死亡,通常選擇單側(cè)注射或與其他位點(diǎn)聯(lián)合注射,如李進(jìn)等[16]采用SN+VTA聯(lián)合造模,以阿撲嗎啡(apomorphine,APO)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)作為模型鑒定標(biāo)準(zhǔn),在4周時(shí)成功率達(dá)60%,高于單一黒質(zhì)組(30%);范凱等[17]采用單側(cè)SN+MFB聯(lián)合造模,模型成功率67.7%,術(shù)后死亡率僅2.9%。

(2)內(nèi)側(cè)前腦束(Medial forebrain bundle,MFB)

MFB是一個(gè)神經(jīng)傳導(dǎo)束,起始于中腦DA能神經(jīng)元,部分纖維終止于紋狀體,鄰近黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)通路,該通路由位于黑質(zhì)致密部(SNC)的A9細(xì)胞群組成,沿MFB 發(fā)出纖維投射到紋狀體的尾殼核,6-OHDA單側(cè)注射到MFB中可導(dǎo)致A9和A10細(xì)胞群的完全破壞[18]。此位點(diǎn)注射模型對(duì)苯丙胺和APO都有能產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為,在APO旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)陽(yáng)性的大鼠CPu中DA組織含量減少99.8%,SN中DA組織含量減少85%[18]。該模型能使DN在較短時(shí)間內(nèi)快速死亡,不易模擬早期PD的病理表現(xiàn),但能產(chǎn)生肌肉震顫行為,可模擬晚期患者的臨床特征,通常用于中晚期PD模型的研究[19]。由于MFB解剖面積較小,定位相對(duì)困難,通常采用單側(cè)多點(diǎn)或與其他部位聯(lián)合造模,羅蔚鋒等[20]采用單側(cè)雙位點(diǎn)注射,術(shù)后4～6周成功率達(dá)77%;秦曉凌等[21]采用單側(cè)單點(diǎn)注射,術(shù)后2周成功率可達(dá)46.94%,3周成功率可達(dá)34.69%,且可維持至術(shù)后第10周。

(3)紋狀體(Corpus striatum,CPu)

CPu位于黑質(zhì)紋狀體通路的末端,有文獻(xiàn)報(bào)道單側(cè)CPu注射6-OHDA,可使部分DA耗竭,CPu中DA水平降低60%～80%,適用于構(gòu)建早中期PD模型[22]。與MFB注射相比,該模型導(dǎo)致的SNpc損傷程度不太明顯,對(duì)DN是一種緩慢作用過(guò)程,將在4～6周逐漸演變。因此該模型引發(fā)的病理變化更接近臨床患者DN進(jìn)行性退變的過(guò)程[23],有文獻(xiàn)指出6-OHDA直接注入SNc會(huì)造成過(guò)度的氧化應(yīng)激反應(yīng),注入CPu部位可以一定程度避免[24]。CPu區(qū)域較大,注射操作的準(zhǔn)確程度更高,目前紋狀體注射6-OHDA通常采用單點(diǎn)、兩點(diǎn)或多點(diǎn)注射法[13]。王曉曉等[25]采用單側(cè)雙靶點(diǎn)法分別在尾殼核內(nèi)和蒼白球內(nèi)進(jìn)行注射,2周即誘導(dǎo)出APO旋轉(zhuǎn)行為,4周后造模成功率為88.6% ;Kirik等[13]采用單側(cè)四點(diǎn)注射后模型的毀損側(cè)紋狀體TH免疫陽(yáng)性纖維缺失80%～95%,而損傷側(cè)SN部的DN缺失達(dá)75%;黃世明等[26]采用單側(cè)CPu四點(diǎn)注射大鼠PD模型,術(shù)后第2周成功率為86.1%。

(4)中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)

大鼠中腦多巴胺的主要來(lái)源是腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)的A10細(xì)胞,它是多巴胺能中腦邊緣通路的起源[27-28]。VTA處進(jìn)行6- OHDA注射可以使黑質(zhì)DN胞體發(fā)生逆行性變性, 還能造成紋狀體DN神經(jīng)末梢發(fā)生順行性變性。有文獻(xiàn)報(bào)道,VTA與軀體運(yùn)動(dòng)密切相關(guān),在該點(diǎn)注射造模能增加大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)[29]。雖然VTA易于操作,但與人類 PD 病理特征不符[30],因此有關(guān)單一VTA部位注射造模的報(bào)道較少,通常與SNc或MFB聯(lián)合注射。

2.2.2 劑量

6-OHDA注射劑量、濃度及部位的選擇都會(huì)影響PD模型的最終表現(xiàn)[31],通過(guò)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),6-OHDA注射劑量從4～30 μg不等,與注射部位和點(diǎn)位密切相關(guān)。黃世明等[26]采用CPu四點(diǎn)注射法,每點(diǎn)注射2 μL,共8 μL,術(shù)后第2周 TH免疫熒光染色示右側(cè)SN無(wú)明顯TH陽(yáng)性的DN細(xì)胞帶,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少且分布不均;杜越群等[32]采用單側(cè)SNc+MFB造模,兩點(diǎn)各注射12 μg/4 μL,術(shù)后2、4和6周PD大鼠毀損側(cè)紋狀體DAT相對(duì)放射計(jì)數(shù)較健側(cè)分別降低了16.8%、35.9%和50.1%,且毀損側(cè)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較健側(cè)分別減少75.22%、81.22%和87.44%。

2.2.3 模型檢測(cè)時(shí)間與持續(xù)時(shí)間

在應(yīng)用6-OHDA模型的研究中,首次檢測(cè)時(shí)間是一個(gè)關(guān)鍵的時(shí)間節(jié)點(diǎn),根據(jù)大量研究發(fā)現(xiàn),首次檢測(cè)時(shí)間通常在造模1周以后,最廣泛使用的時(shí)間是1～3周。在具體的實(shí)驗(yàn)操作中,模型動(dòng)物首次旋轉(zhuǎn)行為出現(xiàn)的時(shí)間與諸多造模因素密切相關(guān),因此本文所綜述內(nèi)容僅供參考。李澤鴻等[33]在術(shù)后第1、2、3周分別進(jìn)行APO旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn), 模型組在術(shù)后1周即可誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為且次數(shù)隨時(shí)間增加而升高;賈叢康等[34]在術(shù)后2、4、8、12周分別對(duì)各組大鼠的行為進(jìn)行檢測(cè),其中有3只大鼠于術(shù)后2周即誘發(fā)出了旋轉(zhuǎn)行為,4周后有40%的動(dòng)物可誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為,12周時(shí)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較2、4、8 周組明顯減少但仍符合模型成功的納入標(biāo)準(zhǔn),這提示造模4周時(shí)結(jié)果最為穩(wěn)定,12周以后模型具有自我恢復(fù)的傾向。此外,劉毅等[35]在術(shù)后4周進(jìn)行檢測(cè), 造模成功率達(dá)55.8%,且持續(xù)觀察至術(shù)后10個(gè)月,模型大鼠仍可誘發(fā)出旋轉(zhuǎn)行為,說(shuō)明6-OHDA造成的模型損傷較為穩(wěn)定,且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。

2.2.4 操作注意事項(xiàng)

關(guān)于藥物的配置,要注意6-OHDA極易發(fā)生氧化反應(yīng),當(dāng)溶液由透明變色至淡粉色或橘粉色時(shí),說(shuō)明藥液已經(jīng)氧化,應(yīng)當(dāng)棄用。因此在配置時(shí)要嚴(yán)格避光、低溫操作,文獻(xiàn)中往往以含0.02%～0.2%抗壞血酸的生理鹽水溶液配置,完成后快速分裝凍存,需要時(shí)取用。在進(jìn)行注射操作時(shí),進(jìn)樣針也應(yīng)當(dāng)采用錫紙包裹避光,盡量維持藥物的效力。進(jìn)針時(shí)應(yīng)保持勻速緩慢,通常選擇0.5～1.0 μL/min,留針時(shí)間選擇5～15 min,以使藥液更好地?cái)U(kuò)散和吸收,退針時(shí)應(yīng)同樣注意勻速緩慢退出,防止藥液溢出。此外,許多研究者采用預(yù)先腹腔注射地昔帕明(25 mg/kg)和帕吉林 (5 mg/kg) 來(lái)促進(jìn)6-OHDA的吸收,其中地昔帕明可減少 6-OHDA引起的去腎上腺素和5-羥色胺減少,帕吉林可減少6-OHDA分解,因此常在注射造模前使用,提高6-OHDA的藥效[36-37]。術(shù)后通過(guò)連續(xù)1周腹腔注射青霉素,或者手術(shù)處涂抹紅霉素軟膏[38]的方法來(lái)預(yù)防傷口感染。關(guān)于立體定位操作,要注意齒桿與耳桿的位置關(guān)系,牛朝詩(shī)等[10]提出當(dāng)門(mén)齒桿比耳桿低約2.4 mm時(shí),可使250 g左右的SD大鼠前囟與后囟保持在一個(gè)平面。造模時(shí),應(yīng)當(dāng)注意以上細(xì)節(jié),以提高模型的成功率,減少動(dòng)物的死亡率。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

通過(guò)觀察動(dòng)物的行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等變化,可以判斷6-OHDA模型建立是否成功,并以此探討該方法制備大鼠PD動(dòng)物模型的可行性和成功率。

2.3.1 行為學(xué)檢測(cè)指標(biāo)

經(jīng)統(tǒng)計(jì),6-OHDA模型常用的行為學(xué)檢測(cè)方法包括阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)(Apomorphine-induced rotation test),苯丙胺誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)(DAmphetamine-induced rotation test)、圓筒實(shí)驗(yàn)(the cylinder test)、空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)(the open feild test)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)(the rotarod test)等。其中46.63%的研究選擇了阿撲嗎啡旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),17.42%的研究選擇了苯丙胺旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)估動(dòng)物的最大損傷程度,也是判斷6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型成功與否的金標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)文獻(xiàn)顯示,在大部分研究中研究者通常采用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定模型的是否成功,另?yè)?～3種行為學(xué)方法評(píng)估模型的其他行為學(xué)改變。詳見(jiàn)表2。

表2 6-OHDA模型的常用行為學(xué)檢測(cè)方法Table 2 Common behavioral tests of the 6-OHDA model

2.3.2 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

組織形態(tài)的改變通常選擇尼氏染色法(Nissl’s staining)和蘇木精-伊紅染色法(HE staining) 。觀察6-OHDA模型大鼠術(shù)后48 h的SNc部位,HE染色可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹、胞核變大、核呈空泡狀,且部分出現(xiàn)核裂解以及部分胞體溶解等,術(shù)后4周和8周可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞凝固性壞死,伴有大量膠質(zhì)細(xì)胞彌漫性或局限性增生[38]。SN區(qū)域可見(jiàn)神經(jīng)元胞體形態(tài)不規(guī)則、結(jié)構(gòu)模糊、數(shù)量減少[48];尼氏染色中出現(xiàn)SNc及VTN區(qū)神經(jīng)元數(shù)目顯著減少, 尼氏體模糊, 著色較淺, 有大量膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)[49]。

2.3.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

為檢測(cè)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型引起的一系列的分子生物學(xué)的改變,最常用的檢測(cè)方法有免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)、免疫熒光法(immunofluorescent staining,IF)、蛋白免疫印跡法(Western blot)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)等。文獻(xiàn)表明,TH是DN特有的多巴胺合成限速酶,黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量與DA的含量呈相同趨勢(shì),因此可作為DN的特異性標(biāo)記物,通過(guò)IHC法對(duì)腦組織中的TH進(jìn)行標(biāo)記能很好地反映腦內(nèi)DN數(shù)量的變化[48]。臨床患者和PD動(dòng)物模型的相同特點(diǎn)之一就是腦組織中的TH合成減少,因此,IHC法檢測(cè)TH能很好地反映黑質(zhì)多DN變化,是鑒定6-OHDA模型的重要方法。詳見(jiàn)表3。

表3 6-OHDA模型的常用分子生物學(xué)檢測(cè)方法及指標(biāo)Table 3 Common molecular biological detection methods and indicators of the 6-OHDA model

2.3.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

針對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型常引起一系列的神經(jīng)遞質(zhì)、激素、代謝產(chǎn)物的變化,最常用的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)與分光光度計(jì)法(UV spectrophotometry)等。DA是PD疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中最重要的神經(jīng)遞質(zhì),HVA和DOPAC是DA代謝產(chǎn)物,可以反映DA水平[50]。通過(guò)文獻(xiàn)可發(fā)現(xiàn),ELISA和HPLC檢測(cè)DA及其代謝產(chǎn)物的水平變化,是6-OHDA模型的一項(xiàng)重要檢測(cè)指標(biāo)。詳見(jiàn)表4。

表4 6-OHDA模型的常用生化檢測(cè)方法及指標(biāo)Table 4 Common biochemical detection methods and index of 6-OHDA model

2.4 6-OHDA模型在中藥藥效研究中的應(yīng)用

目前,6-OHDA大鼠模型已廣泛應(yīng)用于抗PD中藥藥效研究中,本文收集近年來(lái)6-OHDA大鼠模型在單味藥及復(fù)方研究中的應(yīng)用情況。

2.4.1 6-OHDA模型在單味中藥提取物及有效組分對(duì)PD防治作用研究中的應(yīng)用

崔爽等[44]采用右側(cè)黒質(zhì)單點(diǎn)注射6-OHDA建立模型,造模成功后予以杜仲醇提取物聯(lián)合左旋多巴治療,在給藥7 d后發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療顯著改善了模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能的損傷,提高了黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)和DA水平,并恢復(fù)SOD、GSH-Px及NOS水平,降低了MDA水平;陳子方等[51]采用SN+VTA注射6-OHDA建立模型,持續(xù)21 d灌胃天麻提取物,發(fā)現(xiàn)天麻提取物低中高劑量組均有降低阿撲嗎啡導(dǎo)致的PD大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的趨勢(shì),其中高劑量還可以顯著增加水迷宮實(shí)驗(yàn)中平臺(tái)象限距離百分比 (PT%)和停留時(shí)間百分比(T%),證明了天麻提取物能顯著改善PD大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙和學(xué)習(xí)記憶能力;文曉東等[52]采用單側(cè)CPu注射,對(duì)各組大鼠腦組織中線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物I、II、III、IV的活性進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)烏梅總黃酮高劑量組可恢復(fù)PD模型腦組織中線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性的下降,可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能障礙等途徑來(lái)保護(hù)PD大鼠的DN神經(jīng)元;池彬彬等[53]采用單側(cè)MFB損傷14d后造成PD模型,研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb與左旋多巴聯(lián)用可預(yù)防PD異動(dòng)癥的發(fā)生,且Rb能顯著改善大鼠紋狀體內(nèi)mGluR1和PV表達(dá)水平的下降;尹帥領(lǐng)等[54]將6-OHDA注入右側(cè)CPu建立模型,予以造模成功大鼠肉蓯蓉多糖灌胃治療,持續(xù)10d,結(jié)果顯示肉蓯蓉多糖可顯著恢復(fù)模型動(dòng)物游泳不動(dòng)時(shí)間縮短,自主活動(dòng)站立次數(shù)下降的現(xiàn)象,增加Wnt1、βcatenin蛋白水平,降低GSK-3β mRNA水平;沒(méi)食子酸是茯苓的主要活性成分提取物之一,秦劭晨等[55]通過(guò)右側(cè)VTA注射制備PD模型,發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸可顯著減少PD大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù),增加轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間,并可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路來(lái)降低PD大鼠的氧化應(yīng)激損傷。

2.4.2 6-OHDA模型在中藥復(fù)方對(duì)PD防治作用研究中的應(yīng)用

王煒為等[50]采用單側(cè)SNc+VTA注射建立6-OHDA模型探究補(bǔ)腎止顫方(熟地、山茱萸、山藥、肉蓯蓉)的抗PD作用,在給藥10 d和20 d后分別進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎止顫方可以在損傷早期降低PD大鼠阿撲嗎啡誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)圈次數(shù),增加PD大鼠DN的表達(dá),降低神經(jīng)損傷;李曉明等[56]采用6-OHDA單側(cè)損毀SN聯(lián)合附子湯灌胃建立肝陽(yáng)上亢型PD模型,探究鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯(懷牛膝、代赭石、生牡蠣、生龍骨、生龜板、生白芍、元參、天冬、生麥芽、川楝子、茵陳、甘草)的抗PD作用機(jī)制,結(jié)果表明鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可以顯著降低PD大鼠中腦MDA含量,上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá);常學(xué)輝等[57]采用單側(cè)SNc注射造模,予以龜羚帕安丸(由龜板、羚羊角、全蝎、威靈仙、厚樸等藥物組成鄭衛(wèi)制劑Z04010162)持續(xù)30 d灌胃治療,結(jié)果顯示龜羚帕安丸可有效提高PD大鼠中腦黑質(zhì)Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá),降低P62的表達(dá),提高細(xì)胞自噬活性;邵躍斌[58]采用單側(cè)兩點(diǎn)SN注射,模型成功后給與杞菊地黃丸2 g/kg(枸杞子、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉)灌胃聯(lián)合針刺陽(yáng)陵泉穴治療,連續(xù)治療4周后,聯(lián)合治療組大鼠的GSH、SOD含量,BDNF表達(dá)量均顯著升高;霍綺雯等[59]利用CPu兩點(diǎn)注射6-OHDA模型探究《證治準(zhǔn)繩·類方》中經(jīng)典方劑定振丸(天麻、秦艽、全蝎、生地、熟地、當(dāng)歸、川穹、白芍、防風(fēng)、白術(shù)、黃芪、石決明、生牡蠣、鉤藤)對(duì)PD的改善作用,結(jié)果顯示,定振丸能顯著增高PD大鼠DA、DOPAC、HVA、5-HT、SOD、GSH-Px水平,具有改善兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)及黑質(zhì)DN氧化應(yīng)激的作用,下調(diào)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá),上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),具有抑制DN凋亡的作用;滕龍等[60]采用單側(cè)SN兩點(diǎn)注射,腹腔注射左旋多巴+芐絲肼建立陰虛動(dòng)風(fēng)證異動(dòng)癥模型,予以中藥復(fù)方地黃方(熟地黃、鉤藤、珍珠、白芍、丹參、石菖蒲、全蝎、綠茶),發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方地黃方可降低AIM評(píng)分,改善左旋多巴誘發(fā)的異動(dòng)癥現(xiàn)象。

3 小結(jié)

PD是以震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病,為了進(jìn)一步探究其病因及治療,研究者們根據(jù)PD的臨床和病理表現(xiàn)建立不同的動(dòng)物模型,本綜述總結(jié)了6-OHDA模型的特點(diǎn),為選擇6-OHDA模型的研究者提供一些參考:(1)6-OHDA模型最常用的品系是SD或Wistar大鼠,為避免雌性大鼠激素周期等對(duì)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的干擾,若無(wú)特殊研究需求,可選雄性大鼠;(2)造模大鼠的品系及體重應(yīng)當(dāng)與注射位點(diǎn)坐標(biāo)所參考的腦立體定向圖譜基本一致,盡量避免因種屬和重量帶來(lái)的造模不穩(wěn)定性,提高成功率。(3)雙側(cè)損傷創(chuàng)傷較大,死亡率高,推薦使用單側(cè)損傷。(4)6-OHDA注射部位、劑量的不同,可誘導(dǎo)不同的損傷類型,SN和MFB部位注射所導(dǎo)致的DA能神經(jīng)元損傷較大,通常用于制備晚期PD模型;CPu注射部位造成的DN損傷較低,可用于制作早中期PD模型;VTA部位通常與SNc或MFB聯(lián)合注射,增加模型的成功率。(5)6-OHDA注射后導(dǎo)致DN發(fā)生漸近性損傷,腹腔或皮下注射DA受體激動(dòng)劑APO或釋放劑D-amp會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生向健側(cè)或患側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為,通常以旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中的評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)圈次數(shù)(r/min)指標(biāo)來(lái)作為模型是否成功的標(biāo)準(zhǔn)。(6)6-OHDA操作簡(jiǎn)單、動(dòng)物成本低、行為學(xué)變化持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),不易自行恢復(fù),但無(wú)法模擬PD患者產(chǎn)生LB的病理特征,因此在選擇該模型時(shí)需要注意,若要探究LB的相關(guān)成因和機(jī)制,不宜選擇6-OHDA模型。(7)抗PD中藥研究的應(yīng)用中,通常采用灌胃給藥的干預(yù)方式,少數(shù)采取腹腔注射的干預(yù)方式。部分研究選擇造模完成后,先通過(guò)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)將造模成功的動(dòng)物納入,再行分組干預(yù),也有部分研究選擇在造模前提前干預(yù),以探究藥物的預(yù)防作用,但不管選種方式,應(yīng)注意6-OHDA造成的模型損傷較大,因此干預(yù)周期不可太短。

綜上所述,通過(guò)分析 6-OHDA大鼠模型的動(dòng)物品系、性別、體重、造模部位和檢測(cè)方法,以期為抗PD中藥的藥效研究提供模型方案參考。