重樓皂苷通過(guò)p53/SLC7A11信號(hào)軸促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制研究

李昕，栗東海*，高小明，山院飛，薛江

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；3天津市第一中心醫(yī)院普通外科，天津 300110；4內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000

三陰性乳腺癌是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2均無(wú)表達(dá)的乳腺癌類型，主要特征為侵襲性強(qiáng)、惡性程度高及預(yù)后差[1-2]，患者生存率極低，因此深入研究其發(fā)病機(jī)制并尋找安全有效的治療藥物至關(guān)重要。從傳統(tǒng)中藥重樓中分離提取的重樓皂苷具有抗炎、抗氧化及鎮(zhèn)痛等多種藥理學(xué)作用[3]，其在抗腫瘤方面的作用也受到了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷在肝癌、胰腺癌和胃癌等惡性腫瘤中可發(fā)揮抑癌作用[4-6]。鐵死亡是一種具有鐵依賴性的程序性細(xì)胞死亡方式[7]，主要由細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧過(guò)度累積引起，不同于細(xì)胞凋亡和壞死[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷可誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞鐵死亡，從而發(fā)揮抗乳腺癌的作用，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，p53/溶質(zhì)運(yùn)載蛋白7家族成員11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)信號(hào)軸在鐵死亡過(guò)程中起著重要作用，二陳湯合桃紅四物湯可調(diào)節(jié)p53/SLC7A11信號(hào)軸介導(dǎo)氧化損傷及細(xì)胞鐵死亡，從而改善動(dòng)脈粥樣硬化[10]。目前，重樓皂苷調(diào)節(jié)p53/SLC7A11信號(hào)軸介導(dǎo)鐵死亡的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究探討了重樓皂苷調(diào)節(jié)p53/SLC7A11信號(hào)軸對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞鐵死亡的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 重樓皂苷購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；PCR試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(divalent metal transporter 1，DMT1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1，TFR1)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4) PCR引物購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗人SLC7A11、p53、DMT1、TFR1、GPX4抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。電泳儀、熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代1次。

1.3 CCK-8法檢測(cè)不同濃度重樓皂苷對(duì)細(xì)胞活性的影響 傳至第4代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h后，用含終濃度為0、10、20、30、40、50 μmol/L重樓皂苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)，另設(shè)不加細(xì)胞僅有培養(yǎng)基的空白孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12 h后，每孔加入CCK-8工作液10 μl，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A450-空白孔A450)/(對(duì)照組A450-空白孔A450)×100%。選擇細(xì)胞存活率接近50%的重樓皂苷濃度(30 μmol/L)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 重樓皂苷對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后，分為對(duì)照組、重樓皂苷組、抑制劑組與重樓皂苷+抑制劑組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。重樓皂苷組細(xì)胞用含30 μmol/L重樓皂苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；抑制劑組用含2 μmol/L鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；重樓皂苷+抑制劑組細(xì)胞用含2 μmol/L Ferrostatin-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，棄去舊培養(yǎng)基，更換為含30 μmol/L重樓皂苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h；對(duì)照組細(xì)胞僅更換新的培養(yǎng)基，不進(jìn)行藥物處理。按照1.3的方法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后，按照1.4方法分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。不同藥物處理12 h后，3000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，PBS清洗2次，離心，加入500 μl 結(jié)合緩沖液，混勻后，加入PI和Annexin-FITC各5 μl，室溫避光孵育15 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)DMT1、TFR1、GPX4、p53、SLC7A11mRNA相對(duì)表達(dá)量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDAMB-231細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后，按照1.4方法分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。不同藥物處理12 h后，3000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，PBS清洗2次，加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20 μl：SYBR 10 μl，cDNA 1 μl，上下游引物各1 μl，無(wú)核酶水7 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算DMT1、TFR1、GPX4、p53、SLC7A11mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR

1.7 Western blotting檢測(cè)p53、SLC7A11、DMT1、TFR1、GPX4蛋白相對(duì)表達(dá)量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后，按照1.4方法分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。不同藥物處理12 h后，3000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，PBS清洗2次，加入RIPA裂解液裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)；取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取20 μl上樣行SDS-PAGE凝膠電泳，120 V電泳1.5 h，電泳結(jié)束后0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h，TBST洗膜，室溫封閉1 h；加入p53、SLC7A11、DMT1、TFR1、GPX4和GAPDH一抗(1:1000)4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗(1:5000)室溫孵育1 h；TBST洗膜，ECL法顯色，采用Image J軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度重樓皂苷對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活性的影響 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞存活率隨重樓皂苷濃度的增加而降低，且呈劑量依賴性(P＆lt;0.05，圖1)，選擇細(xì)胞存活率接近50%的重樓皂苷濃度(30 μmol/L)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度重樓皂苷對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活性的影響(n=3)Fig.1 Effects of different concentrations of parissaponin on breast cancer MDA-MB-231 cell viability (n=3)

2.2 重樓皂苷對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞存活率和凋亡率的影響 CCK-8法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，重樓皂苷組細(xì)胞存活率降低、凋亡率升高(P＆lt;0.05)，抑制劑組細(xì)胞凋亡率降低(P＆lt;0.05)；與重樓皂苷組比較，重樓皂苷+抑制劑組細(xì)胞存活率升高、凋亡率降低(P＆lt;0.05)；與抑制劑組比較，重樓皂苷+抑制劑組細(xì)胞存活率降低、凋亡率升高(P＆lt;0.05)；抑制劑組與對(duì)照組細(xì)胞存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05)(圖2、表2)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Cell apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells in each group detected by flow cytometry

表2 各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞存活率和凋亡率比較(%, ±s, n=3)Tab.2 Comparison of survival rate and apoptosis rate of breast cancer MDA-MB-231 cells in each group (%, ±s, n=3)

表2 各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞存活率和凋亡率比較(%, ±s, n=3)Tab.2 Comparison of survival rate and apoptosis rate of breast cancer MDA-MB-231 cells in each group (%, ±s, n=3)

與對(duì)照組比較，(1)P＆lt;0.05；與重樓皂苷組比較，(2)P＆lt;0.05；與抑制劑組比較，(3)P＆lt;0.05

組別 細(xì)胞存活率 細(xì)胞凋亡率對(duì)照組 99.60±4.62 3.34±1.05重樓皂苷組 75.40±3.94(1) 18.64±1.33(1)抑制劑組 99.27±4.16 2.23±0.08(1)重樓皂苷+抑制劑組 85.06±5.25(2)(3) 13.50±1.42(2)(3)F 20.336 155.545 P＆lt;0.001 ＆lt;0.001

2.3 重樓皂苷對(duì)各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞DMT1、TFR1、GPX4、p53、SLC7A11mRNA和蛋白表達(dá)的影響 qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，重樓皂苷組DMT1、TFR1、p53mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，GPX4、SLC7A11mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，抑制劑組DMT1、TFR1和p53mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，GPX4、SLC7A11mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P＆lt;0.05)；與重樓皂苷組比較，重樓皂苷+抑制劑組DMT1、TFR1、p53mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，GPX4、SLC7A11mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P＆lt;0.05)；與抑制劑組比較，重樓皂苷+抑制劑組DMT1、TFR1、p53mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，GPX4、SLC7A11mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P＆lt;0.05)(圖3)。

圖3 各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞DMT1、TFR1、GPX4、p53、SLC7A11 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量(n=3)Fig.3 The relative expression levels of DMT1, TFR1, GPX4, p53 and SLC7A11 mRNA and protein of breast cancer MDA-MB-231 cells in each group (n=3)

3 討 論

三陰性乳腺癌是乳腺癌的一種亞型，由于缺乏特異性治療靶點(diǎn)，其治療效果及預(yù)后均不理想。此外，三陰性乳腺癌發(fā)病年齡偏年輕，侵襲性高，易轉(zhuǎn)移且復(fù)發(fā)率高，生存期短[11]。因此，尋找三陰性乳腺癌的有效治療靶點(diǎn)刻不容緩。

重樓為百合科重樓屬植物的干燥根莖，味苦，性微寒，具有清熱解毒、消腫止痛等功效。近年來(lái)重樓皂苷在抗腫瘤方面的作用受到了關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷可通過(guò)抑制細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控因子，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[12]。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。上述研究結(jié)果提示重樓皂苷在多種惡性腫瘤中具有抑制作用。本研究采用不同濃度重樓皂苷處理乳腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，隨著重樓皂苷濃度的升高，細(xì)胞存活率降低，表明重樓皂苷具有抑制三陰性乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧是由含F(xiàn)e2+的酶催化生成的，機(jī)體通過(guò)抗氧化系統(tǒng)清除過(guò)多產(chǎn)生的活性氧，從而達(dá)到平衡狀態(tài)，一旦這種平衡被打破，脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致過(guò)多活性氧累積則引起鐵死亡。鐵死亡是癌細(xì)胞死亡的重要途徑之一。Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，circRHOT1通過(guò)miR-106a-5p/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)軸減弱鐵死亡，從而促進(jìn)乳腺癌的惡性進(jìn)展。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡誘導(dǎo)劑可通過(guò)上調(diào)盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體酪氨酸激酶2(discoidin domain receptor tyrosine kinase 2，DDR2)在復(fù)發(fā)性乳腺癌中的表達(dá)，阻礙惡性腫瘤的進(jìn)展[15]。Hou等[16]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過(guò)miR-324/GPX4軸促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞鐵死亡，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤(rùn)。本研究探討了重樓皂苷是否能通過(guò)調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌細(xì)胞的鐵死亡而發(fā)揮抗癌作用，結(jié)果顯示，與重樓皂苷組比較，重樓皂苷+抑制劑組細(xì)胞存活率升高、凋亡率降低，與抑制劑組比較，重樓皂苷+抑制劑組細(xì)胞存活率降低、凋亡率升高，表明重樓皂苷可拮抗鐵死亡抑制劑的作用，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。鐵代謝通路相關(guān)因子被認(rèn)為是調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵因子。TFR1是一種糖蛋白受體，是位于細(xì)胞膜上調(diào)節(jié)鐵離子穩(wěn)定的重要因子，F(xiàn)e3+通過(guò)TFR1進(jìn)入細(xì)胞，能夠被氧化亞鐵還原酶(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate，STEAP3)還原成Fe2+，然后通過(guò)DMT1介導(dǎo)釋放至細(xì)胞質(zhì)中，TFR1是鐵死亡的標(biāo)志性基因[17-18]。Song等[19]研究發(fā)現(xiàn)，DMT1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡，下調(diào)DMT1可明顯抑制鐵死亡。GPX4可將有毒性的脂質(zhì)過(guò)氧化物轉(zhuǎn)為無(wú)毒性的脂醇，其表達(dá)降低可導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化生成過(guò)多的活性氧，從而引起鐵死亡[20]。本研究結(jié)果顯示，與抑制劑組比較，重樓皂苷+抑制劑組DMT1和TFR1mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，而GPX4mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，表明重樓皂苷可誘導(dǎo)鐵死亡。

胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(system Xc-)是胞內(nèi)非常重要的抗氧化分子，由12次跨膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A11和單次跨膜調(diào)節(jié)蛋白SLC3A2組成，是鐵死亡過(guò)程中重要的上游節(jié)點(diǎn)分子，在維持胱氨酸攝取及谷氨酸排出方面發(fā)揮關(guān)鍵作用；SLC7A11主要將胱氨酸由細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)還原成半胱氨酸，從而參與谷胱甘肽的合成[21]，而谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑，因此SLC7A11可通過(guò)介導(dǎo)胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)谷胱甘肽合成，從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物積累，阻礙鐵死亡程序的啟動(dòng)[22]。p53是一種抑癌因子，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)抑制SLC7A11誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡[23]。本研究結(jié)果顯示，與重樓皂苷組比較，重樓皂苷+抑制劑組p53mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，SLC7A11mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，與抑制劑組比較，重樓皂苷+抑制劑組p53mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，SLC7A11mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，表明重樓皂苷可促進(jìn)p53的表達(dá)，抑制SLC7A11的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡。具體機(jī)制見(jiàn)圖4。

圖4 MDA-MB-231細(xì)胞中p53/LC7A11信號(hào)軸介導(dǎo)的鐵死亡過(guò)程Fig.4 Iron death mediated by p53/LC7A11 signaling axis in MDA-MB-231 cells

綜上所述，重樓皂苷可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與促進(jìn)p53、抑制SLC7A11的表達(dá)，從而使細(xì)胞發(fā)生鐵死亡有關(guān)，這為臨床治療三陰性乳腺癌提供了理論依據(jù)。但本研存在以下不足：細(xì)胞凋亡受多種因素的影響，除與鐵死亡有關(guān)外，重樓皂苷誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞增殖是否與氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞周期及細(xì)胞自噬等生理學(xué)過(guò)程相關(guān)，未來(lái)仍需通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)或阻斷細(xì)胞自噬過(guò)程進(jìn)一步探討；此外，本研究?jī)H在三陰性乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞中進(jìn)行研究和探討，未探討重樓皂苷在其他類型乳腺癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制，未來(lái)仍需深入探討。