蛹蟲草提取物對腎陽虛模型大鼠睪丸CYP19/CaM/CaMKⅡ信號的影響

陳思源王思雨祁明媛李壟坡徐儀昕張 婷姚紫研趙洪慶*

(1.湖南中醫(yī)藥大學,長沙 410208;2.湖南炎帝生物工程有限公司,湖南 株洲 412000)

腎陽虛是臨床最為常見的證型之一,由于患者素體陽虛、年老腎虧、久病傷腎等因素引起腎陽氣衰竭,以腰膝酸軟、畏寒肢冷、夜尿頻多、精神萎靡、性欲減退等為主要特征,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。西醫(yī)針對單一癥狀進行治療,存在副作用多、依賴性、成癮性及停藥復發(fā)等缺點,中醫(yī)藥立足整體,辨證論治,能夠系統(tǒng)調(diào)節(jié)機體腎陽虛相關癥狀,療效獨特,從天然產(chǎn)物中開發(fā)安全有效的補腎陽產(chǎn)品,將具有重要的臨床價值及廣闊的市場前景。

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蟲草,為麥角菌科、蟲草屬真菌,是由子實體與菌核組成的復合體,其性平味甘,具有補肺益腎、止血化痰、延緩衰老的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明,蛹蟲草的活性成分主要包括蟲草素、蟲草酸、甾醇類及蟲草多糖,具有增強免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、神經(jīng)保護、性功能保護等作用,因其與冬蟲夏草具有類似的活性成分與臨床療效,能夠改善患者的肺腎氣虛證及疲勞綜合征,補腎壯陽,且蛹蟲草易于培育,成本相對較低,近年來已逐漸成為冬蟲夏草的替代品,應用廣泛,具有很強的開發(fā)價值[2-3]。然而,目前關于蛹蟲草的基礎研究較少,其能否改善腎陽虛模型大鼠的腎陽虛狀態(tài),相關機制如何,尚未有相關報道,需要進一步的相關基礎研究進行深入探討。

芳香化酶基因CYP19是細胞色素P450超基因家族中的重要成員,主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及卵巢、睪丸等生殖系統(tǒng)相關組織中。研究表明,CYP19能夠通過調(diào)控下游信號編碼芳香化酶P450arom基因,后者能夠催化睪酮轉(zhuǎn)化為雌激素,是雌激素體內(nèi)合成的關鍵酶和限速酶,與下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG)軸功能密切相關[4-5]。鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(calmodulin/calmodulin kinase Ⅱ, CaM/CaMKⅡ)是CYP19潛在的下游信號,能夠調(diào)節(jié)HPG軸功能,并與睪丸間質(zhì)細胞的完整性密切相關[6]。本研究擬建立腎陽虛大鼠模型,明確蛹蟲草通過增加體內(nèi)CYP19的表達,進而抑制CaM/CaMKⅡ激活,從而調(diào)控HPG軸發(fā)揮補腎陽功效的作用機理。該機制的證實將首次明確CYP19/CaM/CaMKⅡ信號介導大鼠腎陽虛病理狀態(tài)及蛹蟲草的功效特點與潛在機制,將為蛹蟲草的開發(fā)應用提供重要理論支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠60只,雄性,SPF級,7周齡,體重200～220 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],質(zhì)量合格證號(430727201101573875),飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心[SYXK(湘)2019-0009]。動物飼養(yǎng)室溫度(22±2)℃,濕度(60±5)%,12 h明暗交替,適應性喂養(yǎng)3 d后開始實驗。實驗過程均符合實驗動物3R原則,經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查通過(LLBH-202009140001)。

1.2 主要試劑與儀器

蛹蟲草由湖南炎帝生物工程有限公司提供,將蛹蟲草粉末用10倍量水浸泡30 min,提取兩次,第一次100℃浸提120 min,提取液過200目篩,藥渣繼續(xù)加水浸提60 min后過200目篩,合并濾液,于60～80℃減壓濃縮至相對密度1.18～1.25,冷凍干燥48 h得蛹蟲草提取物;睪丸片由江西澤眾制藥股份有限公司生產(chǎn),國藥準字H36022006,生產(chǎn)批號:20200103,規(guī)格:36片(每片0.2 g),人用劑量為2.4 g/d;腺嘌呤(北京索萊寶科技公司,批號:20200514);大鼠促性腺激素釋放激素(gonadotropinreleasing hormone, GnRH)、黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、睪酮(testosterone, T)、雌二醇(estradiol, E2)ELISA試劑盒(江蘇菲亞生物科技公司,批號:FY3396-A、FY3676-A、FY3452-A、FY3450-A);CYP19、CaM、CaMKⅡ一抗(英國Abcam公司,批號:ab106168、ab134901、ab134041);β-tubulin一抗(美國Proteintech公司,批號:10094-1-AP);BCA蛋白定量試劑盒、RIPA組織裂解液、RNA提取液(武漢賽維爾生物科技公司,批號:G2026、G2002、G3013);DAB試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(武漢博士德生物公司,批號:AR1022、MK1613)。

ME204型萬分之一精密天平購自瑞士梅特勒托利多公司;OML-QPA型生物組織切片機購自湖北歐美萊科技公司;NP-B1型全自動生物組織包埋機、NP-P3型組織攤烤片機購自孝感市諾普電子科技公司;NanoDrop One超微量分光光度計、MK3型全自動酶標儀購自美國Thermo公司;Primo Star型光學顯微鏡購自德國Zeiss公司;Gel Doc XR+型凝膠成像分析儀、CFX型熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物處理

根據(jù)動物體重將60只大鼠隨機分為正常組、模型組、蛹蟲草提取物高劑量組、蛹蟲草提取物中劑量組、蛹蟲草提取物低劑量組、睪丸片組,每組10只。除正常組外,其余組均采用腺嘌呤(200 mg/kg)灌胃的方法建立腎陽虛大鼠模型[7-8],連續(xù)42 d,正常組灌胃等體積蒸餾水。從造模第15天起開始給予受試藥,依據(jù)《中藥藥理研究方法學(第3版)》中人與大鼠體表面積系數(shù)換算大鼠用藥劑量[9],蛹蟲草提取物高、中、低劑量組給藥劑量分別為0.72、0.36、0.18 g/kg(臨床等效2、1、0.5倍劑量),睪丸片組灌胃給予睪丸片水溶液,給藥劑量為0.216 g/kg(臨床等效劑量),正常組和模型組給予等體積蒸餾水,灌胃體積均為10 mL/kg,每天給藥1次,連續(xù)28 d。末次給藥后,檢測大鼠在體功能指標,完成后麻醉大鼠,剪開腹腔,游離腹主動脈進行采血,解剖分離雙腎、睪丸、附睪、精囊腺組織,萬分之一精密天平稱重,保存于4%多聚甲醛溶液中,其中睪丸組織保存于特定睪丸組織固定液中,用于分子生物學實驗的睪丸組織置于液氮中冷凍保存。

1.3.2 指標檢測

(1)一般指標觀察

觀察各組大鼠行為狀態(tài)、毛發(fā)、二便、飲水飲食、墊料潮濕等情況,稱重,檢測體溫,并采用曠場箱(80 cm×80 cm×40 cm)評價動物的自主活動情況,曠場箱底部均勻劃分為25個方格,動物從中心放入,其自由活動30 s后記錄4 min內(nèi)水平跨格數(shù)及垂直站立數(shù)的總和。

(2)臟器指數(shù)

將組織分離后于萬分之一分析天平上稱重,計算臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/體重(g)。

(3)ELISA實驗

采血后將血液靜置1 h,3000 r/min離心15 min,取上清液,得到血清樣本。采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清GnRH、LH、T、E2水平,操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。根據(jù)標準曲線計算各組樣本中目的因子的含量。

(4)HE染色

組織充分固定后,石蠟包埋,以5 μm厚度連續(xù)切片,梯度乙醇脫水、浸蠟、水化、沖洗,采用蘇木精-伊紅進行染色,完成后將切片固定,中性樹脂封片,顯微鏡下進行圖像采集,觀察各組大鼠腎、睪丸、附睪、精囊腺的病理形態(tài)并進行拍照分析。

(5)免疫組化染色

取充分固定的睪丸組織,石蠟包埋,切片、脫水、浸蠟、水化、沖洗,滴加山羊血清于37℃封閉30 min,按說明書對一抗進行稀釋,采用稀釋后的一抗4℃孵育過夜;次日采用PBS緩沖液洗滌切片3次,反應增強液孵育10 min后用二抗繼續(xù)孵育15 min;洗滌3次,DAB顯色液顯色5 min后用蘇木精復染15 s,脫水,透明,封片。于顯微鏡下選取視野進行拍攝,應用Image J軟件分析目的蛋白的積分光密度(IOD)值。

(6)Western blot實驗

切取100 mg睪丸組織,加入1 mL組織裂解液冰上充分勻漿,離心取上清液,檢測上清液中總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠,將蛋白煮沸變性后上樣,上樣量為50 μg,80 V恒壓電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉2 h,加入按說明書稀釋后的一抗,4℃孵育過夜。次日用TBST液洗滌條帶3次,每次15 min,加入二抗繼續(xù)孵育4 h,洗滌條帶3次,滴加混合顯影液,將條帶置于凝膠成像儀中顯影。應用Image J軟件分析條帶灰度值,目的蛋白的相對表達量為目的蛋白條帶灰度值除以內(nèi)參蛋白(β-tubulin)灰度值。

(7)RT-qPCR實驗

切取100 mg睪丸組織,按照RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA,以mRNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為模板進行PCR擴增,反應體系為:95℃、10 min預變性,95℃、15 s變性,60℃、30 s退火延伸,40個循環(huán)。采用經(jīng)典2-ΔΔCT法(Liva法)根據(jù)內(nèi)參基因GAPDH的表達分析目的基因mRNA的表達水平。引物由武漢賽維爾公司合成,其中CYP19引物序列(NM_017085.2):上游 5’-GCTGGACACTTCTAACAC GCTCTT-3’,下 游 5’-CTCCTTTGTCAGGTCTCC ACGT-3’,片段長度298 bp;GAPDH引物序列(NM_017008.4):上游 5’-CTGGAGAAACCTGCCAA GTATG-3’,下游5’-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3’,片段長度138 bp。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。本研究實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析,多重比較方差齊時用LSD檢驗法,方差不齊時用Tambane’sT檢驗法,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 蛹蟲草提取物對模型大鼠一般指標的影響

正常組大鼠行為活動、飲水攝食均正常,有明顯的探索欲,毛色光亮整潔,墊料較干凈,大便成形;模型組大鼠外形消瘦,墊料明顯潮濕,大便稀薄不成形,體溫降低(P＜0.01),自主活動次數(shù)顯著減少(P＜0.01);蛹蟲草提取物組大鼠行為活動較正常,毛色亮潔,墊料較臟,潮濕程度一般,大便基本成形,高劑量組體溫升高(P＜0.05),自主活動次數(shù)增加(P＜0.05)。見表1。

表1 蛹蟲草提取物對模型大鼠體重、體溫及自主活動次數(shù)的影響 (n=10)Table 1 Effects of Cordyceps militaris extract on body weight, body temperature and the number of voluntary activities in model rats

2.2 蛹蟲草提取物對模型大鼠臟器指數(shù)的影響

與正常組相比,模型組大鼠腎臟指數(shù)、睪丸指數(shù)顯著增加(P＜0.01),精囊腺指數(shù)降低(P＜0.01);與模型組相比,蛹蟲草提取物高劑量組腎臟指數(shù)與睪丸指數(shù)顯著降低(P＜0.05),精囊腺指數(shù)增加(P＜0.05),同時,中劑量組與低劑量組腎臟指數(shù)均顯著降低(P＜0.05)。見表2。

表2 蛹蟲草提取物對模型大鼠臟器指數(shù)的影響 (mg/g, n=10)Table 2 Effects of Cordyceps militaris extract on the organ index of model rats

2.3 蛹蟲草提取物對模型大鼠血清因子水平的影響

與正常組相比,模型組血清GnRH、LH、T含量均顯著降低(P＜0.01),E2含量無顯著變化;與模型組相比,蛹蟲草提取物高劑量組GnRH、LH、T含量均升高(P＜0.05),睪丸片組僅睪酮含量顯著升高(P＜0.01)。見表3。

表3 蛹蟲草提取物對模型大鼠血清因子的影響 (n=6)Table 3 Effects of Cordyceps militaris extract on serum factors in model rats

2.4 蛹蟲草提取物對模型大鼠組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠腎組織腎小球形狀規(guī)則,輪廓清晰,未觀察到炎性細胞的浸潤;睪丸生精小管基膜完整且厚,基膜內(nèi)可見排列整齊、致密且結(jié)構(gòu)正常的生精細胞及支持細胞,生精小管管腔內(nèi)可見大量精子;附睪管腔結(jié)構(gòu)清晰,管壁細胞排列緊密整齊,管壁較厚;精囊腺腺腔內(nèi)有許多皺襞,表面為假復層柱狀上皮,內(nèi)含有豐富的分泌顆粒、脂肪滴及脂褐素;模型組腎小球體積增大,基底膜明顯擴張,通透性增加,伴有大量炎性細胞的浸潤,部分大鼠可見明顯的腺嘌呤代謝物結(jié)晶累積;睪丸生精小管基膜變薄,基膜內(nèi)生精細胞排列紊亂,數(shù)量減少,生精小管腔內(nèi)間隙增大,精子數(shù)量減少;附睪部分管腔拉伸變形,管壁變薄,部分管壁破裂,偶可見碎片,管腔內(nèi)精子數(shù)量下降;精囊腺腺腔皺襞萎縮變薄,通透性增加,內(nèi)含物豐度減少。經(jīng)藥物治療后,各臟器損傷有不同程度的緩解,以蛹蟲草提取物高劑量組效果最佳。見圖1。

圖1 蛹蟲草提取物對模型大鼠組織形態(tài)的影響 (HE染色)Figure 1 Effects of Cordyceps militaris extract on the tissue morphology of model rats (HE staining)

2.5 蛹蟲草提取物對模型大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMK Ⅱ陽性表達的影響

與正常組相比,模型組睪丸組織CYP19平均光密度值顯著下降(P＜0.01) ,CaM、CaMK Ⅱ顯著增加(P＜0.01);與模型組相比,蛹蟲草提取物高劑量組CYP19平均光密度值升高(P＜0.01),CaM、CaMK Ⅱ降低(P＜0.01),中劑量組CYP19表達增加(P＜0.05),CaM降低(P＜0.01)。見圖2、表4。

表4 蛹蟲草提取物對模型大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMKⅡ平均光密度值的影響 (n=4)Table 4 Effects of Cordyceps militaris extract on the average optical density of CYP19, CaM and CaMKⅡ in the testis of model rats

圖2 各組大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMKⅡ陽性表達情況 (免疫組化)Figure 2 The positive expression of CYP19, CaM and CaMKⅡ in testis of rats in each group (immunohistochemistry)

2.6 蛹蟲草提取物對模型大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMK Ⅱ蛋白表達的影響

與正常組相比,模型組大鼠睪丸CYP19蛋白表達顯著降低(P＜0.01),CaM、CaMK Ⅱ顯著增加(P＜0.01);經(jīng)睪丸片或高劑量蛹蟲草提取物干預治療后,模型大鼠CYP19、CaM、CaMK Ⅱ蛋白表達均得到有效逆轉(zhuǎn)(P＜0.01、P＜0.05),中劑量組對CYP19、CaMK Ⅱ表達也有顯著作用(P＜0.05)。見圖3、表5。

圖3 各組大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMK Ⅱ蛋白電泳圖Figure 3 Electrophoresis of CYP19, CaM and CaMKⅡ proteins in testis of rats in each group

表5 蛹蟲草提取物對模型大鼠睪丸CYP19、CaM、CaMKⅡ表達的影響 (n=4)Table 5 Effects of Cordyceps militaris extract on the expression of CYP19, CaM and CaMKⅡ in the testis of model rats

2.7 蛹蟲草提取物對模型大鼠睪丸CYP19 mRNA表達的影響

與正常組相比,模型組睪丸CYP19 mRNA表達顯著降低(P＜0.01) ;與模型組相比,睪丸片組和蛹蟲草提取物高劑量組CYP19 mRNA水平顯著升高(P＜0.05)。見表6。

表6 蛹蟲草提取物對模型大鼠睪丸CYP19 mRNA表達的影響 (n=4)Table 6 Effects of Cordyceps militaris extract on the expression of CYP19 mRNA in the testis of model rats

3 討論

《中華本草》中記載,蟲草入肺腎二經(jīng),既能滋肺陰,又能補腎陽,主治腎虛,陽痿遺精,腰膝酸痛,病后虛弱等。現(xiàn)代藥理研究證實,蛹蟲草具有腎保護作用。Sun等[10]研究表明,蛹蟲草通過影響Toll樣受體4/核因子κB(toll-like receptor 4/nuclear factor κB, TLR4/NF-κB)氧化還原信號通路改善慢性腎疾病;Cai等[11]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草通過調(diào)控沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)介導的自噬改善大鼠腎性高血壓損傷和腎纖維化;李冰等[12]研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草提取物能夠同時發(fā)揮降血糖和腎保護作用,減緩糖尿病大鼠腎病程進展;此外,蛹蟲草對慢性腎衰、腎小球腎炎、肺腎氣虛證等病證也有一定的治療作用[13-15]。蛹蟲草腎保護作用主要與蟲草素以及多糖類成分有關。Kopalli等[16]明確來源于藥用真菌蛹蟲草的蟲草素能夠減輕自然衰老大鼠體內(nèi)炎癥介導的腎和睪丸組織損傷;蟲草素還具有補腎益精、改善性功能的功效[17],蛹蟲草多糖則是蛹蟲草治療糖尿病腎病的主要有效成分[18]。然而,目前關于蛹蟲草對腎陽虛模型動物的研究僅限于小鼠的在體功能及組織病理變化[19],未涉及相關機制,對于蛹蟲草的開發(fā)有一定局限。本研究旨在建立腎陽虛大鼠模型,通過予以不同劑量的蛹蟲草提取物干預,研究其補腎陽的功效及潛在作用機理。

腎陽虛病理模型主要包括大劑量激素造模、化學藥物誘導損傷、手術(shù)造模、自然衰老等,其中應用最廣泛的是激素造模中的氫化可的松致腎陽虛模型及藥物造模中的腺嘌呤致腎陽虛模型,且兩者原理均是通過影響機體內(nèi)分泌軸的功能而引起腎陽虛癥狀[20-21]。腺嘌呤是核酸的主要組成成分之一,當機體攝入大劑量腺嘌呤時,在酶的作用下轉(zhuǎn)變成極難溶解于水的2,8-二羥基腺嘌呤,沉積于腎小管,導致腎功能低下,同時其具有毒性作用,使腎組織中與糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝有關的多種酶活性受到抑制,影響腎組織的能量代謝[22]。經(jīng)文獻調(diào)研及前期預實驗摸索,本研究采用200 mg/kg劑量的腺嘌呤造模,發(fā)現(xiàn)大鼠外形消瘦、皮毛無光澤、活動減少、體溫降低、尿量明顯增多、大便稀溏,表現(xiàn)出典型的腎陽虛癥狀,模型建立成功。

HPG軸是機體三大功能軸之一,主要負責調(diào)控機體生殖功能。中醫(yī)認為腎主生殖,腎與生殖系統(tǒng)功能關系密切,腎虛與HPG軸功能異常亦密切相關[23]。HPG軸通過下丘腦分泌GnRH,作用于垂體釋放促卵泡生成素 (follicle-stimulating hormone, FSH) 、LH,該類激素的合成分泌又進一步作用于性腺組織,調(diào)節(jié)睪酮、雌二醇等性激素的分泌并反饋于下丘腦,從而調(diào)節(jié)機體生殖功能[24]。腎陽虛通常伴隨著生殖功能的衰退,性激素分泌紊亂,在雄性中主要表現(xiàn)為睪酮分泌不足。本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠體內(nèi)GnRH、LH、睪酮含量均顯著下降,雌二醇含量有上升趨勢,同時腎、睪丸、附睪、精囊腺等與生殖相關的組織均存在明顯損傷,而蛹蟲草提取物能夠上調(diào)HPG軸相關激素的水平,恢復HPG軸功能,緩解生殖組織的損傷狀態(tài)。

CYP19是細胞色素P450超基因家族中19號家族的唯一成員,負責編碼芳香化酶P450arom基因,后者與性腺激素的合成分泌密切相關。一方面,CYP敲除的雄性小鼠不能產(chǎn)生雌激素,導致生精細胞發(fā)育受阻,精子數(shù)量及活性明顯降低,小鼠生殖功能低下甚至完全不育[25];另一方面,睪丸組織CYP19的過表達會導致雌激素產(chǎn)生過多,也可引起不育[26]。CYP19基因主要通過cAMP依賴性蛋白激酶信號在轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)節(jié),對于維持雌雄激素間的平衡、保證機體的正常生理功能具有重要意義[27]。CaM/CaMKⅡ信號通路是cAMP依賴性蛋白激酶信號傳導系統(tǒng)的重要組成部分。CaM是一種鈣結(jié)合蛋白,靜息態(tài)下無生物活性,在胞內(nèi)Ca2+增加時,CaM會結(jié)合形成Ca2+/CaM復合物,并通過激活其特異性激酶CaMKⅡ發(fā)揮生物學活性[28-29]。CaM與垂體-靶腺軸的分泌功能密切相關,可以作用于HPG軸的不同環(huán)節(jié)、不同層次,并通過不同的途徑對其進行著復雜而精細的調(diào)節(jié)作用。研究表明,CaM表達增加可以通過線粒體途徑引起睪丸細胞凋亡,抑制CaMKⅡ能夠緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和氧化損傷,提高睪丸間質(zhì)細胞的完整性[30]。本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠睪丸組織CYP19 mRNA和蛋白表達均顯著降低,CaM、CaMKⅡ表達顯著增加,證實CYP19通過CaM/CaMKⅡ信號通路介導大鼠生殖損傷,而蛹蟲草提取物則能明顯逆轉(zhuǎn)該趨勢。

綜上,蛹蟲草提取物能夠調(diào)節(jié)HPG軸功能,緩解腎、睪丸等組織損傷,發(fā)揮補腎陽功效,其機制可能與調(diào)控CYP19/CaM/CaMKⅡ信號有關。本研究首次闡明蛹蟲草補腎陽的潛在機理,有助于進一步開發(fā)應用,下一步繼續(xù)挖掘其功效作用及潛在靶點。