清肺顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

薛沾枚，張 艷，劉雪松，張 備，郝敬友，蘇 景，張國華，唐 偉，劉彥凱，孫洪杰，王 巖，史同瑞*

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.黑龍江省獸用藥物重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161005；3.黑龍江省動物疫病控制中心，哈爾濱 150069；4.哈爾濱綠達(dá)生動物藥業(yè)有限公司，哈爾濱 150039)

清肺顆粒收載于《中國獸藥典》2020版第二部，清肺顆粒中含有5味中藥，分別是板藍(lán)根、南葶藶子、貝母、桔梗、甘草，具有清肺止咳與化痰平喘的功效[1]。主要用于治療畜禽呼吸道疾病。板藍(lán)根清熱解毒，涼血利咽；南葶藶子是播娘篙成熟種子經(jīng)干燥后而成的，瀉肺平喘，利水消腫；貝母清熱潤肺、化痰止咳、平喘鎮(zhèn)痛；桔梗能夠起到開宣肺氣、利咽祛痰、益氣排膿的作用；甘草有調(diào)節(jié)諸藥、止咳潤肺、解毒抗炎的功效[2-6]。目前藥典中記載清肺顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對滯后，僅有貝母、桔梗、甘草的薄層色譜鑒別，缺少板藍(lán)根、葶藶子的定性鑒別和對主要藥效含量測定，很難對市場上的清肺顆粒的質(zhì)量進(jìn)行全面評價[7]。

為進(jìn)一步研究清肺顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用TLC法對清肺顆粒中中藥成分進(jìn)行鑒別，采用HPLC法對清肺顆粒中主要藥理活性成分，槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷進(jìn)行定量測定[8-9]。本試驗從成分鑒別與含量測定兩方面研究了清肺顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為能夠在臨床應(yīng)用中最大化發(fā)揮藥效，保證制劑的安全性和有效性，減輕和治療畜禽呼吸道疾病，提高畜禽產(chǎn)品的安全性及質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 儀器 薄層電動點樣器(SP-II)、全自動展開儀(TK-20E)、雙噴頭超細(xì)電動噴霧器(TS-II)，購自上?？普苌萍加邢薰?；高效液相色譜儀(LC-20AT，RF-20A)、InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)購自島津(中國)有限公司；紫外分析儀(ZF-1，邦西儀器科技有限公司)。

1.2 材料 清肺顆粒劑(批號分別為20200606，20200407，20200408由哈爾濱綠達(dá)生動物藥業(yè)有限公司研制)；硅膠G、GF薄層板(青島海洋化工廠分廠)；乙腈與甲醇(色譜級，美國北京迪科馬科技有限公司)；甲酸(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；石油醚(分析純、北京迪科馬科技有限公司)；乙酸乙酯(分析純、北京迪科馬科技有限公司)；水為超純水；槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷(批號：111854-201905，含量99.9%)與(R, S)-告依春對照品(批號111753-20207，含量100.0%)，均購于中國食品藥品檢定研究院；板藍(lán)根、貝母、桔梗、甘草中藥對照藥材均購于江蘇省永健康醫(yī)療科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 板藍(lán)根薄層色譜鑒別 供試品溶液制備：取清肺顆粒15 g，加50 mL水溶解，加2次二氯甲烷，振搖，提取，每次50 mL，合并提取液，濃縮至1 mL，備用[10]。

對照品制備：取適量(R, S)-告依春對照品加入甲醇充分溶解，制成每1 mL含0.5 mg的溶液。

對照藥材溶液的制備：取板藍(lán)根對照藥材15 g，制備方法同供試品。

陰性對照溶液制備：取未加板藍(lán)根的樣品顆粒劑15 g，制備方法同供試品。

測定方法：吸取上述溶液各1 μL分別點與同一硅膠G薄層板上，展開劑為石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(1∶1)，待展開后，取出，晾干，在紫外光燈(254 nm)下觀察。供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，出現(xiàn)相同顏色的斑點，陰性無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 清肺顆粒中板藍(lán)根TLC圖1 (R,S)-告依春對照標(biāo)準(zhǔn)品2板藍(lán)根對照藥材3-5三批清肺顆粒樣品6陰性對照樣品Fig 1 TLC diagram of Radix et Radix Isatidis in Qingfei Granule1 (R,S)- Gaoyichun reference standard 2Radix isatidis reference medicinal materia3-5Three batches of Qingfei Granule samples 6 Negative control sample

2.1.2 浙貝母薄層色譜鑒別 供試品溶液制備：取清肺顆粒15 g研細(xì)，加入濃氨試液2 mL、三氯甲烷20 mL，密封過夜；超聲30 min，濾液蒸干，殘渣加1 mL三氯甲烷溶解；

對照藥材溶液制備：另取15 g浙貝母對照藥材，制備方法同上；

陰性對照溶液制備：取未加浙貝母的樣品顆粒劑15 g，制備方法同上[11]。測定方法：用毛細(xì)管取上述溶液各1 μL，分別點樣于硅膠G薄板上(CMC-Na為黏合劑)，展開劑為乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(17∶2∶1)，取出，晾干，均勻噴稀碘化鉍鉀顯色液，至有斑點出現(xiàn)[12]。供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，出現(xiàn)相同顏色的斑點，陰性無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 清肺顆粒中貝母TLC圖1 貝母對照藥材2-4三批清肺顆粒樣品5陰性對照樣品Fig 2 TLC diagram of Fritillaria in Qingfei Granules1 Fritillaria reference medicinal material2-4Three batches of Qingfei Granule samples 5 Negative control sample

2.1.3 桔梗薄層色譜鑒別

供試品溶液制備：取研細(xì)的清肺顆粒15 g研細(xì)，加入9 mL鹽酸和90 mL水，加熱回流提取1 h，待冷卻后，濾過，用30 mL乙酸乙酯提取濾液3次，合并提取液，將無水硫酸鈉均勻鋪置濾紙上，濾過，蒸干，1 mL甲醇溶解殘余物質(zhì)。

對照藥材溶液制備：取15 g桔梗對照藥材，制備方法同上。

陰性對照溶液制備：取未加桔梗的樣品顆粒劑15 g，制備方法同上。測定方法：用毛細(xì)管吸取上述溶液各1 μL，分別點樣于同一塊硅膠G薄板上，展開劑石油醚-乙酸乙酯(7∶4)展開后，取出，晾干，均勻噴10%硫酸乙醇溶液顯色劑，105 ℃條件下加熱，至斑點顯色清晰[13]。供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，出現(xiàn)相同顏色的斑點，陰性無干擾，結(jié)果見圖3。

圖3 清肺顆粒中桔梗TLC圖1 桔梗對照藥材2-4三批清肺顆粒樣品5陰性對照樣品Fig 3 TLC diagram of Radix Platycodi in Qingfei Granules1 Radix platycodi reference medicinal material2-4Three batches of Qingfei Granule samples 5 Negative control sample

2.1.4 甘草薄層色譜鑒別 供試品溶液制備：稱取清肺顆粒15 g研細(xì)，加入40 mL水，超聲30 min，過夜，靜置分層。取上清液濾過，加2次20 mL正丁醇，取沉淀，加10 mL水洗滌。取正丁醇層溶液水浴蒸干，加1 mL甲醇溶解[14]。

對照藥材溶液制備：取15 g甘草對照藥材，制備方法同上。

陰性對照溶液制備：取未加甘草的樣品顆粒劑15 g，制備方法同上。

測定方法：毛細(xì)管吸取上述溶液各1 μL，點樣于同一塊硅膠G薄板上，展開劑選擇正丁醇-冰醋酸-水(配比4∶1∶2)，待展開后，取出后晾干，均勻噴灑10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，105 ℃加熱至斑點顯現(xiàn)清晰[15]。供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，出現(xiàn)相同顏色的斑點，陰性無干擾，結(jié)果見圖4。

圖4 清肺顆粒中甘草TLC圖1 甘草對照藥材2-4三批清肺顆粒樣品5陰性對照樣品Fig 4 TLC diagram of Radix et Rhizoma Glycyrrhizae in Qingfei Granule1 Liquorice reference medicinal materia2-4Three batches of Qingfei Granule samples 5 Negative control sample

2.2 清肺顆粒中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷含量測定

2.2.1 溶液的制備 對照品溶液制備：精密稱取槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷對照品，加入70%甲醇制成20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液[2]。供試品溶液制備：取清肺顆粒15 g研細(xì)，用石油醚(60～90 ℃)脫脂，加入50 mL70%甲醇溶液，超聲30 min，10 000 r/min離心6 min，留清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得[16]。

2.2.2 色譜條件 色譜柱選用InertSustain C18，流動相選擇乙腈-0.1%醋酸溶液(11∶89)，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL[17]。

2.2.3 線性范圍考察 精密移取70%甲醇定容對照標(biāo)準(zhǔn)品，制成1 mL含對照品2.5 μg、5 μg、10 μg、20 μg、40 μg的溶液，在上述色譜條件下測定峰面積[18]。以槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷對照品濃度為坐標(biāo)軸(X)，色譜峰面積為坐標(biāo)軸(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出方程y=999.8x+115(R2=0.9998)，結(jié)果表明，槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷含量在1～12.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖5和6。

圖5 槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 5 Standard curve line of Quercetin 3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentiobioside

圖6 槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.6 Quercetin 3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentiobioside Standard liquid chromatogram

2.2.4 精密度實驗 精密量取濃度為40 μg/mL的對照標(biāo)準(zhǔn)品溶液，上樣量為10 μL，連續(xù)上樣6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)[19]。計算對照品峰面積的RSD(n=6)為0.83%，結(jié)果表明，建立測定方法的精密度良好，可以滿足測定需求。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，在上述色譜條件下，間隔2 h分別進(jìn)樣，共測定12個時間點，測定峰面積，計算RSD值。在24 h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測定，槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷含量RSD為0.85%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取同一批供試品溶液，連續(xù)制備6份，在上述色譜條件下，測定槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷平均含量，計算RSD值[10]。重復(fù)測定的槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷平均含量為27.14 mg/L，RSD為0.92%，表明測定方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取己測知槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷含量的清肺顆粒5 g，共6份，分別精密加入對應(yīng)含量的槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷對照品，按2.2.1處理方法，2.2.2色譜條件下進(jìn)行含量測定，計算加樣回收率及RSD[20]。加樣回收率結(jié)果見表1，RSD=0.44%(n=6)，平均回收率為98.6%符合要求，表明方法的準(zhǔn)確性良好。

表1 槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷加樣回收率試驗結(jié)果Tab 1 Sample recovery test result of Quercetin 3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentiobioside

2.2.8含量測定 經(jīng)測定6批清肺顆粒中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷的平均含量見表2，方法按2.2.1項下操作進(jìn)行含量測定HPLC分析，實驗結(jié)果說明不同批號的清肺顆粒中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷的含量穩(wěn)定。

表2 槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷含量測定Tab 2 Content determination of Quercetin 3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentiobiosid

3 討論與結(jié)論

清肺顆粒當(dāng)前在臨床中具有應(yīng)用廣泛，多用于治療哮喘、腹腔積水、肺水腫和由心臟疾患引起的心力衰竭等，且療效顯著?！吨袊F藥典》2020版收載的清肺顆粒，僅對其進(jìn)行TLC鑒別，未對其主要藥效活性含量進(jìn)行測定[21]；在甘草TLC鑒別中采用乙醚回流提取，乙醚揮發(fā)性強(qiáng)具有危險性且購買較難，本試驗選擇在鑒別甘草時改用正丁醇進(jìn)行回流提取，供試色譜斑點清晰無陰性對照干擾[13]；在桔梗TLC鑒別時展開劑選用石油醚-乙酸乙酯(7∶4)代替三氯甲烷-乙醚(1∶1)，特征斑點圓整清晰，分離效果較好。

清肺顆粒中南葶藶子為君藥，在哮喘呼吸道炎癥介質(zhì)-血小板激活因子藥理篩選試驗中發(fā)現(xiàn)，槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷是從南葶藶子中分離出特有的黃酮苷，專屬性好，含量較高，穩(wěn)定性強(qiáng)，且僅存在南葶藶子中[22-23]。因此本試驗確定槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷含量作為控制清肺顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制指標(biāo)。本研究還考察了乙腈-0.1%磷酸水(15∶85)流動相與乙腈-0.1%醋酸溶液(11∶89)兩種流動相不同比例進(jìn)行考察，結(jié)果顯示乙腈-0.1%醋酸溶液(11∶89)作為流動相分離效果更好，確定為本試驗流動相[24]。根據(jù)《中國獸藥典》2020版葶藶子中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷以測定含量不得少于0,080 mg。6組不同批次的清肺顆粒中南葶藶子中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷的平均含量為0.1012 mg/g，與利順欣等采用HPLC法測定南葶藶子中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷平均含量為0.1070 ng/g[25]，姜艷在等HPLC法測定南葶藶子中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷平均含量為0.0946%的結(jié)果保持一致[24]。綜上所述，所建立的清肺顆粒質(zhì)量控制專屬性強(qiáng)，操作方便，具有較強(qiáng)的專屬性和精密性，能夠準(zhǔn)確反映顆粒劑質(zhì)量，為控制清肺顆粒質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

一般鑒別藥味采用TLC鑒別，應(yīng)先選擇君臣藥、貴重藥、毒性藥，鑒別藥味數(shù)占總藥味的30%以上，處方中對高效液相色譜成分含量測定方法的可不進(jìn)行鑒別[24]。對TLC鑒別條件展開劑、點樣量、預(yù)飽和時間進(jìn)行改進(jìn)能使展開效果佳[25]。綜上所述，建議《中國獸藥典》2020版清肺顆粒作為常見臨床應(yīng)用的獸藥，療效顯著，但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對落后，建議完善清肺顆粒鑒別項與含量測定項可準(zhǔn)確反映顆粒劑質(zhì)量，為控制產(chǎn)品質(zhì)量提供技術(shù)支持。